金燊懿，許玲

白頭翁湯對人肺腺癌細胞增殖及周期調(diào)控的影響

金燊懿1，2，許玲1，3

1.上海中醫(yī)藥大學，上海 200120；2.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海 200120；3.上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200080

觀察白頭翁湯對人肺腺癌細胞增殖及周期阻滯、促凋亡的影響，初步探討其抗癌作用機制。以人肺腺癌細胞株A549、H1975細胞為研究對象，不同濃度白頭翁湯干預后，運用CCK8法檢測A549、H1975細胞增殖，細胞克隆形成實驗觀察A549、H1975細胞克隆形成，流式細胞術檢測A549細胞周期，Western blot檢測A549細胞周期相關蛋白CDK1、CyclinB1和細胞凋亡相關蛋白Caspase 8、9、3及PARP、Bcl2的表達。與對照組比較，不同濃度白頭翁湯均能抑制A549、H1975細胞增殖和細胞克隆形成，不同濃度白頭翁湯G2/M期細胞比例明顯增加，且將A549肺腺癌細胞周期阻滯在G2/M期，0.2 mg/mL白頭翁湯均明顯降低CDK1、CyclinB1和Caspase 8、9、3及PARP、Bcl2蛋白的表達。白頭翁湯有促進人肺腺癌細胞凋亡的作用，其機制可能與其降低細胞周期和細胞凋亡相關蛋白的表達有關。

肺腺癌；白頭翁湯；細胞增殖；細胞周期；細胞凋亡

肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率均位居前2位的惡性腫瘤，嚴重危害人類的健康[1]。腺癌是非小細胞肺癌常見的病理類型之一[2]。手術是根治早期肺腺癌的首選手段[3]。隨著對肺腺癌發(fā)病機制深入研究，逐漸形成了以化療、放療、分子靶向治療、免疫治療等綜合手段有效提高肺腺癌患者生存率、改善患者臨床癥狀的治療方案[4]。而上述治療手段所涉及的抗癌理論中，調(diào)控細胞周期是一種經(jīng)典的抗癌途徑[5]。腫瘤是一類細胞周期失常疾病，因此，阻滯腫瘤細胞周期成為腫瘤治療的重要策略之一。

白頭翁湯出自《傷寒雜病論》，由白頭翁、黃柏、黃連和秦皮4味藥物組成，主要功效為清熱解毒、止痢涼血。臨床主要用于治療痢疾和消化系統(tǒng)腫瘤等[6-10]。而少有將本方用于治療呼吸系統(tǒng)腫瘤，同時對白頭翁湯內(nèi)在的抗腫瘤機制研究較少，這無疑限制了白頭翁湯臨床上的擴展運用。本實驗在前期文獻研究的基礎上，以體外細胞培養(yǎng)形式，運用CCK8法、細胞克隆形成實驗、流式細胞術及Western blot方法，觀察白頭翁湯對肺腺癌細胞增殖及周期的影響，初步探討其抗癌的作用機制。

1 實驗材料

1.1 細胞

人非小細胞肺腺癌細胞株A549、H1975，購自美國模式培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），編號分別為CRM-CCL-185TM、CRM-5908TM。

1.2 主要試劑與儀器

DMSO（Sigma公司，批號#RNBD4071），RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司，批號#1967410），胎牛血清（Gibco公司，批號#42F9683K），CCK8（上海生工有限公司，批號#EC07FC0251），結(jié)晶紫（Sigma公司，批號#MKCG7859），臺盼藍（索萊寶公司，批號#71752241），4%多聚甲醛（塞維爾公司，批號#G1101），細胞周期試劑盒（BD公司，批號#8012947），BCA蛋白定量試劑盒（Bio-Rad公司，批號#RH237552），RIPA裂解液（Intech公司，批號#INW2102），二抗HRP（Biotech公司，批號#123795），一抗CDK1、CyclinB1（CST公司，批號#9116、#12231）。MCO-18AIC CO2細胞培養(yǎng)箱（Sanyo公司），多功能酶標儀（Thermo公司），流式細胞儀（BD公司），17R低速冷凍離心機（Thermo公司），顯微鏡（OLYMPUS公司），電泳儀（Bio-Rad公司）。

1.3 藥物及制備

白頭翁湯（白頭翁15 g，黃柏12 g，黃連6 g，秦皮12 g），顆粒劑購自四川新綠藥有限公司，顆粒劑與飲片比例為1∶15.063。將顆粒劑用研缽研成粉末狀，稱取400 mg顆粒劑粉末，加入1 mL DMSO溶解，振蕩30 min，放置在超聲機內(nèi)，水浴超聲1 h至顆粒劑粉末完全溶解，配制成濃度為400 mg/mL母液，置于4 ℃冰箱保存。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將細胞置于含10%胎牛血清和1%雙抗RPMI培養(yǎng)基，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.25%胰蛋白酶消化并收集細胞，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

2.2 細胞增殖檢測

取處于對數(shù)生長期A549、H1975細胞，制成細胞懸液，用培養(yǎng)基將細胞密度調(diào)整為2×104個/mL，將細胞以3000個/孔，每孔100 μL接種于96孔板中，放入培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后分別加入濃度為0、0.01、0.1、0.5、1 mg/mL白頭翁湯。各濃度均設置6個復孔。放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，避光，每孔加入10 μL CCK8試劑，用錫紙包裹96孔板，置于培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，于波長450 nm處測定吸光度（OD值）。計算細胞存活率[實驗組OD值÷對照組OD值×100%]，采用GraphPad Prime7軟件計算白頭翁湯半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.3 細胞克隆形成實驗

取對數(shù)生長期A549、H1975細胞，消化后制成細胞懸液，以10 000個/孔細胞數(shù)接種于小細胞培養(yǎng)皿中，8 mL/孔，每組設3復孔，用含10%FBS的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。加藥組按IC50值0.04 mg/mL設置藥物濃度，分別為0.02 mg/mL和0.04 mg/mL。培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)6 d，吸去上清液，加入PBS清洗2次，4%多聚甲醛室溫固定細胞1 h，吸去固定液，加入0.5%結(jié)晶紫染液1 mL/孔，染色30 min，吸去染液，洗凈培養(yǎng)皿，晾干后對克隆進行計數(shù)。

2.4 流式細胞術檢測A549細胞周期

將對數(shù)生長期A549細胞以1×105個/孔接種于6孔板，給藥組加0.01、0.04、0.08、0.10 mg/mL白頭翁湯，對照組加與最高濃度等體積DMSO，干預48 h，細胞消化離心，去掉上清液，收集細胞團塊，PBS重新沉懸細胞，離心，清洗1次，彈擊流式上樣管底部，使細胞沉淀分散，先加入300 μL、4 ℃預冷PBS，再將上樣管置于渦旋振蕩器上，振蕩上樣管，加700 μL、4 ℃預冷的純乙醇沉懸，4 ℃固定過夜。次日離心棄去上清液，PBS洗1次，加500 μL PI染液，室溫避光孵育15 min，上流式細胞儀檢測，用Flowjo軟件分析細胞周期時相分布。

2.5 Western blot檢測細胞周期和凋亡相關蛋白表達

0.2 mg/mL白頭翁湯分別干預A549細胞16、32、48 h，依次收取蛋白，按BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度，取50 μg/孔蛋白樣品進行10%SDS-PAGE分離，用濕轉(zhuǎn)法（30 V，16～20 h）將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，2%脫脂奶粉室溫搖床封閉2 h，TBST洗膜3次，分別加入GAPDH，CDK1，CyclinB1，Caspase 8、9、3，PARP，Bcl2一抗（1∶1000），4 ℃孵育過夜。用TBST洗膜3次，加入二抗（1∶10 000），室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，加入ECL，用化學發(fā)光凝膠成像儀檢測，使用Image J軟件對蛋白條帶進行光密度分析。

3 統(tǒng)計學方法

4 結(jié)果

4.1 白頭翁湯對A549、H1975細胞增殖的影響

與對照組比較，白頭翁湯各濃度組均可明顯抑制A549、H1975細胞增殖，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05），并呈濃度依賴性。A549、H1975細胞IC50分別為0.04、0.07 mg/mL。結(jié)果見圖1、表1。

4.2 白頭翁湯對A549、H1975細胞克隆形成的影響

與對照組比較，白頭翁湯中、低劑量組均能顯著抑制A459、H1975細胞克隆形成，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.001）。結(jié)果見表2。

圖1 白頭翁湯干預48 h對A549、H1975細胞增殖的影響

表1 各組A549、H1975細胞增殖水平比較（±s，OD值）

注：與對照組比較，*＜0.05，***＜0.001

表2 各組A549、H1975細胞克隆形成比較（±s，個）

注：與對照組比較，***＜0.001

4.3 白頭翁湯對A549細胞周期的影響

與對照組比較，白頭翁湯中、高劑量組均將A549細胞阻滯在G2/M期，細胞比例分別為（39.2±3.9）%、（66.7±2.5）%（＜0.05）。結(jié)果見圖2、表3。

圖2 白頭翁湯干預后A459細胞周期流式細胞圖

表3 各組A549細胞不同細胞周期細胞比例比較（±s，%）

注：與對照組比較，*＜0.05

4.4 白頭翁湯對細胞周期和凋亡相關蛋白表達的影響

與對照組比較，白頭翁湯干預16 h時可提高CyclinB1蛋白的表達，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05），而32、48 h時間段均可降低蛋白的表達，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05）；并在16、32、48 h均可降低CDK1蛋白表達，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05），同時降低凋亡相關蛋白Caspase 8、9、3及PARP、Bcl2的表達，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05）。結(jié)果見圖3。

圖3 白頭翁湯干預后A549細胞各凋亡、周期相關蛋白免疫印跡圖

5 討論

《靈樞?本輸》“肺合大腸，大腸者，傳道之府”，《靈樞?九針論》“手陽明太陰為表里”，《素問?五臟生成篇》“咳嗽上氣，厥在胸中，過在手陽明、太陰”，《素問?咳論篇》云：“肺咳不已，則大腸受之，大腸咳狀，咳而遺矢?！笨梢?，古代醫(yī)家早已了解到兩者的關聯(lián)，并將肺與腸道的關系總結(jié)為“肺與大腸相表里”，認為肺與腸道之間存在生理病理上的聯(lián)系，通過調(diào)治腸道以達治療肺部疾患的目的。

中醫(yī)學認為，濕熱毒邪是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因，而清熱解毒法是其治療的基本方法。濕邪重濁、黏滯，濕聚生痰；熱邪可煉液為痰，痰熱膠結(jié)，又阻礙氣血運行而為瘀，痰瘀互結(jié)，久之發(fā)為腫物[11]。清熱解毒法不僅具有直接抑制腫瘤增殖的作用，通過調(diào)控細胞周期相關蛋白，進而阻滯腫瘤細胞周期；也可調(diào)節(jié)凋亡相關基因如Bcl2，促進腫瘤細胞凋亡等[12-13]。

腫瘤細胞也通過對細胞外基質(zhì)的重建、血管新生、代謝的調(diào)節(jié)和免疫監(jiān)視功能的抑制等途徑在微環(huán)境中得以無限增殖[14]。細胞周期的順利進行是細胞增殖的重要條件。干擾或破壞這一過程，可達到抑制細胞增殖的目的[15]。前期CCK8細胞增殖實驗研究發(fā)現(xiàn)，白頭翁湯干預后，對肺腺癌A549細胞增殖具有較好的抑制作用。因此，本研究從細胞周期入手，進一步闡釋白頭翁湯抑制肺癌細胞增殖機理。

周期相關蛋白在調(diào)控細胞周期過程中發(fā)揮主要作用，CyclinB1和CDK1均是關鍵的G2/M期周期檢查點蛋白，這2個蛋白涉及細胞G2/M期的轉(zhuǎn)化，促進細胞進入M期，保證有絲分裂正常進行。而細胞周期檢查點蛋白調(diào)節(jié)異常是癌癥形成的關鍵標志，產(chǎn)生不受控制的細胞生長和腫瘤發(fā)生。CyclinB1蛋白可與CDK1蛋白結(jié)合形成蛋白復合物，兩者在細胞周期的早期不斷積累，于G2期達到峰值，之后在M期中期時迅速降解，細胞進入M期的后期。所以，當CyclinB1蛋白和CDK1蛋白表達降低時，可將腫瘤細胞阻滯在G2/M期，達到抑制細胞增殖的目的。

本實驗通過CCK8與細胞克隆形成實驗探討白頭翁湯對肺腺癌A549細胞增殖與克隆形成的影響，結(jié)果表明，白頭翁湯能抑制A549細胞的增殖與克隆形成。流式細胞實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白頭翁湯干預48 h后，肺腺癌A549細胞在G2/M期的細胞比例與對照組比較明顯升高；而Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，白頭翁湯干預16、32、48 h后，肺腺癌A549細胞中CDK1蛋白表達均明顯降低，表明其阻滯細胞周期的機制可能與CDK1表達下調(diào)有關；而CyclinB1蛋白表達逐漸升高，而后表達降低，說明白頭翁湯可通過調(diào)節(jié)CyclinB1、CDK1表達，使細胞大量進入G2/M期。

細胞凋亡主要與促凋亡蛋白Caspase家族和抗凋亡蛋白Bcl2家族有關。細胞凋亡是細胞死亡的主要方式之一，當細胞受到物理和化學信號刺激時，凋亡相關蛋白分子開始活化發(fā)揮促凋亡作用，Caspase家族蛋白根據(jù)功能不同可以分為啟動和效應Caspase蛋白。Caspase 8、9蛋白都是細胞凋亡的啟動者，接收到凋亡信號后，兩者會被切割活化?；罨罂杉羟行狢aspase 3蛋白，激活Caspase 3 蛋白，該蛋白被認為是Caspase線粒體依賴的細胞凋亡途徑的主要承擔者，激活觸發(fā)PARP蛋白發(fā)生切割，最終導致細胞凋亡。Bcl2蛋白是機體細胞抗凋亡的主要蛋白之一。Bcl2蛋白過表達可促進損傷的DNA修復，阻止細胞發(fā)生凋亡。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，白頭翁湯干預可降低肺癌細胞Caspase 8、9、3及PARP、Bcl2蛋白的表達，表明白頭翁湯可能通過下調(diào)這些蛋白的表達，誘導肺腺癌A549細胞凋亡。

綜上，白頭翁湯在肺腺癌領域中的研究與應用尚處于初級階段，臨床療效的評價研究目前也尚屬空白，其更深層次的抗腫瘤分子機制還未明了，這無疑限制了白頭翁湯抗肺腺癌的臨床運用。本研究初步開展白頭翁湯抗肺腺癌的基礎研究，為白頭翁湯的抗肺腺癌臨床應用提供一定的依據(jù)，也可為“肺與大腸相表里”理論提供依據(jù)。

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Effects ofDecoction on Proliferation and Cycle Regulation of Human Lung Adenocarcinoma Cells

JIN Shenyi1,2, XU Ling1,3

To explore the effects ofDecoction on proliferation, cell cycle arrest and apoptosis of human lung adenocarcinoma cells; To preliminarily explore its anti-cancer mechanism.Human lung adenocarcinoma cell lines A549 and H1975 were used as the research object. After intervention with different concentrations ofDecoction, CCK8 method was used to detect proliferation of A549 and H1975 cells. Cell clones formation experiment were used to observe the formation of A549 and H1975 cells. Cell cycle of A549 was detected by flow cytometry. The expressions of cell cycle-associated proteins CDK1, CyclinB1 and apoptosis-related proteins Caspase 8, 9, 3, PARP and Bcl2 were detected by Western blot.Compared with the control group, the proliferation and cell clone formation of A549 and H1975 cells could be inhibited by different concentrations ofDecoction; G2/M phase cell ratio significantly increased by different concentrations ofDecoction; A549 lung adenocarcinoma cell cycle was arrested in G2/M phase; 0.2 mg/mLDecoction significantly reduced the protein expressions of CDK1, CyclinB1 and Caspase 8, 9, 3, PARP, Bcl2.Decoction can promote the apoptosis of human lung adenocarcinoma cells. The mechanism may be related to reducing the expressions of cell cycle and apoptosis-related proteins.

lung adenocarcinoma cells;Decoction; cell proliferation; cell cycle; cell apoptosis

R285.5

A

1005-5304(2020)05-0048-05

10.3969/j.issn.1005-5304.201911079

國家自然科學基金（81904163）；上海市進一步加快中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展三年行動計劃[ZY（2018-2020）-CCCX-2004-09]；上海市科學技術委員會“揚帆計劃”（19YF1450000）；上海中醫(yī)藥大學研究生“創(chuàng)新能力培養(yǎng)”專項科研項目（Jx61.02.03.48）

許玲，E-mail：xulq67@aliyun.com

（2019-11-05）

（2019-11-23；編輯：華強）