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膠束萃取-濁點(diǎn)預(yù)富集-高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定山楂中9種酚酸和黃酮類化合物含量

2020-05-16 07:06胡玉周光明羅慶紅李幼林
關(guān)鍵詞:濁點(diǎn)桃苷山楂

胡玉,周光明,羅慶紅,李幼林

膠束萃取-濁點(diǎn)預(yù)富集-高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定山楂中9種酚酸和黃酮類化合物含量

胡玉,周光明,羅慶紅,李幼林

西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院發(fā)光與實(shí)時(shí)分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400715

建立以非離子表面活性劑、膠束萃取-濁點(diǎn)預(yù)富集與超聲萃取技術(shù)結(jié)合的HPLC方法,同時(shí)測(cè)定山楂中原兒茶酸、咖啡酸、牡荊素、阿魏酸、金絲桃苷、槲皮素、木犀草素、山柰酚和芹菜素的含量。以非離子表面活性劑Genapol X-080為萃取劑,加入一定量氯化鈉進(jìn)行濁點(diǎn)預(yù)富集,以萃取劑濃度、固液比、電解質(zhì)濃度、溶液pH值、超聲時(shí)間、平衡時(shí)間、離心時(shí)間為考察因素,9種成分的提取總量為考察指標(biāo),優(yōu)化膠束萃取和濁點(diǎn)預(yù)富集參數(shù)。采用Phenowenex C18色譜柱,甲醇-0.06%冰醋酸溶液為流動(dòng)相,梯度洗脫,檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm。該條件下9種成分的分離度良好,標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍良好,>0.999 0(=8)。加樣回收率分別為:原兒茶酸(99.7±1.23)%、咖啡酸(97.5±2.49)%、牡荊素(105.1±1.50)%、阿魏酸(105.5±0.76)%、金絲桃苷(100.5±2.41)%、槲皮素(102.3±1.86)%、木犀草素(107.0±1.52)%、山柰酚(97.7±1.72)%、芹菜素(99.9±2.34)%。本研究建立的方法可完成山楂中9種成分的分離和測(cè)定,縮短樣品前處理時(shí)間,簡(jiǎn)便快速,環(huán)境友好,可為山楂中黃酮和有機(jī)酸的提取提供可靠的分析方法。

膠束萃?。粷狳c(diǎn)預(yù)富集;高效液相色譜法;Genapol X-080;山楂

山楂為薔薇科植物山里紅Bge.var.N.E.Br.或山楂Bge.的干燥成熟果實(shí),具有消食健胃、行氣散瘀、化濁降脂功效[1]。山楂含有大量黃酮類化合物,如牡荊素、金絲桃苷等,是抗癌作用較強(qiáng)的成分,且山楂所含大量有機(jī)酸可幫助消化[2-3],因此,山楂被廣泛用于藥品和食品中。目前,測(cè)定山楂中黃酮和酚酸的含量通常采用HPLC[3-5]、高效薄層色譜法[6]和紅外光譜法等,樣品前處理通常采用液-液萃取法[7]、索氏萃取法[8]和固相萃取法[9-10],此類方法提取多數(shù)情況采用有機(jī)溶劑萃取法,存在有機(jī)溶劑用量大、處理時(shí)間長(zhǎng)、溫度高而易破壞有效成分、環(huán)境污染嚴(yán)重、操作繁瑣等缺點(diǎn)。因此,研究山楂中酚酸及黃酮類化合物的高效、低毒、經(jīng)濟(jì)的提取方法,對(duì)于開發(fā)中藥新品種具有重要意義。

膠束萃取-濁點(diǎn)預(yù)富集以水代替影響環(huán)境的有機(jī)溶劑作為萃取劑,通過(guò)加入少量非離子表面活性劑產(chǎn)生增溶作用和濁點(diǎn)現(xiàn)象,從而實(shí)現(xiàn)有效提取[11-12]。表面活性劑由疏水基和親水基組成,分別與水和待提取的有效成分結(jié)合,形成疏水基團(tuán)在內(nèi)、親水基團(tuán)在外的膠束,從而提高有機(jī)物在水中的溶解度[13],即表面活性劑的增溶作用。同時(shí),表面活性劑水溶液加熱到濁點(diǎn)溫度以上時(shí),溶液變渾濁,靜置一段時(shí)間后出現(xiàn)分相,當(dāng)外界條件反向變化時(shí),兩相消失,再次渾濁,稱為濁點(diǎn)現(xiàn)象[14-15]。由于無(wú)機(jī)鹽的陰陽(yáng)離子與表面活性劑競(jìng)爭(zhēng)水分子而導(dǎo)致鹽析,以及強(qiáng)化表面活性劑的水化而導(dǎo)致鹽溶,且氯化鈉的溶解度受溫度影響較小,故試驗(yàn)中加入氯化鈉可降低非離子表面活性劑的濁點(diǎn),使?jié)狳c(diǎn)萃取在較低溫度下發(fā)生。選擇表面活性劑時(shí),需考慮其對(duì)待測(cè)樣品和實(shí)際操作的影響,以及濁點(diǎn)萃取法作為預(yù)處理步驟時(shí)表面活性劑對(duì)檢測(cè)儀器的影響,如在紫外區(qū)是否有強(qiáng)的吸收而干擾樣品的測(cè)定。本試驗(yàn)采用膠束萃取技術(shù)分離目標(biāo)分析物,應(yīng)用HPLC檢測(cè)其含量[16-17],以期為藥食兩用中藥山楂的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

LC-20A高效液相色譜儀(包括SPD-20A紫外檢測(cè)器、CTO-10AS柱溫箱、2個(gè)LC-20AD泵),日本島津公司;KQ3200型超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;SZ-2自動(dòng)雙重純化水蒸餾器,上海瀘西分析儀器廠有限公司;FA2004A型分析天平,上海精天電子儀器有限公司;SHZ-D循環(huán)水式多用真空泵,重慶東悅儀器有限公司;80-1(Ⅲ)電動(dòng)離心機(jī),金壇市科析儀器有限公司。

山楂樣品購(gòu)自蒙山九品堂旗艦店,經(jīng)鑒定為薔薇科植物山楂Bge.的干燥成熟果實(shí);對(duì)照品原兒茶酸(批號(hào)Z30M6L1)、咖啡酸(批號(hào)27649)、牡荊素(批號(hào)J1212059)、阿魏酸(批號(hào)E1420043)、金絲桃苷(批號(hào)MUST-13061701)、槲皮素(批號(hào)M02118066)、木犀草素(批號(hào)36414)、山柰酚(批號(hào)A1306003)和芹菜素(批號(hào)K1404029),上海晶純實(shí)業(yè)有限公司,純度均大于98%;Genapol X-080(批號(hào)9043-30-5),蘇州亞科科技股份有限公司;甲醇(色譜純)、冰醋酸(分析純),重慶川東化工有限公司化學(xué)試劑廠;二次蒸餾水,本實(shí)驗(yàn)室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備與試驗(yàn)條件

2.1.1 對(duì)照品溶液制備

精密稱取原兒茶酸、咖啡酸、牡荊素、阿魏酸、金絲桃苷、槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素對(duì)照品,分別移至10 mL量瓶中,用甲醇溶解,稀釋并定容,搖勻,制得濃度分別為560、820、840、630、530、450、610、400、700 μg/mL的對(duì)照品溶液。

用移液管精密量取原兒茶酸、槲皮素各3 mL,金絲桃苷、山柰酚各4 mL,其余對(duì)照品溶液各1 mL于10 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,得到混合對(duì)照品溶液,置4 ℃冰箱中避光保存,有效期60 d。

2.1.2 樣品處理

①膠束萃?。簻?zhǔn)確稱量0.1 g干燥山楂樣品粉末,量取4 g/100 mL Genapol X-080水溶液10 mL,置15 mL離心管中,磁力攪拌混合均勻,放入50 ℃水浴,超聲(功率500 W,頻率60 kHz)萃取40 min,3500 r/min離心15 min,取上清液,0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾,待用[18-19]。②濁點(diǎn)預(yù)富集:將上述萃取上清液轉(zhuǎn)入10 mL離心管中,加入氯化鈉1.46 g,旋渦振蕩儀振蕩5 min,置入50 ℃恒溫水浴中平衡40 min,3500 r/min離心15 min,使兩相分離,棄去下層水相,分取上層表面活性劑富集相,用甲醇定容至2.0 mL以降低表面活性劑黏度,經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾,供HPLC分析。

2.1.3 色譜條件

色譜柱:Phenomenex C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:A為0.06%乙酸水溶液,B為甲醇;線性梯度洗脫:0~5 min,40%→65%B;5~10 min,65%→70%B;10~15 min,70%→90%B;15~20 min,90%→40%B;流速:0.8 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):290 nm;柱溫:35 ℃。

2.1.4 富集效果評(píng)價(jià)

采用富集因子(enrichment factor,EF)表征對(duì)目標(biāo)分析物的富集效果,以濁點(diǎn)預(yù)富集后的溶液濃度(C1)與預(yù)富集前的溶液濃度(C0)比值計(jì)算,即EF=C1/C0。

2.2 流動(dòng)相選擇

分別考察乙腈-水、乙醇-水、甲醇-水為流動(dòng)相體系對(duì)分離效果的影響,結(jié)果表明,以乙醇-水為流動(dòng)相時(shí)色譜峰有重疊,以乙腈-水和甲醇-水分別作為流動(dòng)相時(shí)均能分離,從經(jīng)濟(jì)和環(huán)保角度考慮[20],選擇甲醇-水為流動(dòng)相。為避免組分峰形不對(duì)稱,造成前展和拖尾現(xiàn)象,故在流動(dòng)相水中加入少量醋酸。本試驗(yàn)采取梯度洗脫,在色譜柱允許的pH值范圍內(nèi)加入不同比例乙酸于水溶液中,最后確定“2.1.3”項(xiàng)下的最佳流動(dòng)相和洗脫條件。

2.3 不同萃取劑比較

在相同的色譜條件下,分別研究100%甲醇、50%甲醇、乙醇、丙酮4種常用萃取劑與4 g/100 mL Genapol X-080對(duì)目標(biāo)分析物提取量的影響,結(jié)果表明,采用非離子表面活性劑Genapol X-080為萃取劑時(shí),獲得的目標(biāo)分析物總提取量最高。

2.4 膠束萃取-濁點(diǎn)預(yù)富集參數(shù)優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.4.1 萃取劑濃度

考察Genapol X-080用量對(duì)目標(biāo)分析物萃取效率的影響,由于表面活性劑黏度較大,取量時(shí)有誤差,將其稀釋為20 g/100 mL。萃取劑濃度分別為1、2、3、4、6、8 g/100 mL對(duì)提取量的影響見(jiàn)圖1??梢钥闯觯瑵舛葹? g/100 mL時(shí)萃取效率最高。分析原因?yàn)檩腿舛容^低時(shí)分析物難以完全進(jìn)入有機(jī)相,濃度過(guò)高則降低了有機(jī)相目標(biāo)分析物的濃度。

2.4.2 固液比及波長(zhǎng)

在波長(zhǎng)250~340 nm范圍內(nèi)檢測(cè)混合對(duì)照品和樣品,結(jié)果波長(zhǎng)<270 nm時(shí)黃酮類成分的紫外吸收弱,波長(zhǎng)>330nm時(shí)有機(jī)酸的紫外吸收弱,故選擇290 nm為檢測(cè)波長(zhǎng),9種目標(biāo)分析物均有較強(qiáng)的吸收峰。比較不同固液比對(duì)目標(biāo)分析物提取量的影響,將山楂樣品質(zhì)量固定為0.1 g,改變萃取劑溶液體積(分別為2、4、6、8、10、12 mL),結(jié)果見(jiàn)圖2??梢钥闯?,體積為2~10 mL時(shí)提取量逐漸增加,體積>10 mL時(shí)提取量基本不變,表明體積為10 mL時(shí)超聲萃取基本達(dá)到平衡,再增加樣品溶液體積會(huì)稀釋目標(biāo)成分濃度,無(wú)法提高EF[16],因此,選擇10 mL作為樣品溶液體積。

圖1 萃取劑濃度對(duì)山楂中9種成分提取量的影響

圖2 固液比對(duì)山楂中9種成分提取量的影響

2.4.3 溶液pH值

目標(biāo)分析物含有羧基和羥基,所以在水中存在的分子態(tài)和離子態(tài)隨溶液pH值的改變而改變,不同的存在狀態(tài)影響其在有機(jī)相和水相的分配系數(shù),最終影響富集效果??紤]目標(biāo)分析物的穩(wěn)定性,以純冰醋酸溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值,分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL冰醋酸,對(duì)提取量的影響見(jiàn)圖3??梢钥闯?,隨溶液酸性增強(qiáng),EF逐漸增大。選擇0.4 mL冰醋酸調(diào)節(jié)溶液pH值為5.6。

2.4.4 電解質(zhì)種類及濃度

考察3種電解質(zhì)(氯化鈉、碳酸鈉、硫酸鈉)對(duì)萃取劑富集效果的影響,結(jié)果表明,加入氯化鈉可以使樣品提取量明顯提高,因此選擇氯化鈉電解質(zhì)增強(qiáng)離子強(qiáng)度。同時(shí)考察了不同濃度(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mol/L)電解質(zhì)對(duì)目標(biāo)分析物萃取效率的影響,結(jié)果見(jiàn)圖4。當(dāng)氯化鈉濃度為2.5 mol/L時(shí),萃取效率最大,因此最終選擇電解質(zhì)濃度為2.5 mol/L。

圖3 溶液pH值對(duì)山楂中9種成分提取量的影響

圖4 電解質(zhì)濃度對(duì)山楂中9種成分提取量的影響

2.4.5 超聲時(shí)間

超聲處理可使萃取劑與樣品溶液充分接觸和混合,樣品溶液在表面活性劑作用下形成乳濁液,萃取劑與水相之間接觸面積增大,有利于目標(biāo)分析物由水相轉(zhuǎn)入萃取劑中。采用體積為10 mL的樣品溶液,超聲功率為500 W,考察不同超聲時(shí)間(10、20、30、40、50、60 min)對(duì)目標(biāo)分析物提取量的影響,結(jié)果見(jiàn)圖5??梢钥闯觯S著超聲時(shí)間延長(zhǎng),目標(biāo)分析物提取量逐漸增加,30 min后,提取量有所下降。由于超聲會(huì)產(chǎn)生熱量,超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能增加目標(biāo)分析物成分揮發(fā)程度和解離程度[21],因此選擇超聲時(shí)間為30 min。

2.4.6 平衡時(shí)間

經(jīng)過(guò)超聲的兩相溶液加入電解質(zhì)氯化鈉,在水浴中靜置一定時(shí)間,使目標(biāo)分析物從水相移至有機(jī)相中,最終達(dá)到平衡??疾炱胶鈺r(shí)間10、20、30、40、50、60 min對(duì)提取量的影響,結(jié)果見(jiàn)圖6??梢钥闯觯胶鈺r(shí)間為30 min時(shí)萃取效果最好,延長(zhǎng)時(shí)間則萃取效果不變,故選擇30 min為平衡時(shí)間。

圖5 超聲時(shí)間對(duì)山楂中9種成分提取量的影響

圖6 平衡時(shí)間對(duì)山楂中9種成分提取量的影響

2.4.7 離心時(shí)間

離心可使分散在水溶液中的萃取劑聚集,由于表面活性劑密度較大,在溶液下層,有利于萃取劑與水相的分離??疾祀x心時(shí)間為5、10、15、20、25、30 min對(duì)提取量的影響,結(jié)果見(jiàn)圖7。可以看出,離心時(shí)間為25 min時(shí)提取量最高。離心時(shí)間過(guò)短則表面活性劑未完全聚集,離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則溫度升高,表面活性劑熔化而發(fā)生損失[22],因此選擇25 min為離心時(shí)間。

圖7 離心時(shí)間對(duì)山楂中9種成分提取量的影響

2.5 膠束萃取-濁點(diǎn)預(yù)富集參數(shù)優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,選擇萃取劑濃度、固液比、溶液pH值、電解質(zhì)濃度、超聲時(shí)間、平衡時(shí)間、離心時(shí)間7個(gè)因素分別進(jìn)行2個(gè)水平試驗(yàn),采用L8(27)正交試驗(yàn),以9種活性成分的提取總量評(píng)價(jià)提取性能,進(jìn)一步優(yōu)化各參數(shù)。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及直觀分析見(jiàn)表1。從極差R可知,對(duì)提取總量影響最大的因素是萃取劑濃度和固液比,其次是溶液pH值和萃取時(shí)間,平衡時(shí)間、離心時(shí)間和電解質(zhì)濃度的影響很小,與單因素試驗(yàn)結(jié)果有一定差異,可能是多因素間相互影響所致。從直觀分析結(jié)果可知,最佳提取工藝條件為:固液比1∶100(g/mL),萃取劑濃度4 g/100 mL,超聲時(shí)間30 min,平衡時(shí)間30 min,離心時(shí)間25 min,電解質(zhì)濃度2.5 mol/L,溶液pH值5.6。

表1 山楂中9種成分提取工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與直觀分析

試驗(yàn)號(hào)萃取劑濃度/(g/100 mL)固液比/(g/mL)超聲時(shí)間/min平衡時(shí)間/min離心時(shí)間/min電解質(zhì)濃度/(mol/L)溶液pH值提取總量/(μg/0.1 g) 13 83020252.55.6265.0 23 83030303.05.2263.8 34 84020253.05.2276.9 44 84030302.55.6289.3 53104020302.55.2275.0 63104030253.05.6287.6 74103020303.05.6291.9 84103030252.55.2282.5 K11091.410951103.21108.811121111.81133.8 K21140.611371128.81123.311201120.21098.2 R 49.2 42 25.6 14.4 8 8.4 35.6

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 專屬性試驗(yàn)

取空白4 g/100 mL Genapol X-080水溶液10 mL,按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件,進(jìn)樣20 μL,色譜圖見(jiàn)圖8A;按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備混合對(duì)照品溶液,按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件,進(jìn)樣20 μL,色譜圖見(jiàn)圖8B??梢钥闯觯砻婊钚詣┧芤旱淖贤馕蘸苋?,不干擾目標(biāo)分析物的檢測(cè)。預(yù)富集前后樣品溶液色譜圖見(jiàn)圖8C、圖8D,可以看出,預(yù)富集后的溶液中活性成分含量高于預(yù)富集前。

注:A.空白Genapol X-080水溶液;B.混合對(duì)照品液;C.預(yù)富集前樣品溶液;D.預(yù)富集后樣品溶液;1.原兒茶酸;2.咖啡酸;3.牡荊素;4.阿魏酸;5.金絲桃苷;6.槲皮素;7.木犀草素;8.山柰酚;9.芹菜素

2.6.2 線性關(guān)系考察

取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液,配制成8個(gè)不同濃度梯度的混合對(duì)照品溶液,按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件,從低到高濃度分別進(jìn)樣20 μL,進(jìn)行檢測(cè)。以峰面積為縱坐標(biāo),對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo),進(jìn)行線性擬合,得到回歸方程。山楂中9種成分的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限(信噪比為3)見(jiàn)表2。根據(jù)檢出限,表明對(duì)照品在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)與峰面積成良好的線性關(guān)系,該方法有較高的靈敏度和較高的檢測(cè)范圍。

表2 9種成分線性關(guān)系考察結(jié)果

成分回歸方程線性范圍/(μg/mL)相關(guān)系數(shù)檢出限/(μg/mL) 原兒茶酸Y=-9475.1+40 749.1X0.000 119~42.00.999 60.000 036 咖啡酸Y=3596.8+64 233.7X0.000 155~20.50.999 50.000 047 牡荊素Y=-1969.1+81 915.6X0.000 112~21.00.999 00.000 034 阿魏酸Y=-10 138.6+140 039.6X0.000 257~15.80.999 50.000 078 金絲桃苷Y=-1516.9+35 341.5X0.000 099~53.00.999 00.000 030 槲皮素Y=55 322.8+61 211.4X0.000 092~33.80.999 80.000 028 木犀草素Y=17 447.2+59 535.1X0.000 221~30.50.999 70.000 067 山柰酚Y=-18 267.9+51 953.7X0.000 211~40.00.999 30.000 064 芹菜素Y=28 550.8+89 574.4X0.000 178~17.50.999 70.000 054

2.7 精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗(yàn)

移取混合對(duì)照品溶液,在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次,根據(jù)相應(yīng)對(duì)照品的峰面積,計(jì)算得到9種成分RSD為1.25%~1.34%,表明儀器精密度良好。精密稱取同一批山楂樣品粉末5份,按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液并檢測(cè),結(jié)果9種成分峰面積RSD為0.97%~1.99%,表明該方法重復(fù)性良好。移取同一樣品溶液,于0、6、12、16、20、24 h分別進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示9種成分峰面積RSD為0.98%~2.14%,表明該方法具有良好的穩(wěn)定性。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的同一批干燥山楂樣品粉末各0.1 g,每3份為一組,按低、中、高濃度分別加入相應(yīng)對(duì)照品溶液,按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,分別進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 9種成分加樣回收率試驗(yàn)

成分取樣量/g樣品含量/μg加入量/μg測(cè)得量/μg回收率/%平均回收率/%RSD /% 原兒茶酸0.1074.160134.3100.1 0.1176.275149.2 98.7 99.71.23 0.1075.380155.4100.0 咖啡酸0.1029.725 53.2 97.3 0.1131.330 58.8 95.9 97.52.49 0.1130.135 64.7 99.4 牡荊素0.1017.015 33.8105.6 0.1018.418 38.7106.4105.11.50 0.1218.220 39.5103.3 阿魏酸0.10 9.4 8 18.3105.4 0.10 9.310 20.5106.3105.50.76 0.1110.112 23.1104.7 金絲桃苷0.1174.260132.2 98.5 0.1073.872145.5 99.8100.52.41 0.1075.480160.3103.2 槲皮素0.1014.310 25.3104.1 0.1113.214 27.3100.3102.31.86 0.1013.715 29.4102.4 木犀草素0.1117.814 33.5105.2 0.1117.317 36.9107.6107.01.52 0.1016.419 38.3108.3 山柰酚0.1011.810 21.6 99.3 0.1212.112 23.1 95.9 97.71.72 0.1112.815 27.2 97.9 芹菜素0.10 1.610 11.4 97.9 0.11 1.212 13.1 99.4 99.92.34 0.10 1.315 16.7102.5

2.9 樣品含量測(cè)定

取山楂樣品粉末各0.1 g,按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備3份樣品溶液,每份溶液進(jìn)樣3次測(cè)定分析,根據(jù)線性方程計(jì)算樣品中各指標(biāo)成分含量,結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 山楂樣品中各成分含量測(cè)定(μg)

成分123平均值 原兒茶酸75.976.576.276.2 咖啡酸31.231.431.331.3 牡荊素18.018.618.618.4 阿魏酸 8.7 9.5 9.7 9.3 金絲桃苷72.774.274.573.8 槲皮素13.113.513.013.2 木犀草素17.316.817.817.3 山柰酚12.012.611.612.1 芹菜素 1.4 1.3 0.9 1.2

3 討論

本試驗(yàn)采用超聲輔助膠束萃取-濁點(diǎn)預(yù)富集法,通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了最佳提取條件:表面活性劑濃度4 g/100 mL,固液比1∶100(g/mL),超聲時(shí)間30 min,平衡時(shí)間30 min,離心時(shí)間25 min,電解質(zhì)濃度2.5 mol/L,溶液pH值5.6。其中對(duì)提取結(jié)果影響最大的是萃取劑濃度和固液比。

本試驗(yàn)通過(guò)高效液相色譜法實(shí)現(xiàn)了對(duì)山楂中9種活性成分同時(shí)分離和定量檢測(cè),在以表面活性劑作萃取劑的基礎(chǔ)上,添加濁點(diǎn)預(yù)富集步驟,可以提高有機(jī)酸和黃酮的提取量。結(jié)果表明,山楂中9種成分的含量為:原兒茶酸76.2 μg/0.1 g、咖啡酸31.3 μg/0.1 g、牡荊素18.4 μg/0.1 g、阿魏酸9.3 μg/0.1 g、金絲桃苷73.8 μg/0.1 g、槲皮素13.2 μg/0.1 g、木犀草素17.3 μg/0.1 g、山柰酚12.1 μg/0.1 g、芹菜素1.2 μg/0.1 g。加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果表明,該方法穩(wěn)定性強(qiáng),檢測(cè)限低,可為山楂和其他中藥有機(jī)酸和黃酮類化合物的提取和研究提供可靠的參考依據(jù)。

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Simultaneous Determination of Nine Phenolic Acids and Flavonoid Compounds in Crataegi Fructus by Micelle Extraction-Cloud Point Preconcentration-HPLC

HU Yu, ZHOU Guangming, LUO Qinghong, LI Youlin

To establish an HPLC method combining non-ionic surfactant with micelle extraction- cloud point preconcentration and ultrasonic extraction technology; To simultaneously determine the contents of 9 active components in Crataegi Fructus, including protocatechuic acid, caffeic acid, vitexin, ferulic acid, hyperin, quercetin, luteolin, kaempferol and apigenin.Non-ionic surfactant Genapol X-080 was used as the extraction agent, and a certain amount of sodium chloride was added to perform cloud point preconcentration. With total contents of 9 active components as index, factors such as extraction agent concentration, solid liquid volume, electrolyte concentration, pH value of solution extraction, ultrasonic time, equilibrium time and centrifugal time were investigated to optimize the parameters of micellar extraction and cloud point preconcentration. Phenowenex C18 chromatographic column was used, with methanol-volume fraction 0.06% glacial acetic acid solution as mobile phase and gradient elution, and detection wavelength was 290 nm.The separation of 9 active components was completely achieved under the condition. Calibration curves of the nine components showed good linear relationship (>0.999 0,=8). The average recovery rates were protocatechuic acid (99.7±1.23)%, caffeic acid (97.5±2.49)%, vitexin (105.1±1.50)%, and ferulic acid (105.5±0.76)%, hyperin (100.5±2.41)%, quercetin (102.3±1.86)%, luteolin (107.0±1.52)%, kaempferol (97.7±1.72)%, and apigenin (99.9±2.34)%.The method established in this research can complete the separation and determination of 9 active components in Crataegi Fructus, shortening the sample pretreatment time. The method is simple, rapid and environment friendly, which can provide a reliable analytical method of extraction of flavonoids and organic acids in Crataegi Fructus.

micelle extraction; cloud point preconcentration; HPLC; Genapol X-080; Crataegi Fructus

R284.1

A

1005-5304(2020)05-0058-07

10.3969/j.issn.1005-5304.201905375

國(guó)家自然科學(xué)基金(21675131);中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(100030-2120130993)

周光明,E-mail:gmzhou@swu.edu.cn

(2019-05-27)

(2019-06-20;編輯:陳靜)

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