周晴 謝玉秀 樊秀婷

新生血管性青光眼是繼發(fā)性青光眼的一種形式，也是重要的糖尿病視網(wǎng)膜病變，其病理特征為在虹膜和(或)前房角處有新血管形成[1-3]。研究表明，新血管形成隨后的炎性反應(yīng)是糖尿病新生血管性青光眼的特征，并可導(dǎo)致玻璃體出血或牽拉性視網(wǎng)膜脫離[4，5]。在患有糖尿病新生血管性青光眼中鑒定了各種炎性因子，如前列腺素F2(prostaglandin F2,PGF2)炎性細(xì)胞因子LTC4等。長非編碼RNA(Long noncoding RNAs，LncRNA)被認(rèn)為是長度超過200個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄物，并且在結(jié)構(gòu)上與沒有蛋白質(zhì)編碼功能的mRNA相似[6，7]。 LncRNA參與多種生物過程，如細(xì)胞凋亡，染色體印記和表觀遺傳調(diào)控。轉(zhuǎn)移相關(guān)的肺腺癌轉(zhuǎn)錄物1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)是一種lncRNA，據(jù)報(bào)道，在糖尿病視網(wǎng)膜病變的小鼠和RF/6A細(xì)胞模型以及糖尿病患者的房水和纖維血管膜中，其表達(dá)明顯上調(diào)[8]。lncRNA MALAT1還可通過活化p38MAPK，ERK和c-Jun N末端激酶(JNK)的應(yīng)激激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)激活一系列炎性反應(yīng)因子。研究發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-2，IL-6)、超敏C-反應(yīng)蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)可能由lncRNA MALAT1調(diào)控[9]。本研究擬探討lncRNA MALAT1在糖尿病新生血管性青光眼虹膜組織中的表達(dá)及意義，為糖尿病新生血管性青光眼的治療提供理論及臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016年6月至2018年11月在我院眼科確診的在糖尿病新生血管性青光眼患者92例作為病例組，所有患者散瞳后檢查眼底，做熒光素鈉眼底血管造影(術(shù)前因晶狀體混濁看不清眼底的患者，于術(shù)后 l 周進(jìn)行眼底檢查)。同期選擇本院虹膜無新生血管的慢性閉角型青光眼患者92例為對照組，對照組無糖尿病并且通過75 g口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)進(jìn)行測試。對照組、病例組組別間基礎(chǔ)資料見表1。本研究根據(jù)赫爾辛基宣言的原則進(jìn)行，并獲得本院倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn)。在解釋研究目的和程序后，所有患者簽署知情同意書。本研究排除6個(gè)月內(nèi)接受了眼部手術(shù)的患者，同時(shí)全身重大疾病患者也被排除在外。2組在性別比、年齡、吸煙、飲酒分布及BMI、收縮壓、舒張壓的水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同組別間基礎(chǔ)資料的比較 n=92

1.2 虹膜組織的獲取 病例組及對照組在行小梁切除術(shù)行虹膜根切時(shí)留取虹膜組織。立刻置于液氮保存。

1.3 儀器與試劑 MK3-3酶標(biāo)儀(美國熱電)、熒光定量PCR儀(德國耶拿分)、lncRNA MALAT1、IL-2、IL-6、hs-CRP、TNF-α Elisa試劑盒購于上海邦奕生物科技有限公司。Trizol RNA提取試劑和逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒購自美國的Invitrogen Corporation(City，State，USA)，lncRNA MALAT1 RNA定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒購自上海GenePharma有限公司。使用的TePCR熱循環(huán)儀是Roche LightCycler(Kaiseraugst，Rheinfelden，Switzerland)。

1.4 lncRNA MALAT1蛋白在病例組及對照組虹膜組織表達(dá)水平測定 通過使用1.3 lncRNA MALAT1兔多克隆抗體和抗兔辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二級抗體，在4 μm石蠟包埋的組織切片上進(jìn)行1.3 lncRNA MALAT1蛋白表達(dá)的檢測。使用3%過氧化氫溶液和蛋白質(zhì)阻斷試劑來終止蛋白質(zhì)的酶活性和非特異性結(jié)合。組織切片的抗原修復(fù)在Tris EDTA緩沖液(pH值9.0)中進(jìn)行。用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物和Mayer’s蘇木精復(fù)染物檢測陽性染色。以高放大倍數(shù)(40x)觀察500個(gè)細(xì)胞。在至少5個(gè)視野中使用半定量方法對染色的組織切片進(jìn)行評分。染色標(biāo)準(zhǔn)為0表示<5%陽性染色細(xì)胞(陰性表達(dá))，+表示5%～20%陽性染色細(xì)胞(弱表達(dá))，2+表示21%～50%陽性染色細(xì)胞(中度表達(dá))和3+為> 50%陽性染色細(xì)胞(強(qiáng)表達(dá))。

1.5 ELISA測定病例組及對照組虹膜組織 lncRNA MALAT1、IL-2、IL-6、hs-CRP、TNF-α蛋白水平 按照無菌條件操作，稱取微量虹膜組織，加入少量液氮，在研缽中迅速將虹膜組織碾碎至粉末狀；將組織粉末轉(zhuǎn)入2 ml Eppendorf管中，加入1.2 ml PBS(pH值7.4)，充分振蕩混勻，2 000 g，4℃，離心20 min。仔細(xì)收集上清液。獲取虹膜組織組織勻漿后，采用Elisa法檢測lncRNA MALAT1、IL-2、IL-6、hs-CRP、TNF-α蛋白水平。

1.6 病例組及對照組虹膜組織 lncRNA MALAT1mRNA水平的測定 qRT-PCR用于lncRNA MALAT1基因的相對mRNA表達(dá)。使用RNeasy Mini Kit(Qiagen，Germany)從所有組織樣品中分離總RNA。使用Reverse Transcription試劑盒(Applied Biosystem，USA)通過PCR擴(kuò)增通過逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA(cDNA)。使用Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystem，USA)和用于lncRNA MALAT1的特異性引物在Lightcycler 96系統(tǒng)(Roche，USA)上進(jìn)行qRT-PCR：lncRNA MALAT1正向引物5’-CTATCGAAGGGACCTAG-3’，反向引物5’-ACCTACTTCAGCAGGCCTCG-3’(產(chǎn)品規(guī)格為150 bp)。β-肌動(dòng)蛋白用作內(nèi)部對照，引物序列是：正向5’-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3’反向5’AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’(產(chǎn)物大小179 bp)。每份樣品的qRT-PCR反應(yīng)一式三份進(jìn)行。TLR4、NF-кB的qRT-PCR熱曲線為94℃：10 min、94℃：30 s、58℃：35 s、72℃：1 min；45個(gè)循環(huán)。通過相對基因定量方法(2-ΔΔCT方法)計(jì)算mRNA倍數(shù)變化。

2 結(jié)果

2.1 2組lncRNA MALAT1 蛋白表達(dá)評分比較 病例組lncRNA MALAT1蛋白表達(dá)評分高于對照組 (P<0.01)。見表2。

組別lncRNA MALAT1 對照組0.74±0.14病例組5.12±0.53t值29.369P值<0.001

2.2 2組中l(wèi)ncRNA MALAT1蛋白表達(dá)陰性率比較 病例組lncRNA MALAT1蛋白表達(dá)陽性率明顯高于對照組(P<0.01)；免疫組化法下，lncRNA MALAT1陽性表達(dá)為棕褐色，lncRNA MALAT1陽性表達(dá)情況與其蛋白表達(dá)水平符合。見表3，圖1。

2.3 2組lncRNA MALAT1 mRNA表達(dá)水平比較 病例組lncRNA MALAT1 mRNA表達(dá)水平高于對照組(P<0.01)。見表4。

表3 2組lncRNA MALAT1蛋白表達(dá)陰性率比較 n=92，例(%)

圖1 lncRNA MALAT1在對照組、病例組的表達(dá)；A 在青光眼虹膜組織中表達(dá)；B 在糖尿病新生血管性青光眼虹膜組織表達(dá)

組別lncRNA MALAT1 mRNA對照組1.01±0.21病例組3.54±0.55t值20.364P值<0.001

2.4 2組組各炎癥指標(biāo)水平比較 病例組IL-2、IL-6、hs-CRP、TNF-α水平高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表5。

項(xiàng)目對照組病例組t值P值IL-2(pg/ml)85.63±12.36263.65±48.6385.365<0.001IL-6(pg/ml)102.36±10.12329.32±36.9859.654<0.001hs-CRP(μmol/L)102.16±10.15367.12±26.1949.365<0.001TNF-α(mmol/L)25.49±1.92102.23±5.2358.219<0.001

2.5 lncRNA MALAT1蛋白表達(dá)評分、lncRNA MALAT1 mRNA與各變量的相關(guān)性分析 lncRNA MALAT1蛋白表達(dá)評分、lncRNA MALAT1 mRNA與IL-2、IL-6、hs-CRP、TNF-α呈正相關(guān)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表6。

表6 lncRNA MALAT1 蛋白表達(dá)評分、lncRNA MALAT1 mRNA與各變量的相關(guān)性分析

3 討論

哺乳動(dòng)物基因組包含數(shù)千個(gè)lncRNA基因，由于在許多生物過程和障礙中的潛在作用，它們已引起廣泛關(guān)注[10]。最近，lncRNAs在血管生物學(xué)中的作用已逐漸被認(rèn)識(shí)到。人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的RNA測序鑒定了31個(gè)未注釋的lncRNA，其中，lncRNA-SENCR被發(fā)現(xiàn)是富含血管細(xì)胞的lncRNA，其敲低導(dǎo)致心肌素和平滑肌收縮基因的表達(dá)降低[11]。lnc-Ang362是調(diào)節(jié)Ang Ⅱ的lncRNA，其水平的敲低影響了血管平滑肌細(xì)胞的增殖，提示其在Ang Ⅱ相關(guān)心血管疾病的診斷中的潛在作用[12]。lncRNA ANRIL，通過調(diào)節(jié)參與細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞外基質(zhì)重塑和炎癥反應(yīng)的基因表達(dá)，在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。而敲低lncRNA MALAT1表達(dá)水平，則提示體外增殖至遷移內(nèi)皮細(xì)胞表型的平衡，其遺傳缺失或藥理學(xué)抑制可減少血管生長[13]。最新研究表明，lncRNA MALAT1可以激活p38/MAPK信號(hào)通路并調(diào)節(jié)糖尿病青光眼新生血管的生長?？傊?，lncRNA MALAT1作為基因表達(dá)調(diào)控因子的出現(xiàn)無疑會(huì)改變我們對病理性血管生成復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)。

糖尿病新生血管性青光眼是長期糖尿病患者最常見的血管并發(fā)癥之一。視力惡化、虹膜炎癥、視網(wǎng)膜血管新生、血管通透性增加、血管細(xì)胞凋亡與其病情進(jìn)展密切相關(guān)。高血糖是糖尿病最重要的特征，在糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)展過程中對血管細(xì)胞產(chǎn)生不良影響。MALAT1最初被鑒定為lncRNA，在非小細(xì)胞肺腫瘤轉(zhuǎn)移的高風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體中顯示高表達(dá)，其表達(dá)在廣泛的腫瘤中顯著上調(diào)，如肺癌、肝癌、腎細(xì)胞癌、膀胱癌和骨肉瘤[14]。以前的研究表明，MALAT1在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移中具有積極作用[15]。研究發(fā)現(xiàn)，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，高血糖可導(dǎo)致視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞和糖尿病虹膜細(xì)胞中l(wèi)ncMALAT1水平的顯著上調(diào)，而沉默lncMALAT1的表達(dá)則可顯著減輕糖尿病誘導(dǎo)的虹膜血管形成，血管滲漏和虹膜炎癥。此外，研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，體外MALAT1的基因消除抑制了內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，遷移和管形成能力，這是內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)的典型方面[16]。本研究結(jié)果顯示，病例組lncRNA MALAT1蛋白表達(dá)評分高于對照組；病例組lncRNA MALAT1蛋白表達(dá)陽性率明顯高于對照組；病例組lncRNA MALAT1 mRNA表達(dá)水平高于對照組，這與上述討論符合，提示lncRNA MALAT1在糖尿病新生血管性青光眼虹膜組織中表達(dá)水平升高；結(jié)合上述討論，沉默lncRNA MALAT1表達(dá)有可能改善虹膜膜免于高血糖誘導(dǎo)的變性破壞，這將在后續(xù)研究中進(jìn)一步探討。

最新研究發(fā)現(xiàn)高葡萄糖應(yīng)激能激MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑， MAPK活化具有一系列生理作用[17，18]，如細(xì)胞炎性、細(xì)胞凋亡，細(xì)胞增殖，有絲分裂、多種基因轉(zhuǎn)錄；異常MAPK活性可導(dǎo)致持續(xù)的細(xì)胞增殖或?qū)ν獠看碳さ妮p微反應(yīng)。高水平的lncRNA MALAT1可顯著改變磷酸化p38 MAPK的水平，進(jìn)而磷酸化的ERK1/2或JNK1/2，激活MAPKs，導(dǎo)致其下游炎性因子過表達(dá)，本研究結(jié)果顯示，病例組IL-2、IL-6、hs-CRP、TNF-α水平高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；lncRNA MALAT1 蛋白表達(dá)評分、lncRNA MALAT1 mRNA與IL-2、IL-6、hs-CRP、TNF-α正相關(guān)關(guān)系明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與上述結(jié)論符合，同時(shí)也提示lncRNA MALAT1可誘導(dǎo)炎性反應(yīng)加劇糖尿病新生血管性青光眼的病變程度。

綜上所述，lncRNA MALAT1在糖尿病新生血管性青光眼虹膜組織中表達(dá)水平升高，其可誘導(dǎo)炎性反應(yīng)加劇糖尿病新生血管性青光眼的病變程度。