張健希

（盤錦檢驗檢測中心（盤錦市疾控中心） 遼寧盤錦 124010）

1 前言

近年來，抗生素尤其是硝基呋喃類藥物的過量使用，使雞蛋產(chǎn)品的質(zhì)量受到了威脅。硝基呋喃類藥物能對人體產(chǎn)生較大的危害，目前國家農(nóng)業(yè)部已經(jīng)明令禁止使用硝基呋喃類藥物。研究表明，硝基呋喃類藥物在動物體內(nèi)會快速分解[1]，因此，針對這種藥物代謝產(chǎn)物的測定方法已經(jīng)引起學術(shù)界的高度重視。雞蛋基質(zhì)相對復雜，目前國內(nèi)外對雞蛋中4 種硝基呋喃類代謝物的測定研究較少。本文利用三氯乙酸作為蛋白質(zhì)沉淀劑，通過加入4 種同位素內(nèi)標來提高最終定量測定的準確度，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）法測定雞蛋中4 種硝基呋喃類藥物（呋喃唑酮（AOZ）、呋喃它酮（AMOZ）、呋喃西林（SEM）、呋喃妥因（AHD））代謝物的殘留量，能夠滿足國家針對該類藥物在食品中的相關(guān)檢測要求。

2 實驗部分

2.1 主要儀器試劑標準品

液相色譜系統(tǒng)（美國沃特斯公司UPLC）；串聯(lián)質(zhì)譜（美國 SCIEX 公司 4000Q）；甲醇、三氯乙酸、乙酸乙酯、醋酸銨、磷酸氫二鉀、二甲基亞砜及鄰硝基苯甲醛等均為分析純；標準工作溶液：4 種硝基呋喃類代謝物包括 AOZ、AMOZ、SEM 及 AHD 類代謝物，（Sigma公司），用甲醇作溶劑將其配制成1 mg/mL的儲備液。使用前根據(jù)檢測需求用初始比例流動相稀釋配制成標準工作溶液，所使用的內(nèi)標分別為4 種呋喃代謝物同位素內(nèi)標，內(nèi)標溶液濃度為100 ng/mL，用甲醇作溶劑配制成濃度為50 ng/mL 的混標溶液。

2.2 樣品前處理

準確稱取2 g（精確到0.01 g）樣品于 50 mL 離心管中，加入100 μL 內(nèi)標混合液、2 mL 25%三氯乙酸溶液、4 mL 水于渦旋混合器上混勻1 min，靜止10 min 后，以5 000 r/min 的速度進行樣品離心，5 min 后取上層液體轉(zhuǎn)移至玻璃離心管中，向其中加入 150 μL 的 2-NBA 溶液，渦旋混勻 1 min 后，于37℃恒溫搖床中避光反應過夜（約16 h）。反應完成后，取出離心管并冷卻到室溫，再加入54 mL 磷酸氫二鉀緩沖液，將最終樣品稀釋調(diào)至pH=7 左右，之后加入8 mL 乙酸乙酯，渦旋混勻1 min，再以5 000 r/min的速度進行離心5 min，取上層乙酸乙酯到10 mL 試管中，在40℃水浴條件下氮吹至近干，用5 mmol/L醋酸銨溶液（含0.1%甲酸）將其復溶并定容至1 mL，過0.22 μm 濾膜后上機測定。標準系列溶液也需按樣品前處理方法進行同樣的衍生化和提取過程。

2.3 色譜條件和質(zhì)譜條件的設(shè)定

液相色譜條件：色譜柱型號為ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm×2.1 mm×100 mm），流動相 A 相為5 mmol/L 醋酸銨溶液（含 0.1%甲酸）；B 相為甲醇。梯度洗脫程序為：在0～6 min 內(nèi)，B 相由20%的溶液逐漸升高至60%的溶液；在6～8 min 內(nèi)，由60%的溶液保持；在8～9 min 內(nèi)，由60%的溶液到80%；在9～9.1 min 內(nèi)，由80%的溶液梯度濃度降低到20%的溶液；在 9.1～10.5 min 內(nèi)，20%溶液保持。在這些梯度洗脫程序中流速為0.25 mL/min，柱溫為室溫條件，進樣體積為 10 μL。

質(zhì)譜條件：在本次研究中采用電噴霧離子源的方式，以正離子反應檢測模式檢測，離子源溫度：600℃，氣簾氣：30 psi，霧化氣：60 psi，輔助氣:55 psi，4 種硝基呋喃類藥物質(zhì)譜條件詳見表1。

表1 4 種硝基呋喃類藥物質(zhì)譜條件

3 研究結(jié)果

首先，從影響測定結(jié)果的因素和目標使用情況來看，在樣品前處理過程中共存在3 種因素會影響結(jié)果測定，在實驗過程中分別對這3 個影響因素進行重點考察。

（1）衍生化反應效率。對硝基呋喃類藥物來說，其代謝物分子質(zhì)量較小，且離子化效率低，存在較少的特征離子，無法采用非衍生法檢測，而在不同的樣品中硝基呋喃類藥物代謝物其酸化效率不同，穩(wěn)定性較差。因此，在樣品前處理過程中如果樣品和標準品衍生化效率不同，將會對最終測定結(jié)果準確度和穩(wěn)定性產(chǎn)生不良影響。

（2）pH。在完成樣品的衍生化之后進行萃取，此時溶液pH 對于最終的萃取反應來說會產(chǎn)生較大影響，通過研究發(fā)現(xiàn)當pH 為7 時，上述4 種硝基呋喃類代謝物衍生產(chǎn)物的提取率是比較高的，分別為AHD 92.1%、AOZ 95.1%、SEM 91.4%、AMOZ 94.3%，而處于不同pH 條件下上述4 種硝基呋喃類代謝物衍生物的萃取效率存在顯著差異。例如，對于AHD，當pH 為8~10 時，萃取效率是最低的；對于AMOZ，當pH 為3~5 時，則無法將其從水相提到有機相中；對于pH 的敏感度，AOZ 及SEM 敏感度較低，但如果處于弱堿條件下上述2 種代謝物提取效率是比較高的。因此，在進行提取時需要找到最佳的pH 條件，才能最大程度上提取上述4 種硝基呋喃類藥物代謝物。在進行批量樣品處理過程中，由于雞蛋本身酸度存在一定差異，對每一種雞蛋pH 進行調(diào)節(jié)在萃取時會出現(xiàn)乳化的問題，影響萃取效率，對于最終的定量結(jié)果分析來說也會產(chǎn)生不利影響。不同pH 條件對萃取效率的影響詳見圖1。

圖1 不同pH 條件對萃取效率的影響

（3）光照條件的影響。硝基呋喃類代謝物其衍生產(chǎn)物對于光照具有較強的敏感度，在正常情況下需要在前處理過程中避光處理。本文經(jīng)過衍生化之后的標準溶液置于室溫，正常工作條件下定時開展研究，發(fā)現(xiàn)上述4 種硝基呋喃類代謝物衍生產(chǎn)物對于光度的敏感度不同，AHD 對光敏感度最差，在0.5~7 h之內(nèi)含量不會發(fā)生變化；AMOZ 對光敏感度最強，將其置于光照條件下，能夠在5 h 之后快速分解。因此，部分代謝物在樣品前處理時還需要做好避光處理。日常樣品前處理中無法實現(xiàn)對實驗室的完全避光，因此，暴露在光照的情況下，樣品的前處理過程會對結(jié)果的定量測定產(chǎn)生影響。針對上述結(jié)果特定的影響因素，可分別加入同位素內(nèi)標來補償定量結(jié)果偏差。

此外，在空白樣品中分別加入標準混合液，使其濃度為0.4～20 ng/mL，結(jié)合樣品前處理方法進行樣品衍生化和提取后，上機檢測，最終AHD、AOZ、SEM、AMOZ 線性相關(guān)系數(shù)分別為 0.993、0.992、0.996、0.994。雞蛋中4 種硝基呋喃類代謝物和內(nèi)標的選擇離子監(jiān)測圖詳見圖2。

圖2 雞蛋中4 種硝基呋喃類代謝物和內(nèi)標的選擇離子監(jiān)測圖

4 討論

動物組織中的蛋白和硝基呋喃類代謝物在酸性條件下會出現(xiàn)間隔作用，從而使目標提取物從蛋白中解離。研究表明，可以使用鹽酸提供酸性環(huán)境，但最終鹽酸無法將蛋白中的代謝物解離，且回收率低于5%[2]。三氯乙酸是一種良好的蛋白沉淀劑，具有較強酸性，能夠為衍生化反應提供酸性條件[3]。研究表明，選取2～4 mL 左右的三氯乙酸能夠?qū)崿F(xiàn)雞蛋中的蛋白沉淀，回收率為50%以上[4，5]，考慮成本及調(diào)節(jié)的便捷性，最終選取2 mL 25%的三氯乙酸溶液。在回收率和精密度測試過程中，選取雞蛋樣品分別加入4 種硝基呋喃類代謝物及相應內(nèi)標，其濃度為 0.5 μg/kg 和 1.0 μg/kg，每天重復測定 6 次，測定3 天，經(jīng)內(nèi)標校正之后的結(jié)果詳見表2。

表2 內(nèi)標校正結(jié)果

5 結(jié)論

本文采用LC-MS/MS 法對雞蛋中4 種硝基呋喃類代謝物進行檢測，以三氯乙酸作為蛋白沉淀劑，能夠為衍生化反應提供必要的酸性環(huán)境，同時使用4 種同位素內(nèi)標法補償樣品前處理中定量結(jié)果偏差。結(jié)果表明，該方法能夠滿足國內(nèi)當前針對雞蛋中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定。