姚運(yùn)紅，袁 煒，熊敏涵，張 葉，胡新榮

廣東醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系、腫瘤研究所，廣東 東莞 523808

真核翻譯起始因子4E（Eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E），是真核細(xì)胞翻譯起始和調(diào)控的核心成分，能夠選擇性地控制腫瘤基因的翻譯和表達(dá)。目前已經(jīng)明確在哺乳動物中eIF4E有三種不同的家族成員，包括eIF4E1、eIF4E2、eIF4E3，其在結(jié)構(gòu)標(biāo)記、功能特征及表達(dá)形式上各有不同［1］。eIF4E3是抑癌基因，eIF4E在眾多腫瘤中過量表達(dá)［2］。過量表達(dá)的eIF4E選擇性地起始c-Myc等眾多經(jīng)典癌基因的翻譯表達(dá)，從而促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化、增殖、抗凋亡、侵襲及腫瘤血管生成等［3］。本研究擬構(gòu)建并鑒定eIF4E3野生型、eIF4E3突變體C69a、w86a真核過表達(dá)質(zhì)粒，為進(jìn)一步對eIF4E3研究及為腫瘤治療尋找新的靶點(diǎn)提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株及表達(dá)載體： 大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5a、PIRES2-EGFP載體（本實(shí)驗(yàn)保存），eIF4E3野生型插入片段序列，eIF4E3C69a突變體是eIF4E3野生型在69位點(diǎn)C變?yōu)锳突變而來；eIF4E3W86a突變體是eIF4E3野生型在86位點(diǎn)W變?yōu)锳突變而來。主要試劑：EcoRI、BamHI、NheI限制性內(nèi)切酶（美國NEB公司）PCR產(chǎn)物回收試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒（日本TAKARA公司）T4 DNAligase（美國Thermo公司）Gold View I型核酸染色劑（北京Solarbio公司）高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒（北京天根公司）。

1.2 方法

1.2.1 eIF4E3基因片段、RT-PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物純化：eIF4E3、eIF4E3C69a、eIF4E3W86a質(zhì)粒載體構(gòu)建，參照公司質(zhì)粒構(gòu)建說明書。實(shí)驗(yàn)步驟如下：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（RT-PCR）擴(kuò)增獲得 cDNA樣本。RT-PCR擴(kuò)增條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存。以cDNA樣本為模板，用構(gòu)建的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得eIF4E3野生型及其突變體序列片段。eIF4E3 PCR引物上游引物序列為：primer 5'-GGCGAATTCATGGCGCTGCCCCCG-3'，下游引物序列為：primer 5'-GCGGATCCTTAGTGTTTTCCACGTC?CACCTTCA-3'，PCR反應(yīng)體系為：2×power Taq PCR Mas?ter Mix 10 μl，F(xiàn)orward Primer P1（10 μM）1 μl，Reverse Primer P1（10 μM）1 μl，cDNA Template100ng ddH2O 總量加到20 μl，反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45S，55℃退火1 min，72℃延伸5 min 40個(gè)循環(huán)，取適量產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)鑒定產(chǎn)物，鑒定結(jié)果正確，PCR產(chǎn)物剩余部分用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收并純化（試劑盒說明書），回收產(chǎn)物于-20℃保存。

1.2.2 目的片段eIF4E3及空載質(zhì)粒PIRES2-EGFP雙酶切與純化、回收：用限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI雙酶切eIF4E3基因片段及空載質(zhì)粒PIRES2-EGFP。用限制性內(nèi)切酶NheI、BamHI分別雙酶切eIF4E3C69a、eIF4E3W86a基因片段及空載質(zhì)粒PIRES2-EGFP。將eIF4E3酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收；提取的質(zhì)粒經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，找到相應(yīng)的目的條帶切膠并回收。

1.2.3 目的片段和載體質(zhì)粒的連接和轉(zhuǎn)化、提取、鑒定：使用T4 DNA Ligase產(chǎn)品將目的片段與線性載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。挑選長出的克隆并搖菌擴(kuò)增，提取質(zhì)粒進(jìn)行后續(xù)PCR及測序。PCR引物和擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同上。擴(kuò)增出的目的片段為675bp。重組質(zhì)粒雙酶切鑒定真核表達(dá)載體PIRES2-EGFP具有卡那霉素抗性，本實(shí)驗(yàn)中選取酶切位點(diǎn)分別為Eco?RI、BamHI，NheI、BamHI。根據(jù)內(nèi)切酶說明書，對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，成像儀下曝光并拍照。重組DNA測序?qū)⑻崛〉馁|(zhì)粒DNA送往華大基因生物技術(shù)有限公司測序并分析結(jié)果。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 目的基因eIF4E3擴(kuò)增結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，從擴(kuò)增圖可以看到3條大小約為675bp的條帶，與預(yù)期的野生型（eIF4E3）和突變型（C69a、W86a）基因大小一致（圖1）。

圖1 eIF4E3野生型和突變體基因PCR擴(kuò)增電泳圖

2.2 重組質(zhì)粒PIRES2-EGFP-eIF4E3、PIRES2-EGFP-C69a、PIRES2-EGFP-W86a雙酶切及鑒定結(jié)果

經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分析以后回收得到的PCR產(chǎn)物與PIRES2-EGFP空載體進(jìn)行雙酶切后，用連接酶進(jìn)行連接用含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基進(jìn)行鋪板長菌，挑取2～3個(gè)單克隆進(jìn)行擴(kuò)增并提取質(zhì)粒最后進(jìn)行雙酶切及PCR鑒定。雙酶切后可以得到大約675bp的片段（圖2），進(jìn)一步進(jìn)行菌液及其質(zhì)粒的PCR鑒定，同樣可以看出大約675bp的片段（圖3），說明eIF4E3野生型及其突變體成功插入到PIRES2-EGFP載體上。

圖2 eIF4E3野生型和突變體重組質(zhì)粒雙酶切鑒定圖

圖3 eIF4E3野生型和突變體菌液及質(zhì)粒PCR電泳圖

2.3 重組質(zhì)粒測序結(jié)果

將重組質(zhì)粒PIRES2-EGFP-eIF4E3、PIRES2-EGFP-eIF4E3C69a、PIRES2-EGFP-eIF4E3C69W86a上插入的目的基因eIF4E3、C69a、W86a片段進(jìn)行DNA測序，經(jīng)過Blast比對和分析，結(jié)果顯示eIF4E3、C69a、W86a基因正確插入到真核表達(dá)載體PIRES2-EGFP中，其與目的序列一致，測序結(jié)果（圖4）。

3 討論

圖4 eIF4E3野生型和突變體質(zhì)粒測序圖

eIF4E3是最近年新發(fā)現(xiàn)的一種潛在的抑癌基因。本實(shí)驗(yàn)中我們成功的將eIF4E3、eIF4E3C69a、eIF4E3W86a基因鏈接到真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP中。我們選用的pIRES2-EGFP真核表達(dá)載體容易進(jìn)入細(xì)胞，容量比較大，易于檢測，在臨床實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用比較廣泛。eIF4E3僅存在脊索動物中，而且研究發(fā)現(xiàn)只存在于脊索動物的睪丸、骨骼肌、心肌、脾臟和肺臟等組織中，尤其在睪丸中表達(dá)水平最高［3］。2013年Borden［4］等人的研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)eIF4E3能夠競爭結(jié)合eIF4E的靶mRNA，并且能夠阻止VEGF等因子的翻譯表達(dá)，這提示eIF4E3是對抗eIF4E的潛在抑癌基因。過表達(dá)eIF4E3可與eIF4E競爭結(jié)合eIF4E的靶mRNA，例如CyclinD1、c-Myc、VEGF等并阻止其翻譯表達(dá)。Gartenhaus［5］等人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)eIF4E3除了抑制eIF4E1的功能外，還可以自己起始n-Myc、HMGA、CDX2、Twist等的翻譯，而這些基因通常都不是eIF4E1的靶基因，這表明eIF4E3可以起始不同于eIF4E1的靶基因的翻譯。此外，在藥物、放射、缺氧、缺營養(yǎng)等條件下，eIF4E表達(dá)下降［6-8］，因此eIF4E已成為研究腫瘤靶向治療的最熱門靶點(diǎn)之一［9］。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了PIRES2-EGFP-eIF4E3野生型，PIRES2-EGFP-eIF4E3 C69a、PIRES2-EGFP-eIF4E3 w86a突變體質(zhì)粒，經(jīng)測序檢測，序列與預(yù)期相符。eIF4E3野生型，突變體 C69a、w86a的構(gòu)建為進(jìn)一步研究其在腫瘤的作用及機(jī)理，為腫瘤治療尋找新的靶點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。