李楠楠，勞元圣，高堯春，李楠，張夢雪，黎迎，劉海波，董政起*

1.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193

銀杏內(nèi)酯是銀杏葉主要成分，包括銀杏內(nèi)酯A、B、C、J和M(GKA、GKB、GKC、GKJ、GKM)等[1]，銀杏內(nèi)酯具有抗炎、抗氧化、改善腦缺血以及神經(jīng)保護作用[2]，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用[1]，拮抗血小板活性因子PAF作用[3]等。銀杏內(nèi)酯注射液主要成分有白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B和銀杏內(nèi)酯C[4]。目前，銀杏內(nèi)酯注射液使用較為廣泛，但有研究表明其存在嚴重胃絞痛或周身疼痛、過敏等不良反應(yīng)[5]?？诜苿┠軌蛟趲椭岣呋颊哌m用性的同時降低不良反應(yīng)，因此本實驗擬以銀杏內(nèi)酯A為模型藥物，建立以溶解性和滲透性為指標的系統(tǒng)、快速、準確評價藥物口服生物利用度的方法，同時分析目前市面上沒有銀杏內(nèi)酯口服劑型的原因，并為下一步開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Waters ACQUITY UPLC；電熱恒溫水浴鍋(HHS型，上海博訊實業(yè)有限公司)；旋渦振蕩器(VORTEX-5型，海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(INC108型，德國MEMMERT公司)；倒置顯微鏡(GX51型，奧林巴斯公司)；超凈臺(SCB-1220型，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；微量振蕩器(MM-1型，金壇市正基儀器有限公司)；全自動跨膜電阻測量儀(德國Nanoanalytics公司)；高壓滅菌罐(DY2009X-032-00，上海博訊實業(yè)有限公司)；酶標儀(Spectra max型，美國MD公司)；藥物滲透性檢測儀(PAMPA-Evolution)。

1.2 細胞

Caco-2細胞(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞中心)。

1.3 試藥

銀杏內(nèi)酯A(成都曼斯特生物科技有限公司，批號：MUST-18031502，純度：99.70%)；熒光素鈉(Coolaber公司，批號：518-47-8，純度：98%)；MEM/EBSS(Hyclone Thermo公司，批號：AC1214569)；非必需氨基酸(Gibco公司，批號：1896361)；胰酶(Gibco公司，批號：1933273)；雙抗(Gibco公司，批號：1851595)；胎牛血清(Gibco公司，批號：1856032)；二甲基亞砜(Sigma 公司，批號：SHBG3288V)；Hank′s溶液(Solarbio公司，批號：20180713)；MTT(Amresco公司，批號：298-93-1)；12孔Transwell TM培養(yǎng)板(1.12 cm2，0.4 μm，Corning公司，批號：34717041)；96孔細胞培養(yǎng)板(Corning公司，批號：15718601)；T-25細胞培養(yǎng)瓶(Corning公司，批號：35216601)；乙腈(色譜純，德國默克公司，批號：75-05-8)；甲醇(色譜純，德國默克公司，批號：67-56-1)。

2 方法

2.1 樣品的制備

精密稱取銀杏內(nèi)酯A對照品10.4 mg置于0.5 mL EP管中，加入二甲基亞砜(DMSO)配成質(zhì)量濃度為100 mg·mL-1的銀杏內(nèi)酯A對照品溶液。

2.2 銀杏內(nèi)酯A定量檢測

色譜條件：ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；保護柱(VanGuardTMPre-Column 3/Pk，5 mm×2.1 mm Column)；流動相為水-甲醇(55∶45)；檢測波長為220 nm；流速為0.2 mL·min-1；柱溫為30 ℃；進樣量為2 μL；檢測器為H-class PDA。

線性關(guān)系考察：精密吸取銀杏內(nèi)酯A對照品溶液，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為200、100、50、20、10、5、2、1 μg·mL-1的溶液，混勻后0.22 μm濾膜過濾，進樣20 μL，按2.2中的色譜方法進行定量分析，以質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，得線性回歸方程：Y=26 436X+49 759(r=0.999 7)線性范圍為1～200 μg·mL-1。

精密度與回收率考察：選擇25、50、100 μg·mL-1低、中、高3個質(zhì)量濃度的銀杏內(nèi)酯A樣品，測定5次，計算日內(nèi)精密度RSD 1.08%<2%。每天使用新配制的25、50、100 μg·mL-1低、中、高3個質(zhì)量濃度的銀杏內(nèi)酯A樣品，連續(xù)3 d，計算日間精密度RSD為1.03%<2%。說明該分析方法的精密度符合方法學(xué)要求。按精密度實驗操作，計算求得實測質(zhì)量濃度，與理論質(zhì)量濃度比較得到方法的回收率為98.6%，RSD為1.12%<2%，說明該分析方法的回收率符合方法學(xué)要求。

2.3 軟件預(yù)測

實驗采用MOE、Discovery Studio、StarDrop 3種軟件對銀杏內(nèi)酯A進行預(yù)測，分別得出溶解性(lgS、lgP、lgD、ADMET_Solubility_Level)、滲透性(HIA category、ADMET_Absorption_Level)及P-gp底物判斷等相關(guān)參數(shù)對銀杏內(nèi)酯A生物藥劑學(xué)屬性進行預(yù)測。

2.4 銀杏內(nèi)酯A溶解性實驗

根據(jù)美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)工業(yè)指導(dǎo)原則[6]：稱取銀杏內(nèi)酯A溶于水(pH 5.8)、pH 1.2、4.0、6.8緩沖液中，使藥物達到飽和狀態(tài)，置于37 ℃搖床振蕩3 h，30 000 r·min-1離心25 min(離心半徑：5 cm)，取上清液10 μL，適當稀釋后，按2.2色譜條件檢測藥物濃度，重復(fù)3次，計算溶解度及D0值。

D0=(M0/V0)/Cs

(1)

式中：M0為人的最大給藥劑量(mg)，V0為250 mL，Cs為溶解度(mg·mL-1)。

本實驗主要根據(jù)動物與人之間的等效劑量換算方法[7]來計算銀杏內(nèi)酯A的M0，根據(jù)文獻[8]中兔的最大給藥量劑量為10.64 mg，因此可得人的最大給藥劑量為89.04 mg。

《中華人民共和國藥典》(2015版)的溶解性測定方法[9]：精密稱取藥物10 mg置于具塞離心管中，加入5 mL蒸餾水，樣品試管置于37 ℃水浴，每5 min振蕩30 s，觀察30 min內(nèi)的溶解情況，充分混勻后取出部分溶，并用HPLC分析銀杏內(nèi)酯A的含量。

2.5 銀杏內(nèi)酯A的細胞毒性實驗

每孔1×105個/mL的Caco-2細胞懸液接種在96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100 μL。其中2組為空白組和陰性對照組，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去廢液并向其中加入用不完全培養(yǎng)基配制的不同質(zhì)量濃度的銀杏內(nèi)酯A溶液，每孔100 μL，培養(yǎng)12 h。取出培養(yǎng)板，每孔加20 μL質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1MTT溶液(MTT采用PBS配制)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄廢液，然后向其中加入150 μL的DMSO溶液，置于搖床低速振蕩10 min，將其放于酶標儀中檢測各孔在570 nm處的吸光度值(A)，計算細胞抑制率，本實驗選取抑制率低于10%的高、中、低3個質(zhì)量濃度進行轉(zhuǎn)運實驗。

細胞抑制率=[(A陰性對照組-A空白組)-(A實驗組-A空白組)]/(A陰性對照組-A空白組)×100%

(2)

2.6 銀杏內(nèi)酯A滲透性實驗

2.6.1 Caco-2細胞模型的建立及轉(zhuǎn)運實驗 首先用含1%非必需氨基酸、1%雙抗、10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基復(fù)蘇Caco-2細胞，然后將其置于37 ℃、5%CO2、90%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，培養(yǎng)3～5 d，長至80%～90%程度，進行傳代。在細胞傳3～4代將其凍存保存在液氮中，便于下次使用。

取40～60代長至80%～90%的Caco-2細胞每孔2×105個/mL的細胞懸液接種在12孔Traswell細胞培養(yǎng)板上，頂端(AP)側(cè)加0.5 mL的細胞液，底端(BL)側(cè)加1.5 mL的細胞液，隔天換液，培養(yǎng)至19～21 d，并且隔天使用全自動跨膜電阻測量儀測試細胞TEER值。

21 d時，開始進行轉(zhuǎn)運實驗，首先吸出兩側(cè)培養(yǎng)液，加入Hank′s溶液清洗1遍，然后再加Hank′s溶液在培養(yǎng)箱中孵育20 min，取出檢測其TEER值>500 Ω進行實驗，在AP側(cè)加入不同濃度的藥物溶液，BL側(cè)加入空白Hank′s溶液，在15、30、60、90、120、150、180 min的不同時間段在BL側(cè)取200 μL的樣品，同時在相同的位置補充200 μL空白Hank′s溶液，實驗結(jié)束后再次測試細胞TEER值。將樣品前處理后按照2.2的色譜條件在超高效液相色譜(UPLC)中進行含量測定，計算其表觀滲透系數(shù)(Papp)。

Papp=(dQ/dt)/(A×C0)

(3)

其中，dQ/dt(μg·s-1)為藥物單位時間轉(zhuǎn)運量，C0(mg·L-1)為藥物在供給室的初始質(zhì)量濃度，A(1.12 cm2)為轉(zhuǎn)運膜面積。

2.6.2 吸收機制研究 在建立好的Caco-2細胞模型中取高、中、低3個質(zhì)量濃度的銀杏內(nèi)酯A溶液和含有維拉帕米的銀杏內(nèi)酯A溶液進行雙向轉(zhuǎn)運實驗，在AP側(cè)加入0.5 mL的藥物溶液，同時在BL側(cè)加入1.5 mL的空白Hank′s溶液作為接收液，在15、30、60、90、120、150、180 min的不同時間段在BL側(cè)取200 μL的樣品，同時在相同的位置補充200 μL空白Hank′s溶液。另外，在BL側(cè)加入1.5 mL的藥物溶液，同時在AP側(cè)加入0.5 mL的空白Hank′s溶液作為接收液，在15、30、60、90、120、150、180 min的不同時間段在BL側(cè)取200 μL的樣品，同時在相同的位置補充200 μL空白Hank′s溶液。將所取樣品與UPLC進行含量測定，分析藥物在AP→BL與BL→AP的不同轉(zhuǎn)運中藥物轉(zhuǎn)運與藥物濃度及時間的關(guān)系以及藥物是否是P-gp底物。

2.6.3 PAMPA模型的建立及轉(zhuǎn)運實驗 模型建立：取配制好的磷脂溶液加在平行人工膜滲透性(PAMPA)模型的疏水網(wǎng)膜表面上，供室馬上加入200 μL含藥物的Hank′s溶液，受室加入200 μL Hank′s溶液，整個加藥過程在10 min內(nèi)完成。間隔30 min在供室取100 μL溶液，按2.2的色譜條件進行含量測定，計算其有效滲透率(Pe)。

Pe=-ln[1-(CA(t)/Cequilibrium]/A×(1/VD+1/VA)×t

(4)

Cequilibrium=[CD(t)×VD+CA(t)×VA]/(VD+VA)

(5)

其中，A表示人工磷脂膜面積(0.32 cm2)，VD表示供體側(cè)的體積(mL)，VA表示受體側(cè)的體積(mL)，t表示滲透時間(min)，CA(t)表示在t時間內(nèi)受體液的質(zhì)量濃度(mg·mL-1)，CD(t)表示t時間內(nèi)供體液的質(zhì)量濃度(mg·mL-1)。

3 實驗結(jié)果

3.1 軟件預(yù)測的結(jié)果

在軟件MOE預(yù)測結(jié)果中，lgP為0.259 7，h_lgS為-2.865，lgS為-3.26，根據(jù)FDA中的高溶解度大于或等于85%的藥物，在軟件中高溶解度藥物的lgS的范圍在-1～5，可以表明銀杏內(nèi)酯A為難溶性藥物；在軟件Discovery Studio預(yù)測結(jié)果中，在軟件中可以根據(jù)ADMET_Solubility_Level對藥物的水溶性高低進行判斷，預(yù)測結(jié)果顯示ADMET_Solubility_Level為3，ADMET_Absorption_Level為3，lgD為-0.921，ADMET_Solubility_Level>0的范圍內(nèi)表明藥物的水溶性過高表明銀杏內(nèi)酯A水溶性好，ADMET_Absorption_Level為3時表明化合物在腸道內(nèi)的吸收情況差；在StarDrop軟件預(yù)測結(jié)果中，lgS為2.013，HIA category為“+”， P-gp category為“no”， 其中HIA表示腸道吸收，為“+”時，代表藥物吸收>30%，因此預(yù)測銀杏內(nèi)酯A的結(jié)果為溶解性為微溶，藥物吸收>30%，不受P-gp調(diào)控。其中軟件MOE預(yù)測的溶解度結(jié)果與實驗結(jié)果較為一致。

3.2 溶解性結(jié)果

根據(jù)美國FDA的檢測方法，銀杏內(nèi)酯A在pH 1.2、4.0、6.8及水中的D0值分別為25.38、26.66、66.46、59.46，可以得出其D0值均大于1，因此可以判斷其為低溶解性藥物。根據(jù)《中華人民共和國藥典》(2015版)的溶解性測定方法[9]：銀杏內(nèi)酯A在水中溶解度為0.006 g·mL-1，小于極微溶的標準0.01 g·mL-1，因此銀杏內(nèi)酯A為極微溶。

3.3 銀杏內(nèi)酯A的細胞毒性

采用MTT法檢測不同濃度的銀杏內(nèi)酯A對Caco-2細胞存活率的影響，見圖1。

注：與陰性對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖1 MTT法檢測不同濃度銀杏內(nèi)酯A的Caco-2細胞存活率

因此實驗取細胞存活率>90%的高、中、低3個質(zhì)量濃度為300、400、500 μg·mL-1進行實驗。

3.4 藥物滲透性的實驗結(jié)果

3.4.1 滲透性判斷 實驗主要以Papp為14.96×10-6cm·s-1為臨界值[10]對銀杏內(nèi)酯A的滲透性高低進行判斷，AP→BL轉(zhuǎn)運實驗中銀杏內(nèi)酯A的Papp為8.04×10-6～13.99×10-6cm·s-1，小于該值，因此判斷銀杏內(nèi)酯A屬于低滲透性藥物。

3.4.2 吸收機制 根據(jù)圖2～4，可得出銀杏內(nèi)酯A在AP→BL與BL→AP側(cè)的轉(zhuǎn)運量伴隨著時間逐步增加且在3 h內(nèi)沒有飽和，說明對時間具有一定的依賴性，在30 min中后不同濃度組的趨勢不同，其中高濃度組較中濃度組在同一時間段內(nèi)它的轉(zhuǎn)運量在AP→BL與BL→AP側(cè)明顯增加，推測銀杏內(nèi)酯A以被動轉(zhuǎn)運為主。由于BL→AP側(cè)高、中、低濃度組在不同的時間點它們的轉(zhuǎn)運量差異不大，通過對高、低2個濃度組在AP→BL側(cè)的比較，可以得出它們的雙向轉(zhuǎn)運Papp：低濃度>高濃度，隨著給藥濃度的增加，轉(zhuǎn)運速率反而減小，因此推測轉(zhuǎn)運過程中可能存在主動轉(zhuǎn)運的參與，從而導(dǎo)致Papp計算公式中的分子部分增加幅度減小，而高濃度時分母C0較大，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)運速率在低濃度時較高。高、中、低3個濃度的外排系數(shù)(ER)分別為1.11、1.27、0.85，均小于1.5，說明銀杏內(nèi)酯A以被動轉(zhuǎn)運為主。且雙側(cè)轉(zhuǎn)運的Papp均小于14.96×10-6cm·s-1，說明銀杏內(nèi)酯A為低滲透性藥物。

圖2 銀杏內(nèi)酯A的AP→BL方向的轉(zhuǎn)運量隨時間和濃度的變化

圖3 銀杏內(nèi)酯A的BL→AP方向的轉(zhuǎn)運量隨時間和濃度的變化

注：n=3，*P<0.05。圖4 銀杏內(nèi)酯A的Papp在不同濃度不同方向的變化

P-gp是可以將藥物從AP側(cè)轉(zhuǎn)運到BL側(cè)的一種外排蛋白，主要存在于腸道細胞中[10]。根據(jù)圖5可以得出，銀杏內(nèi)酯A與含有同等濃度的維拉帕米相比較，它們的Papp差異不大，且P>0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明添加P-gp抑制劑維拉帕米后，對實驗組的銀杏內(nèi)酯A的轉(zhuǎn)運速率無影響，說明銀杏內(nèi)酯A的轉(zhuǎn)運不受P-gp的調(diào)控，銀杏內(nèi)酯A不是P-gp的底物。

注：n=3，P>0.05。圖5 維拉帕米對銀杏內(nèi)酯A轉(zhuǎn)運的影響

3.4.3 PAMPA膜的滲透性實驗結(jié)果

熒光素鈉試漏：樣品取樣結(jié)束后，吸出供體液，向其中加入2 mg·mL-1的熒光素鈉溶液，在酶標儀中進行檢測。根據(jù)圖6樣品與空白Hank′s溶液的A值無明顯差異，說明無藥物滲透，膜完整性良好。

圖6 熒光素鈉A值與空白Hank′s溶液的A值比較

根據(jù)圖7～8可得出銀杏內(nèi)酯A的轉(zhuǎn)運量是隨著時間的增加而增加，并且在3 h之內(nèi)未出現(xiàn)飽和狀態(tài)，說明具有一定的時間依賴性。比較高、中、低3組濃度的Pe差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，可以判斷其為被動轉(zhuǎn)運。同時吸收良好的藥物的Pe>10-6cm·s-1；吸收為1%～100%的藥物的Pe為0.1×10-6～1×10-6cm·s-1；而吸收差的藥物(即吸收<1%)的Pe<10-6cm·s-1，銀杏內(nèi)酯A的Pe均小于1×10-6cm·s-1，說明銀杏內(nèi)酯A為低滲透性藥物。

圖7 銀杏內(nèi)酯A轉(zhuǎn)運量隨時間和濃度的變化

注：n=3，**P<0.01。圖8 銀杏內(nèi)酯A的Pe在不同濃度的變化

4 結(jié)論

D0值和水中溶解度結(jié)果證明銀杏內(nèi)酯A為難溶性藥物，Caco-2細胞及PAMPA膜轉(zhuǎn)運實驗結(jié)果表明銀杏內(nèi)酯A為低滲透性藥物。根據(jù)Amidon等[11]于1995年提出的生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)理論，綜合判定，銀杏內(nèi)酯A為BCSⅣ類藥物，溶解性和滲透性差是導(dǎo)致其口服生物利用度低的重要因素。此外，銀杏內(nèi)酯A的轉(zhuǎn)運不受P-gp的調(diào)控，吸收機制以被動轉(zhuǎn)運為主。MOE軟件在預(yù)測銀杏內(nèi)酯A溶解性時，結(jié)果更為準確；StarDrop軟件在預(yù)測銀杏內(nèi)酯A與P-gp相關(guān)性上也得出較為準確的結(jié)論。

5 討論

實驗從藥物的溶解度和滲透性兩方面展開。溶解度方面，根據(jù)美國FDA指導(dǎo)原則，計算其D0值，均大于1表明銀杏內(nèi)酯A為低溶解性藥物；根據(jù)《中華人民共和國藥典》的溶解度劃分，銀杏內(nèi)酯A為難溶性藥物。軟件MOE、Discovery Studio、StarDrop在預(yù)測銀杏內(nèi)酯A的溶解性時，結(jié)果分別為難溶、易溶、微溶，相差較大，與實驗結(jié)果不相符，一方面可能因為有的軟件更適合預(yù)測大分子化合物，另一方面可能是軟件預(yù)測主要考慮其化學(xué)結(jié)構(gòu)并沒有實際考慮到化學(xué)結(jié)構(gòu)中的羥基在不同pH條件下發(fā)生反應(yīng)，改變原有結(jié)構(gòu)。軟件預(yù)測可以高效簡便的判斷出藥物的性質(zhì)，但是可能與實際有所出入，軟件預(yù)測僅可以作為判斷的一個指標，不能作為判斷的主要依據(jù)。

在滲透性方面，本實驗主要采用Caco-2單層細胞模型和PAMPA模型。在Caco-2單層細胞模型中，AP→BL轉(zhuǎn)運實驗中銀杏內(nèi)酯A的Papp為8.04×10-6～13.99×10-6cm·s-1，在BL→AP轉(zhuǎn)運實驗中銀杏內(nèi)酯A的Papp為11.79×10-6～12.95×10-6cm·s-1，Volpe等[12]通過對Caco-2細胞單層模型的實驗，以23個模型藥物為標準，研究其Papp與其通過人體小腸吸收fa值比較，驗證了BCS評價標準，因此建立以Caco-2細胞模型培養(yǎng)21 d時的藥物轉(zhuǎn)運滲透性高低評價標準，臨界Papp為14.96×10-6cm·s-1。同時相關(guān)文獻也有以Papp<1.0×10-6cm·s-1為吸收性差，Papp在1.0×10-6～10×10-6cm·s-1為吸收中等，Papp>10×10-6cm·s-1為吸收性好。本實驗主要以Papp為14.96×10-6cm·s-1為臨界值，銀杏內(nèi)酯A屬于低滲透性藥物，但是以另一個標準銀杏內(nèi)酯A屬于高滲透性藥物。在PAMPA模型中，其Papp為2.45×10-6～3.42×10-6cm·s-1，因此銀杏內(nèi)酯A屬于低滲透性藥物。綜合結(jié)果判斷銀杏內(nèi)酯A為低滲透性藥物。通過細胞模型可以判斷其為被動轉(zhuǎn)運，因此Caco-2單層細胞模型應(yīng)用更為廣泛，各種規(guī)定更加完善，PAMPA模型操作更為簡單快捷，且耗時短，但由于所用的磷脂膜沒有蛋白的存在，更適合用于被動轉(zhuǎn)運為主的藥物。

實驗以銀杏內(nèi)酯中的主要成分之一的銀杏內(nèi)酯A為模型藥物進行研究，結(jié)果表明其滲透性較差，在其他劑型上應(yīng)用具有一定的局限性。銀杏內(nèi)酯A結(jié)構(gòu)中存在羥基可能是影響其滲透性的原因，有研究表明對羥基進行甲基化修飾可以提高具有羥基取代化合物的滲透性[13]；透膜過程中氫鍵能力越強，滯留時間就越長也是滲透性低的原因之一[14]，可以減輕氫鍵能力增加其滲透性。難溶性藥物制備成固體分散體、納米制劑等，均是提高其溶解度的有效方法[15]。

實驗通過軟件預(yù)測、美國FDA指導(dǎo)原則、《中華人民共和國藥典》的溶解度方法、Caco-2單層細胞模型和PAMPA模型系統(tǒng)的對銀杏內(nèi)酯A的滲透性研究進行其BCS分類找出其生物利用度低的主要原因，為快速評價藥物基于生物藥劑學(xué)屬性的成藥性，進而針對性地提高生物利用度的研究提供支撐。