趙夢君，李晨晨，甘龍，潘瑞樂

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193

本研究結(jié)合遠志化學(xué)成分特點，認為有機酸和細葉遠志皂苷的含量可以間接反映遠志中糖酯類成分和皂苷類成分的含量，故將遠志水解后進行分析，建立了遠志堿水解8個主要成分的含量測定方法，為遠志的質(zhì)量控制提供了新的思路。

1 材料

1.1 儀器

Waters公司高效液相色譜儀，包括：waters e2695泵、waters 2489 紫外-可見光檢測器、empower 2色譜工作站、waters 996光電二極管陣列檢測器；JA2103N電子分析天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；JM-A30001電子天平(余姚紀銘稱重校驗設(shè)備有限公司)；KQ250B型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；FW135中草藥粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司)；OSB-2100 EYELA油浴鍋及N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；DLSB-5/20低溫冷卻液循環(huán)泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

1.2 試藥

對照品對羥基苯甲酸、對羥基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、對甲氧基肉桂酸、細葉遠志皂苷購自成都埃法生物技術(shù)有限公司(批號分別為：AF7112017、AF8081707、AF7062102、AF7112632、AF8121702、AF8122101、AF8121802、AF8091003，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1)；甲醇、乙腈色譜純(美國fisher公司)；娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)；其余試劑均為分析純。

10批遠志來源見表1，除樣品8為野生品外，其余均為栽培品，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所張本剛研究員鑒定為遠志科遠志PolygalatenuifoliaWilld.。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測波長的確定

采用Waters公司高效液相色譜儀，包括：waters e2690泵、waters 996光電二極管陣列檢測器、empower 2色譜工作站，分別對遠志水解產(chǎn)物8個成分在190～400 nm進行全波長掃描，掃描結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，對羥基苯甲酸(1)最大吸收波長是256 nm，對羥基肉桂酸(2)最大吸收波長310 nm，芥子酸(3)最大吸收波長是323、238 nm，阿魏酸(4)的最大吸收波長是323 nm，苯甲酸(5)的最大吸收波長是196、230 nm，3，4，5-三甲氧基肉桂酸(6)最大吸收波長是231、304 nm，對甲氧基肉桂酸(7)的最大吸收波長是309 nm，細葉遠志皂苷(8)只在210 nm附近有末端吸收。綜合考慮8個化合物的吸收特征，本研究選擇210 nm作為對羥基苯甲酸、苯甲酸、細葉遠志皂苷的檢測波長，310 nm作為對羥基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、對甲氧基肉桂酸的檢測波長。

圖1 遠志堿水解8個測定成分的結(jié)構(gòu)式

表1 遠志藥材產(chǎn)地信息

2.2 色譜條件

YMC-Pack ODS-A(250 mm ×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動相乙腈(A)-0.05 %磷酸-水溶液(B)，梯度洗脫(0～6 min，20%～22%A；6～8 min，22%A；8～10 min，22%～25%A；10～14 min，25%～28%A；14～30 min，28%～36%A；30～33 min，36%～38%A)；流速為1 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測波長為210和310 nm；進樣量為10 μL。

上述色譜條件下8個成分在33 min內(nèi)與其他共存峰均達到基線分離，色譜圖見圖3，8個測定成分的理論塔板數(shù)均>10 000。

2.3 溶液的配制

2.3.1 對照品溶液 精密稱取對照品對羥基苯甲酸、對羥基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、對甲氧基肉桂酸、細葉遠志皂苷適量，分別置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到對羥基苯甲酸0.255 g·L-1、對羥基肉桂酸0.520 g·L-1、芥子酸0.490 g·L-1、阿魏酸0.513 g·L-1、苯甲酸0.546 g·L-1、3，4，5-三甲氧基肉桂酸0.520 g·L-1、對甲氧基肉桂酸0.521 g·L-1、細葉遠志皂苷0.785 g·L-1的對照品儲備液。取各對照品儲備液各1 mL混合定容至10 mL，得到混合對照品溶液。

注：1.對羥基苯甲酸；2.對羥基肉桂酸；3.芥子酸；4.阿魏酸；5.苯甲酸；6.3，4，5-三甲氧基肉桂酸；7.對甲氧基肉桂酸；8.細葉遠志皂苷。圖2 遠志堿水解8個測定成分全波長(190～400 nm)紫外光譜掃描圖

注：A.對照品溶液；B.供試品溶液。圖3 遠志堿水解產(chǎn)物在210、310 nm波長的HPLC圖

2.3.2 供試品溶液 稱取樣品粉末(過3號篩)1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率400 W，頻率40 kHz)1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液25 mL，置圓底燒瓶中，蒸干，殘渣加10%氫氧化鈉溶液50 mL加熱回流2 h，放冷，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為4～5，用水飽和正丁醇提取3次，每次 50 mL，合并正丁醇液，回收正丁醇液至干，殘渣加甲醇適量使溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 將2.3.1項下混合對照品溶液，用甲醇逐級稀釋成1、2、4、8、16、32倍數(shù)濃度的溶液，搖勻，分別取10 μL注入高效液相色譜儀，按2.2項下色譜條件進行測定，以測得的峰面積為縱坐標，混合對照品質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程和r，見表2。

2.4.2 精密度試驗 精密吸取2.3.1項下混合對照品溶液10 μL，按2.2項下色譜條件，重復(fù)進樣6次，記錄對羥基苯甲酸、對羥基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、對甲氧基肉桂酸、細葉遠志皂苷8個成分的峰面積并計算RSD，結(jié)果8個成分的RSD分別為0.30%、0.40%、0.30%、0.30%、0.20%、0.30%、0.40%、0.30%，表明分析方法和儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一遠志樣品，按2.3.2項下制備成供試品溶液，在室溫下放置后于0、2、4、8、12、24、48、72 h，按2.2項下色譜條件測定對羥基苯甲酸、對羥基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、對甲氧基肉桂酸、細葉遠志皂苷的峰面積，8種成分峰面積的RSD分別為0.40%、0.60%、0.40%、0.40%、0.40%、0.50%、0.60%、0.30%，表明供試品溶液在72 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗 取同一遠志樣品6份，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，按2.2項下色譜條件測定對羥基苯甲酸、對羥基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、對甲氧基肉桂酸、細葉遠志皂苷的峰面積，計算各單位峰面積，結(jié)果8成分的單位峰面積RSD分別為3.36%、2.01%、3.25%、2.06%、2.47%、1.72%、3.71%、4.12%，RSD均小于4.12%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.4.5 最低定量限(LOQ)和最低檢測限(LOD) 根據(jù)《中國藥典》中“9101藥品質(zhì)量標準分析方法驗證指導(dǎo)原則”，以信噪比10∶1時待測物質(zhì)的最低濃度或量為定量限，以信噪比為3∶1時待測物質(zhì)的最低濃度或量為檢測限。將2.3.1項下對照品稀釋至一定倍數(shù)，按2.2項下色譜條件進行測定，最終得出對羥基苯甲酸、對羥基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、對甲氧基肉桂酸、細葉遠志皂苷的LOQ分別為：0.032、0.065、0.061、0.064、0.068、0.033、0.033、12.266 μg·mL-1，LOD分別為：0.016、0.033、0.015、0.016、0.034、0.016、0.016、6.132 μg·mL-1。

2.4.6 加樣回收率試驗 精密稱取對照品對羥基苯甲酸、對羥基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、對甲氧基肉桂酸、細葉遠志皂苷各適量，得到質(zhì)量濃度分別為1.848、1.238、0.964、0.934、0.382、1.09、1.964、3.836 g·L-1的對羥基苯甲酸、對羥基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、對甲氧基肉桂酸、細葉遠志皂苷溶液。

取6份遠志粉末，每份0.3 g，精密稱定，分別置于250 mL圓底燒瓶中，精密加入2.4.6項下所配制的對羥基苯甲酸、對羥基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、對甲氧基肉桂酸溶液各1 mL，細葉遠志皂苷溶液2 mL，用70%甲醇補足至50 mL，按2.3項下方法制成加標供試品溶液，依2.2項下色譜條件測定，計算各成分的平均加樣回收率和RSD，結(jié)果見表3。8個測定成分的平均回收率分別為：102.36%、102.50%、94.74%、104.95%、94.84%、101.22%、97.69%、96.24%；RSD分別為：1.62%、1.82%、1.44%、1.09%、2.62%、1.62%、2.75%、2.48%，平均回收率為94.74%～104.95%，RSD在1.09%～2.75%(n=6)，結(jié)果表明本法的準確性良好。

表2 遠志8個水解產(chǎn)物的線性方程和線性范圍(n=6)

表3 遠志8個水解產(chǎn)物的加樣回收率試驗(n=6)

2.5 樣品測定

精密稱取表1中的10批遠志粉末，按2.3.2項下方法制成供試品溶液，依2.2項下色譜條件進行測定，外標一點法計算其含量，對羥基苯甲酸、對羥基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、對甲氧基肉桂酸、細葉遠志皂苷質(zhì)量分數(shù)分別為0.02%～0.09%、0.20%～0.41%、0.25%～0.70%、0.18%～0.39%、0.19%～0.40%、0.05%～0.68%、0.28%～0.36%、1.77%～4.07%，結(jié)果見表4。

表4 遠志8個水解產(chǎn)物含量測定結(jié)果(n=3) %

3 討論

3.1 測定指標的選擇

遠志皂苷主要為五環(huán)三萜型，基本母核為齊墩果烷，苷元有遠志皂苷元(presenegenin)、2β-羥基-23-醛基齊墩果酸(polygalagenin)、2β-23-二羥基齊墩果酸(bayogenin)等。苷元的區(qū)別在于2位碳取代基不同(羥基或酮基)，23位碳氧化度不同(甲基、醛基、羥甲基、羧基或亞甲基)，雙鍵的數(shù)量和位置的差異。遠志皂苷元是最主要的類型，其皂苷類型多為3-O苷和28位酯苷。皂苷糖鏈存在一定的酯化結(jié)構(gòu)，主要取代基有4-甲氧基肉桂?；?、3，4，5-三甲氧基肉桂?；?、乙酰基等[20]。遠志寡糖酯成分以蔗糖為共同的母核，寡糖母核通常以1個果糖與2個、3個或4個葡萄糖連接而成。蔗糖酯多以果糖的3位羥基和葡萄糖的6位羥基與各種酰基成酯，寡糖酯則在糖環(huán)上的不同部位發(fā)生不同程度的酯化。遠志糖酯主要取代基有：苯甲?；?、對羥基苯甲酰基、肉桂?；?、對甲氧基肉桂酰基等[21]。

從遠志皂苷和糖酯的結(jié)構(gòu)特點和取代基種類可以看出，遠志皂苷堿水解的主要產(chǎn)物有：葡萄糖、細葉遠志皂苷；遠志糖酯堿水解主要產(chǎn)物有：乙酸、苯甲酸、對羥基苯甲酸、苯丙烯酸等。結(jié)合化合物紫外吸收特征和對照品色譜保留時間，筆者從遠志堿水解產(chǎn)物中鑒定出了對羥基苯甲酸、對羥基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、對甲氧基肉桂酸、細葉遠志皂苷、反式肉桂酸和3，4-二甲氧基肉桂酸10個主要成分，由于反式肉桂酸和3，4-二甲氧基肉桂酸含量較低，本研究選擇對羥基苯甲酸、對羥基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、對甲氧基肉桂酸、細葉遠志皂苷8個成分進行分析。

3.2 堿水解后有機酸和細葉遠志皂苷的含量與遠志中糖酯和皂苷含量的關(guān)系

遠志糖酯類成分是遠志及遠志科其他植物中存在的獨特化學(xué)成分，隨著對遠志科植物研究的不斷深入，糖酯類成分逐漸引起了人們的關(guān)注。該類成分具有腦保護、抗抑郁、抗老年癡呆等作用[22-23]。因此遠志糖酯類成分的含量是評價遠志質(zhì)量的重要指標。但《中國藥典》僅對3，6′-二芥子酰基蔗糖1個糖酯的含量進行測定。遠志糖酯成分非常復(fù)雜，單個成分的含量不能完全反應(yīng)遠志糖酯的總含量。本研究測定的堿水解7個有機酸，主要來自糖酯的水解，這些有機酸含量的總和可以間接反映遠志糖酯含量情況。由于遠志皂苷元是遠志皂苷的最主要的苷元，因此，遠志皂苷堿水解得到的次級皂苷細葉遠志皂苷(tenuifolin)的含量也可間接反映遠志皂苷含量。故本研究的測定方法及結(jié)果，可以為遠志質(zhì)量控制提供一種新的思路和方法。

3.3 不同產(chǎn)地遠志藥材堿水解含量結(jié)果分析

中藥材成分復(fù)雜，其質(zhì)量受不同基原、產(chǎn)地、種植方式、生長年限及采收季節(jié)等多種因素的影響。據(jù)報道，不同季節(jié)采收的遠志藥材其原型成分3，6′-二芥子?；崽呛坎町愝^大[24]。本研究利用建立的方法對10批不同來源遠志藥材堿水解8個成分含量進行測定，結(jié)果顯示不同樣品中各成分含量存在明顯差異。其中3，4，5-三甲氧基肉桂酸成分差異最大，0.05%～0.68%，相差13.6倍，原因可能與遠志糖酯的水解產(chǎn)物和其他酯類均包含此成分有關(guān)。《中國藥典》中遠志指標成分細葉遠志皂苷的質(zhì)量分數(shù)為1.77%～4.07%，最高和最低相差2.3倍。與《中國藥典》標準比較，針對細葉遠志皂苷這一成分，10批測定樣品中有4批不達標，涉及市場購買與產(chǎn)地采收2種來源，這提示我們市場藥材質(zhì)量控制手段還有待提高，遠志藥材使用應(yīng)嚴格注意產(chǎn)地選擇。

3.4 其他

關(guān)于樣品制備，樣品制備過程中應(yīng)注意萃取環(huán)節(jié)，一定要萃取到樣品無色透明，本研究均萃取3次；另外對色譜條件的確定，研究過程中比較了不同色譜柱、不同洗脫梯度、不同流速、不同柱溫等多個影響因素，最終確定了正文2.2項下色譜條件。

遠志作為常用中藥，成分復(fù)雜，質(zhì)量控制難度較大。本研究采用堿水解法，將遠志中復(fù)雜但又具有較好活性的皂苷類成分和糖酯類成分水解為相對簡單的細葉遠志皂苷、芥子酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸等簡單小分子有機酸，并首次建立高效液相色譜測定包括細葉遠志皂苷在內(nèi)的8個堿水解成分含量的方法。該法簡便、快速，具有較高的準確度與精密度，且重復(fù)性好，能夠有效地測定遠志藥材中主要水解產(chǎn)物的含量，為遠志藥材質(zhì)量控制提供了新思路。