劉 鵬 ，龔 陽(yáng)，劉道江，張 翔，張佳楠，楊高亮，方 念

1.南昌大學(xué)第三附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江西 南昌 330008；

2.新余市人民醫(yī)院普外科，江西 新余 338025；

3.陽(yáng)新縣人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 黃石 435200；

4.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科，江西 南昌 330008

胃癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，是導(dǎo)致我國(guó)癌癥死亡的主要原因［1-2］。中國(guó)惡性腫瘤流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，胃癌發(fā)病率居所有癌癥第2位，死亡率位列所有癌癥第3位［3］。其具有惡性程度較高、生長(zhǎng)迅速、易發(fā)生轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)［4-5］。目前主要的治療方式是放化療和手術(shù)治療，然而，患者預(yù)后依舊很差。因此亟待尋找新的特異度高、靈敏度高的胃癌生物標(biāo)志物。研究表明，活躍的糖酵解途徑在胃癌的快速生長(zhǎng)方面發(fā)揮著重要作用；也有研究也證實(shí)腫瘤細(xì)胞糖代謝增強(qiáng)與糖酵解途徑限速酶的活性相關(guān)［6-7］。6-磷酸果糖激酶-2同工酶3（6-phosphofructo-2-kinase 3，PFKFB3）作為糖酵解關(guān)鍵酶，在肝癌、骨肉瘤、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等呈高表達(dá)，研究也證實(shí)PFKFB3與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。盡管有研究［8］表明PFKFB3在胃癌中高表達(dá)，但其在胃癌進(jìn)展中的作用和機(jī)制并不清楚。因此，本研究分析PFKFB3在胃癌組織中的表達(dá)及其對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響和機(jī)制，旨在為胃癌的靶向治療尋找新的線索。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及細(xì)胞系

人胃癌細(xì)胞系MGC-803及AGS購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典藏培養(yǎng)物保型委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)/中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，PFKFB3、cyclin D1、PANC、P-/PI3K、P-/AKT、BCL-2、BAX及GAPDH抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，細(xì)胞凋亡及周期試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，EdU試劑盒購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司，PFKFB3 shRNA質(zhì)粒及空轉(zhuǎn)shNC質(zhì)粒購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，血清、培養(yǎng)基、胰酶購(gòu)自以色列Biological Industries公司。

1.2 組織標(biāo)本

經(jīng)南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)許可，收集了南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院及第三附屬醫(yī)院72例經(jīng)外科手術(shù)切除的新鮮胃癌標(biāo)本及其相應(yīng)的癌旁組織。所有標(biāo)本都經(jīng)病理醫(yī)師診斷為胃癌及癌旁組織，于-80 ℃保存。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）檢測(cè)

采用TRIzol法提取胃癌組織及細(xì)胞RNA，經(jīng)核酸定量分析儀測(cè)定RNA的濃度和純度。按照預(yù)設(shè)定的程序?qū)⑵淠孓D(zhuǎn)錄合成cDNA，最后進(jìn)行RTFQ-PCR擴(kuò)增，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 蛋白印跡法（Western blot）檢測(cè)

提取胃癌組織及細(xì)胞總蛋白，經(jīng)二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法定量后，按照預(yù)定分組，每孔約30 μg總蛋白進(jìn)行上樣，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、牛奶封閉后，將蛋白條帶與其相對(duì)應(yīng)的抗體進(jìn)行4 ℃溫育過夜，經(jīng)洗膜緩沖液（TRIS-buffered saline Tween，TBST）洗膜3次，根據(jù)一抗的來(lái)源種屬，與對(duì)應(yīng)二抗室溫溫育1～2 h，再經(jīng)TBST洗膜3次，將電化學(xué)發(fā)光（electrochemical luminescence，ECL）試劑滴加于條帶上，通過凝膠成像分析儀分析胃癌組織及細(xì)胞中PFKFB3的表達(dá)，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

新鮮的胃癌及癌旁組織立即置于4%中性多聚甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋后切成連續(xù)4 μm厚切片，再經(jīng)烤片、脫蠟、水化、滲透、封閉后，與PFKFB3抗體（1∶200）進(jìn)行溫育4 ℃過夜，與相對(duì)應(yīng)來(lái)源的二抗常溫溫育1 h，最后二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色反應(yīng)，于倒置顯微鏡拍照并記錄分析。

1.6 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)染shNC、shPFKFB3質(zhì)粒分組的胃癌細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后以每孔5×103個(gè)胃癌細(xì)胞接種于96孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，待其貼壁后即為0 h加入CCK-8試劑10 μL 37 ℃溫育2 h，于450 nm波長(zhǎng)測(cè)其吸光度（D）值，同樣于1、2、3、4、5 d后測(cè)量其D值，記錄并分析。

1.7 EdU檢測(cè)細(xì)胞增殖

分組同上，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，于細(xì)胞溫育箱中培育24 h，按照EdU試劑說明書，每孔加入50 μL EdU 37 ℃溫育2 h，100 μL 4%中性多聚甲醛固定30 min，經(jīng)0.5%Triton-X滲透后加入100 μL Hoechst33342閉關(guān)溫育30 min，最后熒光顯微鏡下觀察胃癌細(xì)胞增殖情況。

1.8 細(xì)胞周期與凋亡

按照shNC、shPFKFB3進(jìn)行分組，經(jīng)胰酶消化后收集細(xì)胞沉淀，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate-buffered saline，PBS）清洗2次，對(duì)于細(xì)胞周期，4 ℃預(yù)冷的70%甲醇固定4 h，PBS洗2次，收集細(xì)胞，加入異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）染料溫育20 min，上機(jī)檢測(cè)。對(duì)于細(xì)胞凋亡，加入500 mL緩沖液分別加入7AAD及Annexin-Ⅴ溫育30 min上機(jī)檢測(cè)凋亡比例，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0和Graphpad Prism 7.0數(shù)據(jù)軟件進(jìn)行分析。采用t檢驗(yàn)分析兩組間的差異，采用單因素方差分析比較多組間的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PFKFB3在胃癌中表達(dá)情況及與預(yù)后的關(guān)系

為了明確PFKFB3在胃癌中的表達(dá)情況，首先通過TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析了胃癌及相應(yīng)的癌旁組織中PFKFB3的表達(dá)，結(jié)果顯示，胃癌組織中PFKFB3表達(dá)顯著增加（P＜0.05，圖1A），進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)PFKFB3的胃癌患者預(yù)后差（圖1B）。接下來(lái)采用RTFQ-PCR及Western blot分析25例胃癌組織中PFKFB3 mRNA表達(dá)及蛋白水平，RTFQ-PCR結(jié)果顯示，與相應(yīng)的癌旁相比，PFKFB3 mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.01，圖1C）；同樣Western blot結(jié)果也證實(shí)了PFKFB3蛋白水平明顯高于癌旁組織（P＜0.01，圖1D、E）。接下來(lái)采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)了PFKFB3蛋白水平升高（圖1F）。最后分析PFKFB3表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，結(jié)果表明，PFKFB3的表達(dá)升高與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)（P＜0.05，表1）。以上結(jié)果均表明，PFKFB3在胃癌中表達(dá)升高且影響患者預(yù)后。

圖1 PFKFB3在胃癌中表達(dá)情況及與預(yù)后的關(guān)系Fig.1 Expression of PFKFB3 in gastric cancer and its relationship with prognosis

表1 PFKFB3的表達(dá)與胃癌患者的臨床數(shù)據(jù)分析Tab.1 Analysis of the relationship between PFKFB3 expression and clinical data of gastric cancer patients(n)

2.2 下調(diào)PFKFB3的表達(dá)后抑制胃癌的生長(zhǎng)

接下來(lái)分析PFKFB3對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，首先采用shRNA質(zhì)粒干擾胃癌細(xì)胞MGC803的表達(dá)，RTFQ-PCR及Western blot檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，PFKFB3下調(diào)成功（P＜0.01，圖2A、B）。進(jìn)一步通過CCK-8及EdU實(shí)驗(yàn)分析了胃癌細(xì)胞的增殖情況，抑制胃癌細(xì)胞PFKFB3的表達(dá)后，其增殖能力明顯減弱（P＜0.05，圖2C、D）。由此表明，下調(diào)PFKFB3的表達(dá)后可以顯著抑制胃癌的生長(zhǎng)。

2.3 下調(diào)PFKFB3的表達(dá)后胃癌細(xì)胞周期阻滯于G1期并促進(jìn)其凋亡

進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)分析對(duì)胃癌細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明，下調(diào)胃癌細(xì)胞中PFKFB3表達(dá)后，細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯于G1期（P＜0.01），并且胃癌細(xì)胞凋亡比例明顯增加；同樣，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，PFKFB3表達(dá)的降低導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）和增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表達(dá)的降低，同時(shí)凋亡相關(guān)蛋白BAX蛋白表達(dá)升高，而BCL-2的表達(dá)下降。以上結(jié)果表明，下調(diào)PFKFB3的表達(dá)之后，胃癌細(xì)胞周期阻滯于G1期并促進(jìn)其凋亡（圖3）。

2.4 PFKFB3通過影響磷酸化PI3K/AKT進(jìn)而調(diào)控胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)

研究表明，PFKFB3可通過磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）通路調(diào)控細(xì)胞的生物活性［9］，我們進(jìn)一步分析了PFKFB3-PI3K/AKT通路在調(diào)控胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用。結(jié)果表明，下調(diào)胃癌細(xì)胞中PFKFB3的表達(dá)水平，總PI3K/AKT并不改變，而磷酸化PI3K/AKT卻隨之降低（圖4A）。進(jìn)一步在過表達(dá)PFKFB3的胃癌細(xì)胞中加入PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑LY294002，Western blot檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，PI3K/AKT信號(hào)通路被抑制（圖4B）。過表達(dá)PFKFB3后其生長(zhǎng)顯著增強(qiáng)，然而在過表達(dá)PFKFB3胃癌細(xì)胞中抑制PI3K/AKT信號(hào)通路后其生長(zhǎng)明顯被抑制（圖4C，P＜0.05）。由此可見，PFKFB3可能通過影響磷酸化PI3K/AKT進(jìn)而調(diào)控胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

圖2 下調(diào)PFKFB3的表達(dá)抑制胃癌的生長(zhǎng)Fig.2 Down-regulation of PFKFB3 expression inhibited gastric cancer growth

圖3 下調(diào)PFKFB3的表達(dá)后胃癌細(xì)胞周期阻滯于G1期并促進(jìn)其凋亡Fig.3 Gastric cancer cell cycle arrests in G1phase and apoptosis increased after down-regulating PFKFB3 expression

圖4 PFKFB3通過激活磷酸化PI3K/AKT信號(hào)通路進(jìn)而調(diào)控胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)Fig.4 PFKFB3 regulated the growth of gastric cancer cells by activating the phosphorylated PI3K/AKT signaling pathway

3 討 論

胃癌仍然是當(dāng)今世界上常見的腫瘤之一，由于當(dāng)前還缺乏敏感性及特異性靶點(diǎn)，其5年生存率依舊很低［10］。在胃癌新型化療藥物及免疫治療取得重大突破之前，亟待尋找特異性靶點(diǎn)，為胃癌的靶向治療提供更多線索。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中涉及到很多遺傳及表觀遺傳學(xué)的改變，而胃癌的一個(gè)重要標(biāo)志是其代謝變化，主要包括氨基酸、核苷酸、脂質(zhì)及糖酵解途徑等。有氧糖酵解其特征是消耗葡萄糖并導(dǎo)致乳酸堆積。一方面，腫瘤中乳酸的堆積導(dǎo)致糖酵解限速酶磷酸果糖激酶-1（phosphofructokinase-1，PFK-1）表達(dá)，進(jìn)一步抑制細(xì)胞凋亡及促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移發(fā)生。另一方面，大量的糖酵解產(chǎn)物又可以驅(qū)動(dòng)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［11］。因此，闡明腫瘤中的好氧糖酵解發(fā)生過程，將可能為胃癌提供一種新的有效的治療策略。PFKFB3作為糖酵解的關(guān)鍵限速酶，在多種癌癥中高表達(dá)，Peng等［9］報(bào)道在乳腺癌中PFKFB3高表達(dá)，沉默乳腺癌細(xì)胞中PFKFB3的表達(dá)能顯著抑制其生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移；Li等［12］也證實(shí)了PFKFB3在肺癌中高表達(dá)，且與肺癌患者預(yù)后密切相關(guān)；此外，Deng等［13］也證實(shí)骨肉瘤中PFKFB3高表達(dá)，且PFKFB3的表達(dá)與骨肉瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移相關(guān)。在機(jī)制方面研究報(bào)道腫瘤中PTEN的缺失、RAS及AKT的激活會(huì)增加糖酵解中的限速酶PFKFB3的活性［14］。另外PFKFB3作為PFK-1的激活劑，其升高能夠促進(jìn)PFK-1的活性，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞攝取的葡萄糖迅速進(jìn)行糖酵解，從而為腫瘤的生長(zhǎng)提供充足能量；其次PFKFB3對(duì)于含有Ras轉(zhuǎn)化細(xì)胞的腫瘤的生長(zhǎng)十分重要，能夠促進(jìn)正常的血管生成和腫瘤的生長(zhǎng)，并加速腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［15-16］。也有研究證實(shí)，缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）和P38/MK2信號(hào)通路的激活及PFKFB3第461位點(diǎn)絲氨酸的磷酸化可使其表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的增殖［12］。本研究檢測(cè)了胃癌患者PFKFB3的表達(dá)，并通過研究證實(shí)了PFKFB3在胃癌中高表達(dá)，進(jìn)一步研究表明下調(diào)胃癌細(xì)胞中PFKFB3的表達(dá)后，其生長(zhǎng)能力顯著被抑制，而凋亡明顯上升，且細(xì)胞周期于G1期阻滯，表明PFKFB3通過影響磷酸化PI3K/AKT信號(hào)通路進(jìn)而調(diào)控胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。由此，PFKFB3可能是胃癌潛在的生物標(biāo)志物。

綜上，本研究分析了PFKFB3在胃癌中的表達(dá)，并闡述了其對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響及機(jī)制，可望為胃癌的生物靶向治療提供新的線索。