吳 濤,穆曉清,聶 堯,徐 巖

(1.江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室,無錫 214122;2.宿遷市江南大學產業(yè)技術研究院,宿遷 223800)

光學純(R)-α-苯乙胺是合成治療阿爾茨海默病藥物利凡斯的明(Rivastigmine)的手性砌塊[1,2],也是一種有機酸類手性拆分試劑和性能優(yōu)良的手性助劑[3],在工業(yè)上具有廣闊的應用前景.(R)-α-苯乙胺的工業(yè)化生產大多采用金屬催化苯乙酮直接還原胺化[4]、 偶聯(lián)α-苯乙胺的動力學拆分[5,6]或烯胺的不對稱氫化[7]等化學方法.但化學法存在環(huán)境污染嚴重、 副產物多、 產物提純復雜及催化劑回收困難等缺陷.與化學法合成(R)-α-苯乙胺不同,以脂肪酶[8,9]、 環(huán)己胺氧化酶[10]、 轉氨酶[11,12]及胺脫氫酶(AmDH)[13,14]為代表的生物合成途徑具有反應條件溫和、 原料易得及環(huán)境友好等優(yōu)點.其中,脂肪酶和環(huán)己胺氧化酶催化的手性拆分需要以外消旋α-苯乙胺為原料,生產成本較高且步驟繁雜; 轉氨酶催化的轉氨反應需要添加過量的有機胺或氨基酸作為氨基供體,且存在底物抑制和反應平衡的問題,工業(yè)應用難度大.采用AmDH催化以潛手性酮和游離氨為底物的不對稱還原反應合成手性胺的路線具有綠色高效、 成本低及產物光學純度高的優(yōu)點[13～16],是手性胺合成最理想的反應之一.但目前發(fā)現(xiàn)的AmDH種類極少且底物譜窄[17,18],嚴重限制了其工業(yè)應用.

2012年,Bommarius等[19]首次以源于Bacillusstearothermophilus的亮氨酸脫氫酶(BsLeuDH)為模板進行活性中心2個高度保守氨基酸的突變(K68S/N261L),將亮氨酸脫氫酶轉變成AmDH,開發(fā)了手性胺合成的新途徑,但制得的BsAmDH對苯乙酮的比活力僅為58.8 U/g(20 mmol/L).Xu等[20]在源于Exiguobacteriumsibiricum的亮氨酸脫氫酶(EsLeuDH)的活性中心引入相同的雙突變制得的EsAmDH(K77S/N270L)對苯乙酮的比活力達到98.5 U/g(20 mmol/L,30 ℃).Gr?ger等[21]以EsAmDH為催化劑合成了(R)-α-苯乙胺,雖然在20,50和100 mmol/L的底物濃度下,產物(R)-α-苯乙胺的對映體過量(e.e.)值可達到99%,但當?shù)孜餄舛葹?00 mmol/L時,底物苯乙酮的轉化率僅為43%,距離工業(yè)應用差距較大.酶對苯乙酮的催化效率低是現(xiàn)階段限制(R)-α-苯乙胺高效制備的主要因素,雖然目前關于AmDH的分子改造已有報道,但主要集中在拓展酶的底物譜[22,23],鮮見關于提高苯乙酮催化效率的報道.

本文在源于Bacilluscereus的亮氨酸脫氫酶(BcLeuDH)的催化活性中心引入雙突變K70S/N263L,制備了對苯乙酮還原反應具有催化活性的AmDH出發(fā)菌株BcAmDH,并利用高效的迭代飽和突變策略對BcAmDH底物結合口袋附近的氨基酸殘基進行分子改造,通過高通量篩選獲得了對苯乙酮還原反應催化效率顯著提高的優(yōu)勢突變株,為(R)-α-苯乙胺的工業(yè)合成奠定了基礎.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、 三羥甲基氨基甲烷(Tris)及咪唑購自上海生工生物工程技術有限公司; 卡那霉素和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)購于上海索萊寶生物科技有限公司; 苯乙酮、 (R)-α-苯乙胺及(S)-α-苯乙胺購自上海麥克林生化科技有限公司; 其它試劑購自國藥集團化學試劑有限公司; 所用試劑均為分析純.引物合成和質粒測序由無錫天霖生物科技有限公司完成.胺脫氫酶(AmDH)重組表達菌株EscherichiacoliBL21(DE3)/pET-28a-amdh由本實驗室構建并保藏.

C1000 Touch型基因擴增(PCR)儀,美國Bio-Rad公司; VCX750型超聲破碎儀,美國Sonic公司; Qpix420型高通量菌落挑選儀,美國Molecular Devices公司; Cytation 3型酶標儀,美國BioTek公司; 7890B型氣相色譜儀,美國Agilent公司.

1.2 實驗過程

1.2.1 同源建模和分子對接 選擇源于Geobacillusstearothermophilus的亮氨酸脫氫酶GcLeuDH(PDB登錄號: 6ACF; 分辨率0.3 nm; 序列一致性81.3%)的晶體結構為模板[24],運用Swiss-Model服務器(http://swissmodel.expasy.org)建立了AmDH的三維模型,并用Structure Assessment工具對所建模型進行評估[25].從PubChem網(wǎng)站(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得苯乙酮的三維結構,用AutoDock軟件進行分子對接,用PyMOL軟件選擇最佳的對接結果并分析復合物的三維模型.通過HotSpot服務器(http://loschmidt.chemi.muni.cz/hotspotwizard/)預測BcAmDH的“熱點”氨基酸[26],利用CASTp工具(https://omictools.com/castp-tool)測量酶底物結合口袋的體積[27].

1.2.2 飽和突變文庫的構建和篩選 設計含有簡并密碼子NNK(N=A/T/C/G,K=G/T)的引物,以重組質粒pET-28a-amdh為模板,利用全質粒聚合酶鏈式反應(PCR)方法(PCR反應條件: 98 ℃變性60 s; 98 ℃預變性30 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸7 min,30個循環(huán); 72 ℃充分延伸5 min; 16 ℃保存)進行飽和突變以構建突變文庫.挑取轉化子接種到含有200 μL Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基的96淺孔板中,于37 ℃,200 r/min條件下培養(yǎng)8 h后,轉接至含有1 mL LB液體培養(yǎng)基的96深孔板中,繼續(xù)于37 ℃,200 r/min條件下培養(yǎng)3 h至OD600為0.6～0.8; 向培養(yǎng)基中添加終濃度為0.2 mmol/L的IPTG,于20 ℃,200 r/min條件下誘導培養(yǎng)12 h; 向轉接后的96淺孔板中加入終體積分數(shù)為15%的甘油,于-80 ℃下保藏備用; 將96深孔板于4 ℃,4500 r/min轉速下離心10 min收集菌體,并用質量分數(shù)為0.9%的生理鹽水洗滌2次,向96深孔板中加入500 μL含有終濃度為5 mmol/L苯乙酮的NH4Cl/NH4OH緩沖液(pH=9.5,1 mol/L)重懸浮菌體,于30 ℃,200 r/min條件下反應2 h; 反應液于4 ℃,4500 r/min轉速下離心10 min,取100 μL上層清液置于96孔細胞培養(yǎng)板中,加入50 μL 2,4-二硝基苯肼溶液(5 mmol/L)和50 μL NaOH溶液(10 mol/L)顯色30 min,用酶標儀測定顯色液在530 nm處的吸光值,選取OD530值低于BcAmDH的轉化子進行測序及活力測定.

1.2.3 蛋白純化 將細胞重懸于緩沖液A(100 mmol/L Tris+150 mmol/L NaCl+20 mmol/L咪唑,pH=7.5)中并進行超聲破碎,將破碎液于4 ℃,12000 r/min轉速下離心30 min; 上層清液用0.22 μm水系濾膜過濾后,緩慢上樣至Ni-Nitrilotriacetic acid(Ni-NTA)親和層析柱; 加樣完畢,先用緩沖液A洗滌,再用緩沖液B(100 mmol/L Tris+150 mmol/L NaCl+500 mmol/L咪唑,pH=7.5)進行梯度洗脫,將收集目的蛋白并進行蛋白凝膠電泳(圖S1,見本文支持信息).目的蛋白用超濾管脫鹽濃縮,并添加終體積分數(shù)為20%的甘油,于-80 ℃下保存?zhèn)溆?

1.2.4 酶活力和動力學參數(shù)測定 酶活力測定體系總體積為200 μL,包括NH4Cl/NH4OH(pH=9.5,1 mol/L)、 苯乙酮(20 mmol/L)、 NADH(0.2 mmol/L)及適量純酶液,檢測340 nm處的吸光值變化.酶活力單位(U)定義: 在上述條件下,每分鐘催化氧化1 μmol NADH的酶活力; 酶比活力(U/g)定義: 每克酶蛋白所含的酶活力單位數(shù).分別在苯乙酮和NADH終濃度為0.5～50.0 mmol/L和0.01～0.2 mmol/L范圍內進行活力測定,利用Origin軟件中公式Y=VmaxX/(Km+X)進行非線性擬合[式中:Y(U/g)為酶比活力;X(mmol/L)為底物濃度],計算酶動力學常數(shù)(Km,mmol·L-1;kcat,min-1)及催化效率(kcat/Km,L·min-1·mmol-1).

1.2.5 苯乙酮的不對稱還原反應 反應體系總體積為2 mL,包括BcAmDH或突變株純酶液(1 mg/mL)、 葡萄糖脫氫酶(1.2 mg/mL)、 苯乙酮(100～300 mmol/L)、 葡萄糖(120～360 mmol/L)、 NAD+(1 mmol/L)、 二甲基亞砜(體積分數(shù)20%)和NH4Cl/NH4OH緩沖液(pH=9.5,1 mol/L).反應體系于30 ℃,200 r/min條件下反應,定時取樣用NaOH溶液(200 μL,10 mmol/L)淬滅,用甲基叔丁基醚(1 mL)萃取2次.取1 mL萃取液用氣相色譜測定苯乙酮轉化率,色譜條件: Grace Econo-Cap EC-WAX+色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),柱溫程序: 起始溫度90 ℃,以20 ℃/min速率升溫至160 ℃,保持2 min; 再以10 ℃/min速率升溫至200 ℃,保持2 min.另取1 mL萃取液,加入5 mg 4-二甲氨基吡啶和100 μL乙酸酐,于30 ℃,200 r/min條件下衍生化12 h,加入500 μL水淬滅反應; 利用氣相色譜測定不對稱還原反應產物的構型及其e.e.值,色譜條件: Agilent J&W CP-Chiralsil-DEX CB色譜柱(25 m×0.32 mm×0.25 μm),柱溫程序: 起始溫度100 ℃,以5 ℃/min速率升溫至200 ℃.

2 結果與討論

2.1 飽和突變位點的選擇

利用定點突變引物(表S1,見本文支持信息)在源于Bacilluscereus的亮氨酸脫氫酶的催化活性中心引入雙突變K70S/N263L,制備了對苯乙酮催化比活力為90.83 U/g(20 mmol/L,30 ℃)的AmDH出發(fā)菌株BcAmDH.

Fig.1 3D structure of GcLeuDH and BcAmDH(A) and distribution of selected amino acid(B) 3D structure of GcLeuDH and BcAmDH are shown as cyan and green cartoon,respectively.The eight selected amino acid residues(L42,G43,M67,A115,E116,T136,V293,V296) and the two residues initially mutated to generate AmDH activity(S70,L263) are shown as green and yellow sticks,respectively.

位于酶底物結合口袋附近的氨基酸突變通常會在一定程度上影響酶的空間結構、 電荷分布及疏水性,從而影響酶的催化活性、 底物專一性及熱穩(wěn)定性等催化特性[28,29].選取與BcAmDH蛋白序列一致性為81.3%的GcLeuDH的晶體結構為模板建立了BcAmDH的三維模型[24][圖1(A)],并將底物苯乙酮對接到建立好的三維模型中[25].分析對接結果發(fā)現(xiàn),以苯乙酮為中心0.4 nm范圍內有6個氨基酸殘基(G43,G44,M67,K82,A115和V293).其中,K82為BcAmDH催化活性中心,G44與底物羰基形成氫鍵,故選擇其余4個殘基作為飽和突變的位點.而距離苯乙酮0.4～0.6 nm范圍內共有12個氨基酸殘基(L42,T45,R46,L63,A81,T83,E116,D117,T136,L263,G292和V296).考慮到此范圍內殘基個數(shù)較多,為了提高篩選效率,進一步對BcAmDH進行基于氨基酸保守性和理化性質分析的“熱點”氨基酸預測[26],發(fā)現(xiàn)12個氨基酸中有4個(L42,E116,T136和V296)為“熱點”氨基酸.綜上,共選擇L42,G43,M67,A115,E116,T136,V293和V296[圖1(B)]8個氨基酸殘基進行飽和突變,考察其對苯乙酮還原催化效率的影響.

2.2 正向突變位點的篩選

利用含有簡并密碼子的引物(表S1,見本文支持信息)進行定點飽和突變以構建突變文庫,獲得了庫容約800株的突變文庫.采用基于底物苯乙酮顯色反應的高通量篩選方法[30],對所有突變株進行全細胞催化和高通量篩選,在116,136和293位的飽和突變文庫中共獲得了9株陽性突變株,而在其余5個位點的突變文庫中未見陽性突變(圖2).

Fig.2 High-throughput screening results of site-directed saturation mutagenesis library(A) and color-rendering results of 116-site saturation mutagenesis library(B) Color-rendering results of BcAmDH and positive mutants are shown in black rectangle and red circle,respectively.

對9株陽性突變株進行了測序分析,結果表明出現(xiàn)6種不同類型的突變.其中,116位出現(xiàn)E116L,E116C和E116V 3種陽性突變類型,136位出現(xiàn)T136G和T136M 2種陽性突變類型,293位僅出現(xiàn)V293A 1種陽性突變類型,所有突變對酶的可溶性表達均未產生明顯的不利影響[圖3(A)].不同突變株純酶液對苯乙酮的活性測定結果 [圖3(B)] 表明,V293A突變株對苯乙酮的比活力提高幅度最大,與BcAmDH相比提高了124%; T136G和T136M突變株的比活力與BcAmDH相比分別提高了109%和49%; E116L,E116C及E116V突變株的比活力比BcAmDH分別提高了40%,67%和82%.

Fig.3 SDS-PAGE analysis(A) and relative activity(B) of positive mutants obtained by site-directed saturation mutagenesis (A) M: low molecular protein marker; lane 1—7 represent crude enzyme for BcAmDH,V293A,T136G,T136M,E116L,E116C and E116V,respectively.(B) 1.BcAmDH; 2.V293A; 3.T136G; 4.T136M; 5.E116L; 6.E116C; 7.E116V.

2.3 迭代飽和突變策略的應用

為了進一步提高酶對苯乙酮的催化活性,選擇對3個正向突變位點(116,136和293)進行組合突變.考慮到若將3個位點獲得的陽性突變株直接進行組合突變,則可能會遺漏各位點相互作用而產生的新突變類型,同時無法避免其相互作用而產生的負面影響; 若對3個位點進行隨機組合突變,當篩選覆蓋率達到95%時,需篩選超過90000株轉化子,即便選用NDT(N=A/T/C/G,D=A/T/G)密碼子,也需篩選大約5200株轉化子[31].迭代飽和突變策略是一種按照預先設定的迭代順序,在每一輪獲得的優(yōu)勢突變株的基礎上疊加下一輪的飽和突變,經(jīng)過多次疊加獲得性能最優(yōu)突變株的組合突變方法[32].采用迭代飽和突變對3個位點進行組合突變時,僅需篩選282個轉化子即可達到95%的覆蓋率[31],可大幅度降低篩選工作量,同時能夠有效避免直接組合突變帶來的遺漏和負面影響,因此采用迭代飽和突變策略對3個正向突變位點進行組合突變.

Fig.4 Relative activity of positive mutants obtained by iterative saturation mutagenesis a.BcAmDH; b.V293A; c.V293A/E116V; d.V293A/E116C; e.V293A/E116K; f.V293A/E116V/T136S; g.V293A/E116V/T136C.

基于陽性突變株V293A對苯乙酮的活力提高幅度最大,故選擇其作為第一輪迭代飽和突變的模板.由于從116位的飽和突變文庫中篩選到多達3個陽性突變株,推測疊加116位的突變后出現(xiàn)陽性突變株的概率較大,首先選擇在V293A突變株上疊加116位的飽和突變.經(jīng)過篩選得到3株陽性突變株V293A/E116V,V293A/E116C和V293A/E116K,其中突變株V293A/E116V對苯乙酮的比活力為352.44 U/g,與BcAmDH相比提高了288%.隨后將突變株V293A/E116V作為第二輪迭代飽和突變的模板,疊加136位的飽和突變.經(jīng)過篩選得到2株陽性突變株V293A/E116V/T136S和V293A/E116V/T136C,最優(yōu)突變株V293A/E116V/T136S對苯乙酮的比活力達到661.26 U/g,與BcAmDH相比提高了628%(圖4).在2輪迭代飽和突變文庫中均篩選到了陽性突變株,且出現(xiàn)了定點飽和突變文庫中未出現(xiàn)的突變類型(E116K,T136S和T136C),進一步證明了迭代飽和突變策略在組合突變中的實用性和有效性.

測定了BcAmDH及其突變株對底物苯乙酮和輔酶NADH的動力學參數(shù).由表1可見,與BcAmDH相比,V293A突變株對底物苯乙酮的親和力(Km)略有提高,但同時其轉換數(shù)(kcat)提高了172%,說明V293A突變株更傾向于提高酶轉化底物的速率,從而改善酶的催化效率(kcat/Km).V293A/E116V和V293A/E116V/T136S突變株對底物的親和力與BcAmDH相當,但在V293A突變株的基礎上進一步加快了酶轉化底物的速率,從而導致其催化效率與BcAmDH相比分別提高了358%和719%.此外,3株突變株對輔酶NADH的催化效率均有一定程度的改善,與BcAmDH相比分別提高了78%,262%和393%.

Table 1 Kinetic parameters of BcAmDH and three mutants

2.4 關鍵突變的分析

基于同源建模建立了突變株V293A/E116V/T136S的三維模型[25],并將底物苯乙酮對接到建好的三維模型中[26].比較突變前后的對接結果[圖5(A)]發(fā)現(xiàn),底物苯乙酮與突變酶分子之間未形成額外的氫鍵作用力,但突變酶底物結合口袋附近的空間構型發(fā)生了輕微改變.293位的纈氨酸V位于底物結合口袋附近的α-Helix上,且與底物苯乙酮側鏈苯環(huán)距離較近[圖5(B)和 (C)],占據(jù)了底物結合口袋的空間,可能會形成空間位阻.當BcAmDH菌株293位的纈氨酸V突變成體積較小的丙氨酸A時[圖5(D)],底物結合口袋的體積與BcAmDH相比擴大了0.0224 nm3[27],使得空間位阻減小,提高了其對苯環(huán)的接受度,導致酶轉化底物的速率加快,V293A突變株對苯乙酮的的催化效率增大.116位谷氨酸E和136位蘇氨酸T位于底物進出通道處的Loop上[圖5(B)和(E)],通道的構型決定了底物到達酶催化活性中心的難易程度,通常認為比較開闊的通道有利于底物和產物的運輸[33,34].當谷氨酸E和蘇氨酸T分別突變成纈氨酸V和絲氨酸S后,其側鏈長度均有一定程度的減小,導致底物進出通道明顯增大[圖5(F)],推測E116V和T136S突變使苯乙酮更容易進入到酶催化活性中心,導致酶轉化底物的速率進一步加快,V293A/E116V和V293A/E116V/T136S突變株的催化效率逐步提高.

Fig.5 Molecular docking results of BcAmDH and mutant V293A/E116V/T136S with acetophenone (A) Molecular docking results of BcAmDH and mutant V293A/E116V/T136S with acetophenone,3D structures of BcAmDH and mutant V293A/E116V/T136S are shown as green and white surface,116,136 and 293 are the numbering of amino acid residues; (B) molecular docking results of BcAmDH and mutant V293A/E116V/T136S with acetophenone,3D structures of BcAmDHand mutant V293A/E116V/T136S are shown as green and white cartoon,E116V,T136S and V293A refer to mutation results; molecular docking results of BcAmDH(C) and mutant V293A/E116V/T136S with acetophenon(D),showing the effect of V293A mutation near the substrate side chain phenyl group on the shape of the substrate binding pocket; molecular docking results of BcAmDH(E) and mutant V293A/E116V/T136S with acetophenon(F),showing the effect of E116V and T136S mutations at the substrate entry channel on the shape of the substrate binding pocket.The substrate acetophenone is shown as green sticks with BcAmDH and white sticks with mutant V293A/E116V/T136S.

2.5 苯乙酮的不對稱還原胺化

Fig.6 Time course of asymmetric reduction of acetophenone with different concentrations by BcAmDH and mutant V293A/E116V/T136S a.100 mmol/L Acetophenone with BcAmDH; b.100 mmol/L acetophenone with V293A/E116V/T136S; c.200 mmol/L acetophenone with V293A/E116V/T136S; d.300 mmol/L acetophenone with V293A/E116V/T136S.

考察了不同底物濃度下BcAmDH和突變株V293A/E116V/T136S作為生物催化劑對不對稱還原苯乙酮反應的催化效率.由圖6可見,在100 mmol/L底物濃度下,BcAmDH催化反應18 h時苯乙酮轉化率為32.1%,48 h時的最終轉化率為42.1%; 而突變株V293A/E116V/T136S催化反應18 h時苯乙酮的轉化率即達到99.3%,48 h時的最終轉化率可達到99.9%,遠高于BcAmDH和文獻[21]報道值43%(EsAmDH).突變株V293A/E116V/T136S的比轉化速率由1.4 mmol/h提高到5.5 mmol/h.當?shù)孜锉揭彝獫舛仍黾拥?00和300 mmol/L時,突變株V293A/E116V/T136S催化反應48 h時的最終轉化率分別達到92.3%和80.2%,且不對稱還原反應產物(R)-α-苯乙胺的e.e.值為99%(圖S2,見本文支持信息),表明突變株V293A/E116V/T136S在較高的底物濃度下仍可以保持高催化效率和優(yōu)異的立體選擇性,顯示出其在不對稱還原苯乙酮制備(R)-α-苯乙胺過程中的應用潛力.

3 結 論

針對AmDH出發(fā)菌株BcAmDH在不對稱還原苯乙酮制備(R)-α-苯乙胺過程中酶催化效率低的不足,采用半理性設計對其進行分子改造.利用同源建模法建立了其三維模型并與底物苯乙酮進行分子對接,通過距離原則和“熱點”氨基酸預測篩選出8個氨基酸殘基進行單點飽和突變,采用基于底物苯乙酮顯色的高通量篩選方法獲得了3個正向突變位點.進一步采用迭代飽和突變策略對3個正向突變位點進行組合突變,獲得的最優(yōu)突變株V293A/E116V/T136S對苯乙酮還原反應(20 mmol/L,30 ℃)的催化活力和催化效率達到661.26 U/g和2.54 L·min-1·mmol-1,與BcAmDH相比分別提高了628%和719%.使用此突變株催化苯乙酮的不對稱還原反應,在100,200和300 mmol/L底物濃度下,轉化率分別達到99.9%,92.3%和80.2%,遠高于BcAmDH,表明其在不對稱合成(R)-α-苯乙胺的過程中具有潛在的應用價值.分子對接結果表明,突變株底物結合口袋的空間位阻減小和底物進出通道的擴大是催化效率提高的主要原因.

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20190621.