何月賢，宋文秀，張麗梅，謝炳龍

遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬(珠海)醫(yī)院，廣東珠海 519100

呼吸道合胞病毒(RSV)是導(dǎo)致毛細(xì)支氣管炎最常見(jiàn)的病原體，RSV感染致毛細(xì)支氣管炎病情嚴(yán)重程度不等，輕者經(jīng)抗感染及對(duì)癥治療后緩解，嚴(yán)重者可致肺氣腫、呼吸衰竭甚至危及患兒生命[1]。文獻(xiàn)[2]報(bào)道，超過(guò)1/3的患兒因治療不及時(shí)可繼發(fā)為支氣管哮喘、喘息等，給患兒及家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。早期診斷RSV感染致毛細(xì)支氣管炎并評(píng)估病情嚴(yán)重性，對(duì)臨床制定針對(duì)性治療方案具有重要意義，同時(shí)也為臨床預(yù)測(cè)喘息發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，并采取相關(guān)干預(yù)措施提供指導(dǎo)。RSV感染致毛細(xì)支氣管炎屬炎癥反應(yīng)性疾病，炎癥細(xì)胞及其分泌的炎性細(xì)胞因子作用的炎癥反應(yīng)貫穿整個(gè)發(fā)病過(guò)程[3,4]。Toll樣受體-4(TLR4)是由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等合成的跨膜受體蛋白，通過(guò)識(shí)別接頭蛋白介導(dǎo)了細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而激活天然免疫反應(yīng)。研究[5,6]發(fā)現(xiàn)，TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路還介導(dǎo)了病毒性心肌炎、哮喘等炎癥疾病的發(fā)病過(guò)程。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)廣泛存在于哺乳動(dòng)物的骨組織細(xì)胞及轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，介導(dǎo)了細(xì)胞增殖、分化、氧化應(yīng)激、組織修復(fù)等生理過(guò)程，同時(shí)通過(guò)誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的釋放而調(diào)節(jié)炎性免疫應(yīng)答[7,8]。目前，關(guān)于TLR4、TGF-β1在RSV感染致毛細(xì)支氣管炎發(fā)病過(guò)程中與炎癥反應(yīng)的關(guān)系研究較少。本研究通過(guò)檢測(cè)血清TLR4、TGF-β1，并探討其與RSV感染致毛細(xì)支氣管炎病情嚴(yán)重性的關(guān)系及對(duì)并發(fā)喘息的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2015年6月～2017年6月遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬(珠海)醫(yī)院收治的RSV感染致毛細(xì)支氣管炎患兒121例(觀察組)，男63例，女58例；年齡1個(gè)月～4歲，平均(10.32±4.16)個(gè)月；病程1～3(1.75±0.38)d。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患兒典型臨床癥狀如咳嗽、喘息癥狀、雙肺廣泛喘鳴音或濕啰音，結(jié)合影像學(xué)和實(shí)驗(yàn)室檢查等綜合確診為毛細(xì)支氣管炎，并符合《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》(第8版)中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；②鼻咽部標(biāo)本經(jīng)PCR檢查證實(shí)為RSV陽(yáng)性；③患兒發(fā)病至入院時(shí)間≤3 d；④納入研究前1個(gè)月未內(nèi)服用過(guò)糖皮質(zhì)激素、白三烯等可能影響本研究結(jié)果的藥物；⑤臨床資料完整，且發(fā)病后隨訪時(shí)間均超過(guò)2 a。排除標(biāo)準(zhǔn)：①心臟功能不全者以及肝腎功能障礙患兒；②急、慢性炎癥反應(yīng)性疾病患兒；③免疫性疾病患兒；④肺部畸形、先天性喉軟骨發(fā)育不全等出生缺陷患兒；⑤其他類型病原體感染或者有多種病原體混合感染的患兒；⑥納入研究前1個(gè)月內(nèi)有呼吸道感染史者；⑦惡性腫瘤患兒。參照《毛細(xì)支氣管炎診斷、治療與預(yù)防專家共識(shí)(2014年版)》分級(jí)方案[10]將觀察組患兒按照病情嚴(yán)重程度分級(jí)，其中輕度組59例，中度組38例，重度組24例。按照患兒發(fā)病后2年內(nèi)是否繼發(fā)為喘息分為兩組，喘息組31例，非喘息組90例。另選50例同期健康體檢兒童作對(duì)照(對(duì)照組)，男27例，女23例；年齡20 d～5歲，平均(11.85±3.63)個(gè)月。兩組一般資料無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有可比性。本研究得到醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，研究對(duì)象家屬在知情同意書(shū)上簽字。

1.2 血清TLR4、TGF-β1檢測(cè)方法 收集觀察組患兒入院當(dāng)日、健康體檢嬰幼兒體檢當(dāng)日肘靜脈血3 mL，將血液標(biāo)本于室溫下靜置1 h，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，離心半徑為12 cm，留取血清置于-70 ℃冰箱中，留待檢測(cè)。采用ELISA法檢測(cè)血清TLR4、TGF-β1，檢測(cè)儀器為芬蘭雷勃Thermo Multiskan FC全自動(dòng)酶標(biāo)儀，TLR4試劑盒由上海研吉生物科技有限公司提供，TGF-β1試劑盒由武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司提供，操作過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒上說(shuō)明進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 觀察組和對(duì)照組血清TLR4、TGF-β1水平比較 觀察組和對(duì)照組血清TLR4、TGF-β1水平比較見(jiàn)表1。

2.2 輕度組、中度組、重度組血清TLR4、TGF-β1水平比較 輕度組、中度組、重度組血清TLR4、TGF-β1水平比較見(jiàn)表2。

表1 觀察組和對(duì)照組血清TLR4、TGF-β1水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

表2 輕度組、中度組、重度組血清TLR4、TGF-β1水平比較

注：與輕度組比較，*P<0.05，與中度組比較，#P<0.05。

2.3 觀察組血清TLR4、TGF-β1水平與病情嚴(yán)重程度的關(guān)系 觀察組血清TLR4與TGF-β1呈正相關(guān)(r=0.672，P<0.05)；血清TLR4、TGF-β1與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)關(guān)系(rs=0.735、0.708，P均<0.05)。

2.4 喘息組和非喘息組血清TLR4、TGF-β1水平比較 喘息組和非喘息組血清TLR4、TGF-β1水平比較見(jiàn)表3。

表3 喘息組和非喘息組血清TLR4、TGF-β1水平比較

注：與非喘息組比較，*P<0.05。

2.5 血清TLR4、TGF-β1水平對(duì)RSV感染致毛細(xì)支氣管炎患兒繼發(fā)喘息的預(yù)測(cè)價(jià)值 血清TLR4水平預(yù)測(cè)RSV感染致毛細(xì)支氣管炎患兒繼發(fā)喘息的AUC為0.874(95%CI：0.819～0.9290)，約登指數(shù)0.69，最佳截?cái)嘀禐?8.49 ng/mL，靈敏度為0.79，特異度為0.85，準(zhǔn)確性為0.82；TGF-β1的AUC為0.905(95%CI：0.859～0.952)，約登指數(shù)為0.73，最佳截?cái)嘀禐?0.76 ng/mL，靈敏度為0.82，特異度為0.88，準(zhǔn)確性為0.86；TLR4聯(lián)合TGF-β1的AUC為0.925(95%CI：0.886～0.965)，約登陸指數(shù)為0.78,靈敏度為0.87，特異度為0.93，準(zhǔn)確性為0.89(詳見(jiàn)圖1)。

3 討論

RSV為單鏈RNA病毒，是引起嬰幼兒毛細(xì)支氣管炎最常見(jiàn)的病原體，由于嬰幼兒的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完善，極易多次反復(fù)感染，損傷肺功能，且患兒繼發(fā)喘息風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)高于普通兒童[11]。RSV感染致毛細(xì)支氣管炎病理改變包括毛細(xì)支氣管黏膜出現(xiàn)水腫且分泌量顯著增加，同時(shí)伴有上皮細(xì)胞脫落堵塞管腔，臨床癥狀主要有喘息、咳嗽、氣急以及低氧血癥等，患兒病情進(jìn)展迅速，治療不及時(shí)可危及患兒生命[12,13]。早期診斷及治療RSV感染致毛細(xì)支氣管炎，并盡可能降低喘息發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是臨床關(guān)注的重點(diǎn)。

圖1 血清TLR4、TGF-β1預(yù)測(cè)RSV感染致毛細(xì)支氣管炎患兒繼發(fā)喘息的ROC曲線

研究[14]表明，免疫功能失調(diào)、炎性細(xì)胞及其分泌的炎癥因子等介導(dǎo)了RSV感染致毛細(xì)支氣管炎發(fā)病過(guò)程。TLRs是在天然免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用的受體家族，在識(shí)別不同的接頭蛋白后可介導(dǎo)信號(hào)途徑而參與不同的免疫反應(yīng)，TLR4是屬于TLRs家族成員的I型跨膜蛋白，主要在細(xì)胞內(nèi)或者細(xì)胞表面表達(dá)。研究[15]顯示，TLR4通過(guò)特異度識(shí)別病原體細(xì)胞外的亮氨酸重復(fù)序列而將信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮免疫應(yīng)答反應(yīng)，最終發(fā)揮抗病毒作用。劉冬云等[16]證實(shí)，TLR4表達(dá)上調(diào)通過(guò)與熱休克蛋白結(jié)合可增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，促進(jìn)腫瘤壞死因子以及IL-6的合成，引起血管收縮和血壓升高，增加血管阻力損傷血管，同時(shí)還可促進(jìn)血管平滑肌增殖，引起血管重構(gòu)，損傷靶器官。馮等[17]發(fā)現(xiàn)，血紅素可使TLR4的MyD88/TRIF信號(hào)激活，進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生。TGF-β1是廣泛存在于嗜酸性粒細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等各種細(xì)胞中的促炎因子，通過(guò)介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)參與氣道疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[18]。研究[19]顯示，RSV感染后使無(wú)活性的TGF-β1激活并轉(zhuǎn)變成有活性TGF-β1，并進(jìn)一步激活TGF-β1Ⅰ型及Ⅱ型受體，通過(guò)磷酸化作用激活依賴Smad信號(hào)通路并與CoSmad及Smad4結(jié)合，形成異源四聚體復(fù)合物進(jìn)入到細(xì)胞核中，通過(guò)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)Th/Treg細(xì)胞所致的免疫反應(yīng)。Wang等[20]認(rèn)為，TGF-β1通過(guò)激活并趨化炎癥細(xì)胞因子而在喘息中發(fā)揮免疫炎癥反應(yīng)。于永鵬[21]發(fā)現(xiàn)，TGF-β1通過(guò)介導(dǎo)氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)元變性，進(jìn)而參與帕金森病的發(fā)病過(guò)程。

本研究顯示，觀察組TLR4、TGF-β1水平高于對(duì)照組，并由此推斷TLR4、TGF-β1參與了RSV感染致毛細(xì)支氣管炎的發(fā)病過(guò)程，可能的機(jī)制是RSV感染后其包膜融合蛋白與宿主細(xì)胞融合并形成融合體，引起毛細(xì)支氣管分泌有活性的模式識(shí)別受體TLR4，進(jìn)而介導(dǎo)天然免疫應(yīng)答反應(yīng)以增加呼吸道對(duì)入侵病原體的敏感性，以達(dá)到清除病原體的效果[22]；RSV感染毛細(xì)支氣管后，促使炎癥細(xì)胞釋放大量炎性細(xì)胞因子而發(fā)生炎癥反應(yīng)，與此同時(shí)炎癥反應(yīng)還促使內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞釋放促炎因子TGF-β1，TGF-β1在依賴Smads蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控下，誘導(dǎo)Treg/Th17比例失衡，加重RSV感染致毛細(xì)支氣管炎。本文結(jié)果還顯示，隨著病情逐步加重，血清TLR4、TGF-β1逐漸升高，提示兩指標(biāo)可反映RSV感染致毛細(xì)支氣管炎病情嚴(yán)重性，早期檢測(cè)可輔助臨床評(píng)估病情嚴(yán)重程度，從而指導(dǎo)臨床制定針對(duì)性干預(yù)方案改善患兒病情。而RSV感染致毛細(xì)支氣管炎患兒血清TLR4與TGF-β1呈正相關(guān)，提示兩指標(biāo)可能通過(guò)協(xié)同作用促進(jìn)病情發(fā)生及進(jìn)展，但機(jī)制有待進(jìn)一步探討。本研究還顯示，血清TLR4、TGF-β1與病程嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，可能是因?yàn)門LR4與TGF-β1水平越高說(shuō)明患兒免疫應(yīng)答反應(yīng)及炎癥反應(yīng)越嚴(yán)重，病情也不斷加重。RSV感染致毛細(xì)支氣管炎患兒治療不及時(shí)可繼發(fā)為喘息，加重患兒病情，預(yù)后較差。本研究結(jié)果顯示，繼發(fā)喘息的患兒血清TLR4、TGF-β1水平更高，兩指標(biāo)對(duì)繼發(fā)哮喘具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，并且聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)價(jià)值更高。提示患兒入院時(shí)盡快檢測(cè)血清TLR4和TGF-β1，可作為預(yù)測(cè)繼發(fā)喘息發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的生化指標(biāo)。

總之，血清TLR4、TGF-β1表達(dá)上調(diào)通過(guò)介導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)和炎癥反應(yīng)而參與RSV感染致毛細(xì)支氣管炎發(fā)病過(guò)程，并與病情嚴(yán)重性密切相關(guān)，早期聯(lián)合檢測(cè)可作為預(yù)測(cè)患兒繼發(fā)喘息發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的潛在靶向指標(biāo)，從而指導(dǎo)臨床實(shí)踐。