于云祥，龔泰芳，劉小濤，柯文，李彬彬

十堰市太和醫(yī)院，湖北十堰 442000

成骨肉瘤簡稱為骨肉瘤，典型的骨肉瘤起源于骨內(nèi)，骨肉瘤具有惡性程度高、易復(fù)發(fā)等特點，研究骨肉瘤細(xì)胞生長機(jī)制對于骨肉瘤的治療具有重要意義[1]。腫瘤細(xì)胞惡性增殖與細(xì)胞周期紊亂和凋亡減少有關(guān)，而腫瘤細(xì)胞生長、凋亡和周期受到細(xì)胞內(nèi)癌基因和抑癌基因的調(diào)控作用[2]。三磷酸腺苷酶家族蛋白2(ATAD2)具有ATP結(jié)合位點和溴區(qū)功能結(jié)構(gòu)域，參與調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，是一種重要的細(xì)胞周期、生長和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控因子[3]。ATAD2在膠質(zhì)瘤、膽管癌、膀胱癌等多種腫瘤組織或細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為，與腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良密切相關(guān)[4～6]。近年研究[7]顯示，ATAD2在骨肉瘤組織中高表達(dá)，而對于其在骨肉瘤細(xì)胞生長中的作用尚不明確。2018年6月～2019年10月，我們觀察了轉(zhuǎn)染ATAD2 shRNA慢病毒載體對人骨肉瘤細(xì)胞生長、細(xì)胞周期和凋亡的作用，以期為研究骨肉瘤細(xì)胞惡性表型分子發(fā)生機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒及主要試劑 人骨肉瘤細(xì)胞株U2-OS、MG-63、SaOS-2購自上海名勁生物科技有限公司，人正常成骨細(xì)胞h FOB1.19購自武漢普諾賽生命科技有限公司。ATAD2 shRNA慢病毒載體和陰性對照慢病毒載體購自吉滿生物科技(上海)有限公司。剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(C-Caspase-3)抗體、ATAD2抗體購自美國Abcam公司；細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶2(CDK2)抗體、細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)抗體、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(C-Caspase-9)抗體購自北京百奧萊博科技有限公司；引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 骨肉瘤細(xì)胞株的選擇 采用定量即時聚合酶鏈鎖反應(yīng)法(qRT-PCR法)和蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blotting)檢測U2-OS、MG-63、SaOS-2、h FOB1.19細(xì)胞中ATAD2 mRNA、蛋白。U2-OS、MG-63、SaOS-2、h FOB1.19細(xì)胞中ATAD2 mRNA分別為2.98±0.30、1.75±0.16、2.14±0.25、1.00±0.11，ATAD2蛋白分別為0.36±0.04、0.22±0.04、0.28±0.02、0.13±0.02，U2-OS、MG-63、SaOS-2細(xì)胞與h FOB1.19細(xì)胞比較，U2-OS細(xì)胞與MG-63、SaOS-2細(xì)胞比較，P均<0.05。根據(jù)以上結(jié)果，選擇U2-OS細(xì)胞作為本研究的實驗細(xì)胞。

1.3 U2-OS細(xì)胞ATAD2 shRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染 將U2-OS細(xì)胞分為3組，U2-OS-shATAD2、U2-OS-shNC組分別轉(zhuǎn)染ATAD2 shRNA慢病毒載體、陰性對照慢病毒載體，U2-OS-wt組為沒有轉(zhuǎn)染慢病毒載體的U2-OS細(xì)胞。慢病毒轉(zhuǎn)染步驟：將細(xì)胞種植到24孔板中，細(xì)胞密度為40%時將上清吸除，添加感染復(fù)數(shù)(MOI)=20的慢病毒液，培養(yǎng)24 h后換液，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率高于90%可用于后續(xù)實驗。轉(zhuǎn)染后24 h，采用qRT-PCR法和Western blotting法檢測細(xì)胞中ATAD2 mRNA、蛋白。取轉(zhuǎn)染后24 h的U2-OS-wt、U2-OS-shNC、U2-OS-shATAD2細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.4 轉(zhuǎn)染ATAD2 shRNA慢病毒載體的U2-OS細(xì)胞增殖能力觀察 以細(xì)胞存活率和克隆形成數(shù)目表示細(xì)胞增殖能力。①細(xì)胞存活率：采用CCK8法。U2-OS-wt、U2-OS-shNC、U2-OS-shATAD2組細(xì)胞按照每孔3 000個細(xì)胞種植到96孔板中，在培養(yǎng)48 h以后，在每孔中添加10 μL的CCK8反應(yīng)液，放在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。檢測450 nm的吸光度值(A值)，并用空白孔調(diào)零，結(jié)果以細(xì)胞存活率表示。U2-OS-shNC、U2-OS-shATAD2組細(xì)胞存活率=(U2-OS-shNC/U2-OS-shATAD2組A值÷U2-OS-wt組A值)×100%。②細(xì)胞克隆形成數(shù)目：采用平板克隆實驗。用胰蛋白酶消化U2-OS-wt、U2-OS-shNC、U2-OS-shATAD2組細(xì)胞，離心后收集細(xì)胞沉淀，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。將單細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿內(nèi)，每個培養(yǎng)皿中接種300個細(xì)胞，放在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d換液1次，14 d后出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞克隆，添加磷酸緩沖鹽溶液(PBS),將細(xì)胞洗滌2次，用4%的多聚甲醛在室溫中孵育20 min，添加瑞姬氏復(fù)合染料，放在室溫中孵育8 min，經(jīng)清水沖洗以后，將≥50個細(xì)胞克隆團(tuán)記為1個細(xì)胞克隆，觀察計數(shù)各組細(xì)胞克隆形成數(shù)目，結(jié)果以細(xì)胞克隆形成數(shù)目表示。

1.5 轉(zhuǎn)染ATAD2 shRNA慢病毒載體的U2-OS細(xì)胞凋亡能力觀察 以細(xì)胞周期和凋亡率表示細(xì)胞凋亡能力。①細(xì)胞周期：采用碘化丙啶(PI)單染法。U2-OS-wt、U2-OS-shNC、U2-OS-shATAD2組細(xì)胞接種到6孔板中，細(xì)胞密度為80%時，用胰蛋白酶消化各組細(xì)胞，離心后收集細(xì)胞沉淀，用預(yù)冷后的乙醇(75%)將細(xì)胞懸浮以后，放在4 ℃孵育2 h。將固定好的細(xì)胞在室溫1 000 g離心10 min以后，PBS洗滌，添加500 μL的染色緩沖液，再添加25 μL的PI染液，放在37 ℃孵育30 min，置于低溫避光處保存，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化，結(jié)果以G1、S、G2期細(xì)胞所占百分比表示。②細(xì)胞凋亡率：采用膜聯(lián)蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)/PI雙染法。U2-OS-wt、U2-OS-shNC、U2-OS-shATAD2組細(xì)胞接種到6孔板中，細(xì)胞密度為80%時，用胰蛋白酶消化各組細(xì)胞，離心后收集細(xì)胞沉淀，添加500 μL的結(jié)合緩沖液，添加Annexin V-FITC和PI染液各5 μL，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡變化。結(jié)果以細(xì)胞凋亡率表示。

1.6 轉(zhuǎn)染ATAD2 shRNA慢病毒載體的U2-OS細(xì)胞C-Caspase-3、C-Caspase-9、CDK2、CyclinD1蛋白檢測 采用Western blotting法。U2-OS-wt、U2-OS-shNC、U2-OS-shATAD2組細(xì)胞接種到6孔板中，細(xì)胞密度為80%時，采用Western blotting法檢測細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白C-Caspase-3、C-Caspase-9和周期相關(guān)蛋白CDK2、CyclinD1。C-Caspase-3/C-Caspase-9/CDK2/CyclinD1蛋白相對表達(dá)量=C-Caspase-3/C-Caspase-9/CDK2/CyclinD1灰度值÷β-actin灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組U2-OS細(xì)胞ATAD2 mRNA、蛋白相對表達(dá)量比較 各組U2-OS細(xì)胞ATAD2 mRNA、蛋白相對表達(dá)量比較見表1。

表1 各組U2-OS細(xì)胞ATAD2 mRNA、蛋白相對表達(dá)量比較

注：與U2-OS-shNC、U2-OS-wt組比較，*P<0.05。

2.2 各組U2-OS細(xì)胞存活率和細(xì)胞克隆形成數(shù)目比較 各組U2-OS細(xì)胞存活率和細(xì)胞克隆形成數(shù)目比較見表2。

表2 各組U2-OS細(xì)胞存活率和克隆形成數(shù)目比較

注：與U2-OS-shNC、U2-OS-wt組比較，*P<0.05。

2.3 各組U2-OS細(xì)胞周期、凋亡率比較 各組U2-OS細(xì)胞周期、凋亡率比較見表3。

表3 各組U2-OS細(xì)胞周期、凋亡率比較

注：與U2-OS-shNC、U2-OS-wt組比較，*P<0.05。

2.4 各組U2-OS細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白C-Caspase-3、C-Caspase-9和周期相關(guān)蛋白CDK2、CyclinD1相對表達(dá)量比較 各組U2-OS細(xì)胞C-Caspase-3、C-Caspase-9、CDK2、CyclinD1蛋白相對表達(dá)量比較見表4。

表4 各組U2-OS細(xì)胞C-Caspase-3、C-Caspase-9、CDK2、CyclinD1蛋白相對表達(dá)量比較

注：與U2-OS-shNC、U2-OS-wt組比較，*P<0.05。

3 討論

骨肉瘤是青少年中最常見的原發(fā)性惡性骨癌，骨肉瘤多發(fā)生于長管狀骨的干骺端，如股骨遠(yuǎn)端、脛骨近端和肱骨近端，偶爾也發(fā)生在脊柱、骨盆和骶骨。多數(shù)患者為單發(fā)病灶，且發(fā)病初期無典型臨床癥狀，常見癥狀主要是局部疼痛和腫脹，偶爾伴有關(guān)節(jié)功能障礙[8]。雖然手術(shù)切除和化療等治療手段的進(jìn)步已使骨肉瘤患者的5年內(nèi)的存活率在60%～70%，但仍然不能滿足需求[9]。骨肉瘤細(xì)胞株MG-63、U2-OS、SaOS-2是常見的體外研究骨肉瘤的細(xì)胞模型[10]。我們的實驗探討了ATAD2在骨肉瘤細(xì)胞株MG-63、U2-OS、SaOS-2和人正常成骨細(xì)胞h FOB1.19中的表達(dá)化，選取了表達(dá)水平最高的U2-OS細(xì)胞作為實驗對象，以更為直觀的觀察ATAD2在骨肉瘤細(xì)胞增殖、克隆、周期和凋亡中的作用。

ATAD2基因編碼的蛋白質(zhì)中含有ATP酶、溴結(jié)構(gòu)域，參與調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，ATAD2在睪丸組織中高表達(dá)，而在其他正常組織中的表達(dá)水平極低，ATAD2參與細(xì)胞生長分化和組織發(fā)育[11]。ATAD2在胰腺癌、宮頸癌等組織中表達(dá)上調(diào)，其在腫瘤發(fā)生中扮演癌基因的作用，下調(diào)ATAD2抑制腫瘤細(xì)胞體外增殖和克隆形成能力，抑制腫瘤生長[11～13]。之前的研究[7]報道顯示，ATAD2在骨肉瘤組織樣本中表達(dá)升高，ATAD2可能是骨肉瘤發(fā)生和發(fā)展的促進(jìn)因子。本文結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染ATAD2 shRNA慢病毒載體后的骨肉瘤細(xì)胞體外增殖和克隆形成能力均下降，這與上述實驗報道結(jié)果一致，均說明ATAD2在骨肉瘤中發(fā)揮癌基因的作用。

細(xì)胞周期調(diào)控因子主要有Cyclins、CDK等，其中CDK是細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心，Cyclins能夠正調(diào)控CDK，Cyclin D1是一種原癌基因，主要作用于G1期向S期轉(zhuǎn)換[14～16]。CDK2是細(xì)胞周期中重要的正調(diào)控因子，其可以促進(jìn)細(xì)胞周期有序進(jìn)展[17]。目前研究顯示，ATAD2具有調(diào)控細(xì)胞周期影響細(xì)胞生長作用，轉(zhuǎn)染ATAD2能夠有效提高胃癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞等多種細(xì)胞G1期比例，下調(diào)細(xì)胞中Cyclin D1蛋白表達(dá)，阻礙細(xì)胞從G1期向S期發(fā)展[13,18]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行因子，其活化后能夠促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生不可逆的凋亡反應(yīng)，Caspase-9是Caspase凋亡反應(yīng)的上游啟動因子，其活化后能夠迅速激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)[19,20]。Shin等[21]發(fā)現(xiàn)，在肺癌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染ATAD2表達(dá)可激活肺癌細(xì)胞中Caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡。本研究顯示，轉(zhuǎn)染ATAD2 shRNA慢病毒載體后的骨肉瘤細(xì)胞G1期比例升高，細(xì)胞中Cyclin D1、CDK2蛋白表達(dá)水平降低，提示轉(zhuǎn)染ATAD2 shRNA慢病毒載體能夠下調(diào)細(xì)胞周期正調(diào)控因子Cyclin D1、CDK2的表達(dá)將骨肉瘤細(xì)胞周期阻滯在G1期，這證實了ATAD2在骨肉瘤細(xì)胞周期中的作用，說明下調(diào)其表達(dá)能夠阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，這與在胃癌等腫瘤中的研究結(jié)果一致[13,18]。本實驗還表明，轉(zhuǎn)染ATAD2 shRNA慢病毒載體后的骨肉瘤細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞中活化的Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)水平也升高，說明轉(zhuǎn)染ATAD2 shRNA慢病毒載體具有誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的作用。

總之，ATAD2在骨肉瘤細(xì)胞中高表達(dá)，轉(zhuǎn)染ATAD2 shRNA慢病毒載體能夠通過阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑制骨肉瘤細(xì)胞生長的作用，但目前對于ATAD2具體的靶向調(diào)控作用尚不清楚。