楊道麗，成元華，張亞娟，成元冬，龔靈

1貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽 550004；2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院；3貴州省腫瘤醫(yī)院

胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)是胃腸道最常見的間葉源性腫瘤，大多數(shù)病例存在CKIT基因或PDGFRA基因活化突變[1]。目前，針對GIST最有效的治療手段是根治性手術(shù)切除和分子靶向藥物治療，但完整手術(shù)切除的患者仍可能發(fā)生轉(zhuǎn)移[2]。對不能切除或復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的GIST患者，使用分子靶向藥物是首選的治療方法[3]，但易出現(xiàn)耐藥，使高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的患者難以獲得長期生存。96序列相似的家庭成員A(FAM96A)是廣泛表達(dá)且高度保守的小分子凋亡激活蛋白，F(xiàn)AM96B是小分子蛋白，兩者屬同源蛋白，約50%的序列相同，其肽鏈中間均為DUF59結(jié)構(gòu)域，含有該結(jié)構(gòu)域的蛋白可能與鐵硫簇蛋的白組裝及DNA修復(fù)等功能相關(guān)[4～6]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)家族是凋亡的重要調(diào)節(jié)因素，Caspase3作為Caspase家族中最關(guān)鍵的成員，是凋亡的執(zhí)行者，也是凋亡細(xì)胞Caspase級聯(lián)反應(yīng)必經(jīng)的共同通路[7,8]。細(xì)胞凋亡可以通過內(nèi)源性途徑和外源性途徑誘導(dǎo)[9]，其中內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑是線粒體介導(dǎo)的半胱天冬酶激活途徑，又稱線粒體通路。Schwamb等[10]首次提出FAM96A抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制可能與線粒體凋亡途徑有關(guān)，并且發(fā)揮該功能的區(qū)域?yàn)镕AM96A中的DUF59結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)AM96A基因缺失在GIST形成過程中起重要作用。FAM96B和FAM96A為同源蛋白，二者均含DUF59結(jié)構(gòu)域，推測FAM96B也與GIST的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，也可能通過線粒體凋亡途徑有效誘導(dǎo)GIST腫瘤細(xì)胞的凋亡，而Caspase3作為凋亡細(xì)胞Caspase級聯(lián)反應(yīng)必經(jīng)的共同通路。本研究觀察了GIST組織中FAM96A、FAM96B、Caspase3蛋白及FAM96A、FAM96B mRNA表達(dá)變化，旨在為進(jìn)一步了解GIST的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及探索新的治療方法提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年9月～2018年9月貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收治的GIST患者120例，男48例，女72例；年齡29～82歲，中位年齡59歲；年齡≤59歲71例，>59歲49例；腫瘤發(fā)生部位位于胃81例，腸31例，胃腸外8例；腫瘤直徑≤5 cm 56例，>5 cm 64例；核分裂像≤5/50 HPF 93例，>5/50HPF 27例；依據(jù)GIST核分裂像多少及腫瘤直徑進(jìn)行危險(xiǎn)度分級[11]，其中極低和低危險(xiǎn)度分級49例，中危險(xiǎn)度分級32例，高危險(xiǎn)度分級39例。手術(shù)留取GIST組織140例份(120例份用于免疫組化檢測、20例份用于RT-PCR檢測，分別記為腫瘤1組、腫瘤2組)和正常組織130例份(120例份用于免疫組化檢測、10例份用于RT-PCR檢測，分別計(jì)正常1組、正常2組)。

1.2 GIST組織中FAM96A、FAM96B、Caspase3蛋白檢測 采用免疫組化EnVision二步法。FAM96A、FAM96B、Caspase3抗體稀釋度分別為1∶800、1∶600及1∶500。FAM96A與FAM96B用檸檬酸鹽溶液(pH6.0)高溫高壓抗原修復(fù)，Caspase3用 EDTA(pH9.0)高溫高壓抗原修復(fù)；修復(fù)時間均為3 min。嚴(yán)格按照常規(guī)免疫組化方法染色，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，PBS代替一抗作為空白對照。FAM96A、FAM96B、Caspase3蛋白的陽性表達(dá)均定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色或棕褐色顆粒。使用軟件Imageproplus分析光密度法(積分光密度值IOD/區(qū)域面積ARE)對免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行定量分析；采用鏡下陽性細(xì)胞數(shù)占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的百分率和腫瘤細(xì)胞著色強(qiáng)度綜合進(jìn)行定性分析。依照陽性細(xì)胞所占比例，占<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分別記為0、1、2、3、4分；依照著色強(qiáng)度，未著色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分；將二者得分相乘后取5個視野得分的平均值記為最終分?jǐn)?shù)，根據(jù)最終分?jǐn)?shù)分成4種等級，0～1分為-，2～4分為+，5～8分為++，9～12分為+++，將++和+++定義為陽性。

1.3 GIST組織中FAM96A、FAM96B mRNA檢測 采用RT-PCR法檢測。FAM96A及FAM96B基因引物用Primer5.0引物軟件自行設(shè)計(jì)，基因引物及β-actin內(nèi)參引物均由上海生工生物工程有限公司合成，F(xiàn)AM96A：5′-GGTCTCGGAAAGTTGTGTGGA-3′，5′-CAGCCCAATA-AGAGTCGCCA-3′；FAM96B：5′-ACAGTGGCTGTGGCTT-TCAC-3′，5′-AGCGCAAAGCTTGACCTTG-3′；β-actin：5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′，5′-GGGCCGGACTCGTCA-TAC -3′。根據(jù)石蠟包埋組織RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作，提取出組織總mRNA，用核酸定量儀測量總RNA濃度和純度，取吸光度比值(A260/A280)在1.8～2.0的樣本進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書合成cDNA，將逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA置-20 ℃保存?zhèn)溆谩T-PCR總反應(yīng)體系25 μL：SYBR Green 12.5 μL，上下引物各1 μL(濃度均為10 μmol/L)，cDNA 2 μL，焦碳酸二乙酯水調(diào)節(jié)至總體積25 μL。反應(yīng)條件為變性、退火及延伸，設(shè)定40個循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)中FAM96A、FAM96B及β-actin總反應(yīng)體系和反應(yīng)條件均相同，由RT-PCR儀自動生成數(shù)據(jù)，得出Ct值，以2-ΔΔCt代表FAM96A、FAM96B mRNA相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組FAM96A、FAM96B、Caspase3蛋白陽性率比較 腫瘤1組和正常1組FAM96A蛋白陽性率分別為14.2%(17/120)、91.7%(110/120)，F(xiàn)AM96B蛋白陽性率分別為21.7%(26/120)、89.2%(107/120)，Caspase3蛋白陽性率分別為65.0%(78/120)、90.0%(108/120)，兩組比較，P均<0.05。

2.2 FAM96A、FAM96B、Caspase3蛋白表達(dá)與GIST臨床病理參數(shù)的關(guān)系 結(jié)果見表1，由表1可知，F(xiàn)AM96A、FAM96B蛋白陽性表達(dá)與腫瘤1組GIST腫瘤直徑、危險(xiǎn)度分級有關(guān)(P均<0.05)，與患者性別、年齡、發(fā)生部位、核分裂像無相關(guān)性(P均>0.05)；Caspase3蛋白陽性表達(dá)與GIST患者性別、年齡、發(fā)生部位、腫瘤直徑、核分裂像、危險(xiǎn)度分級均無相關(guān)性(P均>0.05)。

表1 FAM96A、FAM96B、Caspase3蛋白表達(dá)與GIST臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 GIST組織中FAM96A、FAM96B、Caspase3蛋白表達(dá)的相關(guān)性 Spearman等級相關(guān)分析結(jié)果顯示，腫瘤1組GIST組織中FAM96A、FAM96B蛋白表達(dá)與Caspase3蛋白表達(dá)均無相關(guān)性(P均>0.05)。

2.4 兩組FAM96A、FAM96B mRNA相對表達(dá)量比較 腫瘤2組、正常2組FAM96A mRNA相對表達(dá)量分別為0.55±0.23、1，F(xiàn)AM96B mRNA相對表達(dá)量分別為1.22±0.66、1，兩組FAM96A mRNA相對表達(dá)量比較，P<0.05。

3 討論

GIST是胃腸道最常見的間葉源性腫瘤，占全部胃腸道惡性腫瘤的2%～3%[12]。盡管伊馬替尼等分子靶向藥物已經(jīng)成為手術(shù)后、不可切除的及轉(zhuǎn)移性GIST的首選治療藥物，并使患者獲得較長的無進(jìn)展生存(PFS)和較高的總生存(OS)，但耐藥現(xiàn)象和不良反應(yīng)仍不能避免[13]。伊馬替尼出現(xiàn)耐藥后，臨床上應(yīng)用二線藥物舒尼替尼和三線藥物瑞戈非尼治療，但治療效果都沒有達(dá)到或接近伊馬替尼，且不良反應(yīng)也比較明顯，甚至有研究報(bào)道采用舒尼替尼和瑞戈非尼快速交替的治療方案，但治療結(jié)果未見報(bào)道[14]。文獻(xiàn)[15]報(bào)道，大多數(shù)GIST患者出現(xiàn)耐藥的最常見原因是基因發(fā)生再突變或多基因突變。腫瘤形成過程中發(fā)生了復(fù)雜的分子變化，包括原癌基因激活、腫瘤抑制基因的滅活或丟失、凋亡調(diào)節(jié)基因和DNA修復(fù)基因功能紊亂。癌基因和抑癌基因作用失衡是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，對某些具有潛在調(diào)控作用的基因進(jìn)一步研究是有必要的，可為腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制提出新的見解及探索新的診療方法提供理論依據(jù)。

FAM96A、FAM96B能與鐵硫(Fe/S)輔助因子結(jié)合參與鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，F(xiàn)e/S蛋白在DNA復(fù)制和修復(fù)、染色體分離及核糖體蛋白翻譯過程中起重要作用[4]。Yang等[16]認(rèn)為，F(xiàn)AM96B作為堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白E2-2的調(diào)節(jié)基因，在血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和微管形成中發(fā)揮重要作用。Chen等[17]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM96B和硒蛋白W結(jié)合與大腦發(fā)育和神經(jīng)退行性病變有關(guān)，能導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，進(jìn)而啟動DNA損傷修復(fù)，并維持基因組穩(wěn)定性。研究[18]顯示，保守的DUF59結(jié)構(gòu)域與維持基因組穩(wěn)定性有關(guān)。以上研究提示，F(xiàn)AM96A和FAM96B在細(xì)胞增殖中起著重要作用。國內(nèi)部分研究已經(jīng)證實(shí)，F(xiàn)AM96A和FAM96B在消化道上皮源性惡性腫瘤(如胃癌及肝癌等)中呈低表達(dá)，過表達(dá)的FAM96A和FAM96B能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，有望成為惡性腫瘤潛在的診斷和治療靶點(diǎn)[19～21]。Schwamb等[10]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM96A通過線粒體凋亡通路能有效誘導(dǎo)GIST細(xì)胞的凋亡，該蛋白在大多數(shù)GIST中表達(dá)顯著降低。本研究顯示，F(xiàn)AM96A、FAM96B蛋白在GIST腫瘤組織中的表達(dá)較正常組織中減少，F(xiàn)AM96A mRNA在GIST腫瘤組織中的表達(dá)量較正常組織減少。研究[19～21]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM96A、FAM96B表達(dá)與胃癌、結(jié)腸癌、肝癌等的發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)。本文結(jié)果顯示，F(xiàn)AM96A、FAM96B蛋白表達(dá)與GIST的腫瘤直徑、危險(xiǎn)度分級有關(guān)，提示FAM96A、FAM96B在GIST的發(fā)生發(fā)展過程中有一定作用，隨著腫瘤直徑增大和(或)危險(xiǎn)度分級增高，其表達(dá)減少甚至缺失。本研究只對30例蠟塊組織進(jìn)行FAM96A、FAM96B mRNA的定量進(jìn)行研究，考慮樣本量較小，故未在分子層面分析二者與GIST患者的臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。此外，F(xiàn)AM96B mRNA在GIST腫瘤組織中的表達(dá)量與正常組織中無差異，這與既往報(bào)道的胃腸道上皮源性惡性腫瘤的表達(dá)情況不一致，分析可能與石蠟包埋組織RNA降解明顯、GIST間質(zhì)中的血管也表達(dá)FAM96B蛋白、本實(shí)驗(yàn)樣本量相對較小及腫瘤類型不同等因素有關(guān)。

Caspase3作為細(xì)胞凋亡途徑的主要執(zhí)行者，在大多數(shù)凋亡事件中高表達(dá)，是凋亡過程重要的調(diào)節(jié)基因，其表達(dá)情況用于評估細(xì)胞凋亡水平[22～24]。本研究顯示，Caspase3蛋白在GIST腫瘤組織中的表達(dá)較正常組織減少，推測Caspase蛋白表達(dá)的降低與GIST的發(fā)生有一定關(guān)系。文獻(xiàn)[10]報(bào)道，F(xiàn)AM96A通過線粒體凋亡通路有效誘導(dǎo)GIST細(xì)胞的凋亡，而FAM96A、FAM96B的一級結(jié)構(gòu)有50%序列相同，兩者的已知功能相似，提示FAM96B也可能通過線粒體凋亡通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究對FAM96A、FAM96B蛋白與凋亡關(guān)鍵蛋白Caspase3的相關(guān)性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示FAM96A、FAM96B蛋白表達(dá)與Caspase3蛋白表達(dá)均無相關(guān)性，考慮到凋亡途徑步驟復(fù)雜、受多基因共同調(diào)控及Caspase3是多條凋亡途徑的共同下游效應(yīng)成分，同時考慮本實(shí)驗(yàn)樣本量相對較小等因素，關(guān)于FAM96A和FAM96B在GIST腫瘤組織中表達(dá)減少的具體機(jī)制還需深入研究。本研究旨在研究GIST中FAM96A及FAM96B的表達(dá)情況，并進(jìn)一步探討FAM96A及FAM96B在GIST中發(fā)揮生物功能機(jī)制是否與線粒體凋亡途徑有關(guān)，故未研究Caspase3 mRNA在GIST腫瘤組織中的表達(dá)情況。

總之，F(xiàn)AM96A、FAM96B、Caspase3在GIST組織中呈低表達(dá)，F(xiàn)AM96A和FAM96B可能作為新的抑癌基因，其表達(dá)的減少甚至缺失可能抑制了GIST腫瘤細(xì)胞的凋亡，這為臨床提供了新的治療靶點(diǎn)和思路。