張瑞平 王文潔 王蕊

摘要 利用60對分布于玉米10條染色體上的引物，對新科910及其父母本進行SSR分析。從中篩選出15對條帶清晰、重復性好的引物，用于構建新科910指紋圖譜，并將其數(shù)字化，計算出出現(xiàn)相同指紋圖譜的概率為4.44×10-16，概率極低，說明以這15對引物構建的新科910指紋圖譜鑒定其真實性是可行的。這15對引物分別是phi96100y1、umc2105k3、bnlg2291k4、umc1705w1、bnlg2305k4、bnlg161k8、phi299852y2、umc2160k3、umc1125y3、bnlg240k1、umc2084w2、umc1231k4、phi041y6、umc1432y6、umc2163w3。其中，umc1705w1、bnlg2305k4、umc1432y6、umc2084w2、phi041y6、umc2163w3這6對引物可用來鑒定新科910純度。任選1對引物umc2084w2用來檢測新科910的純度，結(jié)果為97.30%，與預期結(jié)果（97%）基本相符。因此，用這6對引物來鑒定新科910純度是可行的、結(jié)果是可信的。

關鍵詞 玉米;新科910;SSR;指紋圖譜;純度

Abstract We used 60 pairs of primers which distribute on the 10 chromosomes of maize for the SSR analysis of the maize hybrid Xinke 910 and its parents.15 pairs of primers were selected which were clear and good repeatability of their electrophoresis strip to construct the fingerprint of Xinke 910. And we digitized the fingerprint of Xinke 910 to calculate the probability of the same fingerprint，which was 4.44×10-16 and this probability was very low.This explains that it is feasible to identify the authenticity of Xinke910 by the fingerprint which is constructed by the 15 pairs of primers.The 15 pairs of primers were phi96100y1，umc2105k3，bnlg2291k4，umc1705w1，bnlg2305k4，bnlg161k8，phi299852y2，umc2160k3，umc1125y3，bnlg240k1，umc2084w2，umc1231k4，phi041y6，umc1432y6，umc2163w3. There were 6 pairs of primers can be used to identify the purity of Xinke 910 which were umc1705w1，bnlg2305k4，umc1432y6，umc2084w2，phi041y6 and umc2163w3.Among them， we selected 1 pair of primer arbitrary， which was umc2084w2 to identify the purity of Xinke 910，the result was 97.30%， which fit the expected results（97%） basically. Therefore， it was feasible and the results were credible to identify the purity of Xinke 910 by the 6 pairs of primers.

Key words Maize;Xinke 910;SSR;Fingerprint;Purity

玉米是世界三大糧食作物之一，我國是玉米生產(chǎn)大國，2012年我國玉米總產(chǎn)量首次超過水稻，成為第一大糧食作物[1]。雜交玉米種子的純度嚴重影響著作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，同時也是種子生產(chǎn)和質(zhì)量管理中最棘手的問題[2]。因此，快速、準確、有效鑒定玉米雜交種的純度和真實性是十分必要的。傳統(tǒng)的玉米種子純度檢測方法有形態(tài)鑒定法、幼苗鑒定法、田間小區(qū)種植鑒定法等，但存在周期長，易受環(huán)境影響、準確性差等不足之處[3]。此外，我國生產(chǎn)使用的玉米自交系主要是塘四平頭、旅大紅骨、蘭卡斯特和瑞德，遺傳基礎相對狹窄，因此以傳統(tǒng)的形態(tài)標記鑒別品種日趨困難。隨著分子生物學的發(fā)展，RFLP、RAPD、AFLP、SSR等分子水平上的技術日趨成熟。其中，SSR標記被廣泛應用于農(nóng)作物遺傳、育種種群鑒定、種子純度檢驗等研究中[4]。SSR具有快速、準確、信息含量高、呈共顯性分離、易于分析、重復可靠等優(yōu)點[5-7]，在玉米指紋圖譜構建、品種真實性鑒定以及純度檢驗方面具有明顯優(yōu)勢，并成功商業(yè)化[8]。

玉米雜交種新科910由河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學院選育，2014年5月通過河北省品種審定委員會審定，審定編號為冀審玉2014011。為快速有效鑒定市場流通的新科910種子的真實性和純度，筆者利用SSR分子標記技術，用60對引物（包括40對核心引物）對新科910及其親本進行SSR-DNA指紋圖譜分析，并將其數(shù)字化，計算出現(xiàn)相同指紋圖譜的概率，從而篩選出能有效鑒定新科910純度的引物，以期更準確鑒定和保護該品種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和主要試劑

雜交種新科910及其父本H865和母本K381均由河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學院玉米課題提供;試驗所用60對SSR引物序列信息來自玉米基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.maizegdb.org/ssr.php），并由上海生物工程股份有限公司合成;試驗所用DNA聚合酶、dNTP購買于寶生物生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取。

1.2.1.1 用于構建指紋圖譜DNA提取方法。

將新科910及其親本的玉米種子沙培，于30 ℃光照培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，待玉米苗長至3葉1心，取葉片混樣，用CTAB方法提取總DNA[9]。紫外分光光度計檢測DNA的質(zhì)量和濃度，加水稀釋至25 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 檢測純度用DNA提取。

取新科910種子100粒（其中有3粒是人為加入的母本種子）沙培，于30 ℃光照培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，待玉米苗長至3葉1心時，用CTAB方法提取單株DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 擴增體系及電泳分析。PCR擴增體系總體積為15 μL，其中dNTPs 0.2 mmol/L，引物0.25 μmol/L和模板DNA 25 ng，加滅菌純水補足體積。擴增程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃40 s，60 ℃35 s，72 ℃45 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR擴增反應在BIOER TC-96/G/H（b）型PCR儀上進行。

擴增產(chǎn)物加入適量上樣緩沖液6×Loading Buffer混勻后，各取3.5 μL在8.0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染顯色。然后在膠片觀測燈上觀察電泳結(jié)果，采用凝膠成像系統(tǒng)掃描圖片或者用相機拍照保存圖片。

1.2.3 指紋圖譜構建及數(shù)字化。篩選SSR產(chǎn)物帶型穩(wěn)定且清晰的引物，構建新科910的指紋圖譜。并以1、0統(tǒng)計建立數(shù)據(jù)庫，將新科910指紋圖譜數(shù)字化。在相同遷移位置（分子量相同片段）有帶記為1，無帶記為0。根據(jù)公式P=1/2n計算相同指紋圖譜有可能出現(xiàn)的概率[10-11]，式中2為相同遷移率位點上等位基因存在的“有”或“無”2種關系;n為等位基因的數(shù)目;2n為檢測n個等位基因時有可能涉及的所有自交系的個數(shù)。

1.2.4 種子純度鑒定。根據(jù)構建新科910的指紋圖譜，篩選出可用作純度鑒定的引物，再從中任選1對，用來驗證其鑒定純度的可行性。

根據(jù)公式：種子純度=[（供檢測品種種子樣本帶型數(shù)-雜種種子樣本帶型數(shù)）/供檢測品種種子樣本帶型數(shù)]×100%，計算樣本種子純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物篩選

從60對用于擴增新科910及其父母本的引物中，篩選出帶型穩(wěn)定清晰、重復性好的引物15對，用于構建新科910的指紋圖譜。這15對引物分布于玉米的9條染色體上，共檢測出51個等位基因，每對引物可檢測出2～6個等位基因，平均3.4個，片段大小為100～400 bp（表1）。

2.2 指紋圖譜構建 篩選出的可用于構建新科910指紋圖譜的15對引物分別是phi96100y1、umc2105k3、bnlg2291k4、umc1705w1、bnlg2305k4、bnlg161k8、phi299852y2、umc2160k3、umc1125y3、bnlg240k1、umc2084w2、umc1231k4、phi041y6、umc1432y6、umc2163w3，其擴增的主條帶為100～400 bp。這15對引物擴出的新科910的主條帶均是父本和母本主條帶的疊加，這很好地印證了SSR分子標記共顯性的遺傳特點[12]。部分引物擴增結(jié)果如圖1。

可用作純度檢測引物有6對，分別是umc1705w1、bnlg2305k4、umc1432y6、umc2084w2、phi041y6、umc2163w3。其中，引物umc1705w1、bnlg2305k4、umc1432y6擴增條帶為200～300 bp，條帶清晰，片段大小差距較大，可用作新科910純度鑒定;引物umc2084w2擴增條帶為100～200 bp，條帶清晰，片段大小差距較大，且父母本均只有1條條帶，可用作新科910 bp純度鑒定;phi041y6和umc2163w3擴出的條帶為200～400 bp，條帶清晰穩(wěn)定，片段大小差距較大，且父母本均只有1條主條帶，可用作新科910純度鑒定。

2.3 指紋圖譜數(shù)字化

將15對引物擴出的片段數(shù)字化，分別用1和0表示，由表2可知，新科910及其父母本均由順序不同的51位數(shù)字組成。以父本H865為例，出現(xiàn)與其完全相同數(shù)字順序的概率大約為4.44×10-16（P=1/251），即在大約2.252×1015份材料中只有1份材料與其指紋號碼相同，概率極低。所以可以推斷這個數(shù)字指紋圖譜是其特有的。同理，新科910及其母本的數(shù)字指紋也是特有的，再一次證明了這15對引物可用于新科910及其父母本真實性鑒定。

2.4 種子純度鑒定

從6對可用于純度鑒定的引物中任選1對（umc2084w2）鑒定新科910的純度，結(jié)果見圖2。

引物umc2084w2檢測新科910的純度為97.30%。由圖2可知，第26泳道條帶與母本一致，應該是人為加入的母本種子，這與100粒新科910種子中有3粒人為混入的母本種子的結(jié)果（97%）基本相符，說明這些引物對新科910純度鑒定結(jié)果較可信。

3 結(jié)語

（1）該研究用分布于玉米10條染色體上的60對引物（包括40對核心引物）對玉米雜交種新科910及其父母本進行SSR分析，篩選出15對引物可用來構建新科910及其父母本的指紋圖譜，并將指紋圖譜數(shù)字化，計算出出現(xiàn)相同指紋圖譜的概率為4.44×10-16，概率極低，可以說這15對引物所構建的新科910及其父母本的指紋圖譜是特有的，這為雜交種新科910的真實性鑒定提供了參考。