張玉梅 曹佩雪 張仕林

摘要 [目的]建立同時(shí)測(cè)定雷公藤中4種有效成分含量的方法，并研究不同產(chǎn)地雷公藤中4種有效成分的含量差異。[方法]采用Thermo Hypersil GOLD Phenyl Dim（250 mm × 4.6 mm，5 μm）色譜柱;以乙腈-0.1%磷酸-0.2%三乙胺溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫;檢測(cè)波長(zhǎng)：0～65 min為225 nm，65 min后為210 nm;流速0.75 mL/min;柱溫25 ℃;進(jìn)樣量10 μL。[結(jié)果] 4種有效成分均有較好的分離度，方法精密度和重復(fù)性RSD均小于3.7%，待測(cè)樣品于室溫下24 h內(nèi)能保持穩(wěn)定，4種有效成分均有良好的線性關(guān)系，加樣回收率分別為雷公藤甲素86.72%、雷公藤內(nèi)酯酮107.51%、雷公藤紅素76.94%、雷公藤酯甲84.38%。[結(jié)論]該方法精密度和重現(xiàn)性良好，可同時(shí)測(cè)定雷公藤中4種有效成分的含量，可為雷公藤的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 雷公藤;有效成分;HPLC;含量測(cè)定

Abstract [Objective]To establish a method for simultaneous determination of four effective ingredients of Tripterygium wilfordii，and to study the difference of these four effective constituents from different producing areas.[Method]Samples were analyzed on a Thermo Hypersil GOLD Phenyl Dim chromatographic column （ 250 mm × 4.6 mm，5 μm ）， and eluted with the mobile phase of acetonitrile - 0.1% phosphorus -0.2% triethylamine solution with a linear gradient mode， the detection wavelengths were set at 225 nm for 0-65 min and 210 nm for 65 min， the flow rate of the mobile phase was 0.75 mL/min with the column temperature of 25 ℃， and the determined volume was 10 μL.[Result]These four effective constituents were well separated， the RSD of precision and repeatability both less than 3.7%， and the samples remained stable for 24 hours at room temperature.Meanwhile these four effective constituents exhibited a good linearity， and the recoveries of triptolide， triptonide， celastrol and wilforlide was 86.72%， 107.51%， 76.94% and 84.38%，respectively.[Conclusion]The method is accurate and repeatable， and it can be used for the determination of the four components in Tripterygium wilfordii.

Key words Tripterygium wilfordii Hook.f.;Effective constituents;HPLC;Content determination

雷公藤藥材系衛(wèi)矛科雷公藤屬植物的根，主產(chǎn)于浙江、湖南、江西、安徽、貴州等地[1]，具有抗炎、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用，用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等[2]，臨床應(yīng)用廣泛。雷公藤藥材中主要活性成分為二萜內(nèi)酯類，生物堿類及三萜類化合物[3-4]，但其主要活性成分同時(shí)又是毒性成分，不良反應(yīng)時(shí)有報(bào)道[5-7]。目前，對(duì)于雷公藤藥材的評(píng)價(jià)多集中于對(duì)主要有效成分雷公藤甲素或雷公藤紅素的含量測(cè)定，但單一化學(xué)成分不能較全面反映藥材質(zhì)量，雖然梁健等[8]對(duì)雷公藤藥材進(jìn)行了HPLC指紋圖譜的研究，但并未對(duì)藥材中各個(gè)有效成分進(jìn)行準(zhǔn)確的定量。因此，該試驗(yàn)對(duì)雷公藤中4種有效成分同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)15批不同產(chǎn)地藥材中有效成分的含量進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 儀器。Agilent 1260型高效液相色譜儀（包括DAD檢測(cè)器、四元低壓梯度泵、在線真空脫氣機(jī)，美國(guó)Agilent公司）;Chemstation工作站（美國(guó)Agilent公司）;NE-203型電子天平（梅特勒-托利儀器有限公司）;XBF-500型高速中藥粉碎機(jī)（吉首市中湘制藥機(jī)械廠）;2XZ-4C型真空泵（臨海市譚氏真空泵有限公司）;SB-2000型水浴鍋（上海市愛朗儀器有限公司）;DL/SB-5/25型低溫冷卻循環(huán)泵（鞏義市予化儀器有限責(zé)任公司）;SHB-III型循環(huán)水多用真空泵（北京市泰和格潤(rùn)儀器有限公司）;SK5200B型超聲儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.1.2 試劑。雷公藤甲素（批號(hào)GR-133-160613）、雷公藤內(nèi)酯酮（批號(hào)GR-134160613）對(duì)照品購(gòu)自南京廣潤(rùn)生物制品有限公司，純度≥98%;雷公藤紅素（批號(hào)A0106）、雷公藤酯甲（批號(hào)A0107）對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度≥98%。乙腈、甲醇、磷酸、三乙胺均為色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）;水為娃哈哈純凈水;其他試劑為分析純，玻璃層析柱（內(nèi)徑1 cm），中性氧化鋁（100 ～ 200目）。

1.1.3 試材。15批雷公藤藥材來源見表1，其中S1 ～ S9購(gòu)于貴陽(yáng)太升中藥材市場(chǎng)，S10 ～ S15于不同地方采集，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院孫慶文教授鑒定為雷公藤屬植物雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）的根。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)照品溶液的配制。精密稱取適量對(duì)照品雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤紅素、雷公藤酯甲，分別置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得各對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取各對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇并定容至刻度，混合，搖勻，精密量取1 mL混合液，稀釋成10 mL，制備成混合對(duì)照品溶液。

1.2.2 雷公藤藥材供試品溶液的配制[9-11]。S1 ～ S15雷公藤藥材干燥粉碎后過40目篩，精密稱取15 g，加入95%乙醇，其料液比為1∶3，75 ℃回流提取2次，每次4.5 h，過濾，合并濾液，濃縮至無乙醇味，干燥至恒重。精密稱取干燥后的殘?jiān)?.5 g于錐形瓶中，加入乙酸乙酯30 mL，超聲處理30 min，過濾，用30 mL乙酸乙酯分次洗滌錐形瓶和漏斗，合并濾液及洗液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，殘?jiān)?0 mL乙酸乙酯溶解，經(jīng)過中性氧化鋁柱（100 ～ 200目，3.5 g，內(nèi)經(jīng)1 cm，乙酸乙酯濕法裝柱），用35 mL乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，回收溶劑。殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得各供試品溶液。

1.2.3 色譜條件。色譜柱：Thermo Hypersil GOLD Phenyl Dim（250 mm × 4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相A：0.1% 磷酸溶液-0.2% 三乙胺溶液，流動(dòng)相B：乙腈，梯度洗脫（0 ～10 min，20%～35% B;10～15 min，35%～40% B;15～35 min，40% B;35～50 min，40%～45% B;50～60 min，40%～45% B;60～75 min，65%～75% B）;檢測(cè)波長(zhǎng)：0～65 min為225 nm，65 min時(shí)為210 nm;流速：0.75 mL/min;柱溫：25 ℃;進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.4 方法學(xué)考察。

1.2.4.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。分別吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 μL，在“1.2.3”色譜條件下，注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，考察系統(tǒng)適應(yīng)性。

1.2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密量取“1.2.1”項(xiàng)下4個(gè)對(duì)照品溶液，按“1.2.3”色譜條件進(jìn)行分析，以峰面積為縱坐標(biāo)、不同體積對(duì)照品的質(zhì)量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸。

1.2.4.3 精密度試驗(yàn)。取編號(hào)為S5的雷公藤供試品溶液，按“1.2.3”色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定并記錄各成分峰面積。

1.2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)。取編號(hào)為S5的雷公藤平行制備6份供試品溶液，按“1.2.3”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，并記錄峰面積。

1.2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取編號(hào)為S5的雷公藤供試品溶液，室溫下分別于0、2、4、8、12、24 h按“1.2.3”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，并記錄各成分峰面積。

1.2.4.6 加樣回收率試驗(yàn)。取編號(hào)為S5的雷公藤15 g，按“1.2.2”方法處理，所得溶液中分別加入對(duì)照品溶液各1 mL，按“1.2.3”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，并記錄各成分峰面積。

1.2.5 樣品含量測(cè)定。分別取不同產(chǎn)地的雷公藤藥材/飲片S1 ～ S15，每個(gè)樣品平行取3份，按“1.2.2”方法制備各供試品溶液，按“1.2.3”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄各成分峰面積，分別計(jì)算樣品中4種有效成分的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。圖1表明，在“1.2.3”條件下，樣品譜圖中雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤紅素、雷公藤酯甲的保留時(shí)間分別為17、28、65、67 min左右，并且重復(fù)性相對(duì)較好。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。按照“1.2.4.2”方法操作，以峰面積為縱坐標(biāo)、不同體積對(duì)照品的質(zhì)量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。由表2可知，雷公藤中4種有效成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，R2≥0.999。

2.1.3 精密度試驗(yàn)。按照“1.2.4.3”方法操作，計(jì)算得到雷公藤中雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤紅素、雷公藤酯甲4種有效成分含量的RSD分別為0.941%、2.006%、3.559%、2.671%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn)。按照“1.2.4.4”方法操作，計(jì)算得到雷公藤中雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤紅素、雷公藤酯甲4種有效成分含量的RSD分別為1.076%、1.921%、3.665%、2.501%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)。按照“1.2.4.5”方法操作，計(jì)算得到雷公藤中雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤紅素、雷公藤酯甲4種有效成分含量的RSD分別為1.927%、2.159%、4.626%、3.132%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.1.6 加樣回收率試驗(yàn)。按照“1.2.4.6”方法操作，計(jì)算得到雷公藤中雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤紅素、雷公藤酯甲4種有效成分含量的平均加樣回收率分別為86.72%、107.51%、76.94%、84.38%。

2.2 樣品含量測(cè)定 按照“1.2.5”方法操作，由表3可知，相比雷公藤飲片（S1～S9），雷公藤藥材中4種有效成分的含量普遍較高，尤其以湖南產(chǎn)地（S13、S14）的更為明顯。

3 討論與結(jié)論

3.1 流動(dòng)相的選擇 試驗(yàn)中分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%冰乙酸溶液、乙腈-0.1% 磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液-0.2%三乙胺溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果表明，相同條件下，流動(dòng)相為甲醇-水時(shí)，4種有效成分的出峰時(shí)間相對(duì)較慢;流動(dòng)相為甲醇-0.1% 冰乙酸溶液時(shí)，基線上浮，不平穩(wěn);流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液-0.2% 三乙胺溶液時(shí)比用乙腈-0.1%磷酸溶液時(shí)的色譜峰分離效果更好，分離度和峰形更好。因此該試驗(yàn)以乙腈-0.1%磷酸溶液-0.2%三乙胺溶液作為流動(dòng)相。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 試驗(yàn)中選取210、218、225、242、276 nm 5個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)，結(jié)果表明，在276和242 nm時(shí)，4種有效成分的色譜峰吸收較弱;在210和225 nm時(shí)，4種有效成分的吸收都比較強(qiáng)，且在225 nm條件下的基線相對(duì)平穩(wěn)且峰形較好，由于雷公藤紅素和雷公藤酯甲在210 nm時(shí)的吸收最強(qiáng)，因此試驗(yàn)中檢測(cè)波長(zhǎng)選擇為0 ～ 65 min 225 nm，65 min之后210 nm。

3.3 其他條件的優(yōu)化 該試驗(yàn)中還對(duì)流速及柱溫2種條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，當(dāng)流速為0.75 mL/min、溫度為25 ℃時(shí)，色譜峰分離度及峰形較好，故試驗(yàn)中選擇了該流速和柱溫條件。

3.4 結(jié)論 該研究采用HPLC法同時(shí)對(duì)雷公藤藥材中4種有效成分含量進(jìn)行測(cè)定，方法精密度、重復(fù)性良好，可同時(shí)測(cè)定雷公藤藥材中4種有效成分的含量，可為該藥材的質(zhì)量控制提供新的科學(xué)依據(jù)。

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