(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川成都 610041)

亞硝酸鹽在食品中廣泛存在,主要作為防腐劑和護(hù)色劑應(yīng)用在蔬菜和香腸中[1]。由于在胃中亞硝酸鹽會轉(zhuǎn)化成有害的胺類物質(zhì),尤其是亞硝胺具有強(qiáng)烈的致癌作用[2-4],還會引發(fā)高鐵血紅蛋白癥,使紅細(xì)胞失去攜氧能力,組織缺氧直至死亡,所以經(jīng)常食用含有亞硝酸鹽的食品會引發(fā)機(jī)體癌變,還有致畸的風(fēng)險,有效降低亞硝酸鹽的方法已經(jīng)成為近幾年的熱點(diǎn)問題[5-6]。

乳酸菌以糖類發(fā)酵產(chǎn)生乳酸,是功能性顯著的益生菌[7-11]。目前已經(jīng)有研究證明乳酸菌的代謝產(chǎn)物酶和生長過程中產(chǎn)生的乳酸均對亞硝酸鹽具有降解作用[12-13],減少了亞硝酸鹽的積累[14-15],如食品的活菌發(fā)酵,通過作用于N-亞硝胺前體物,能夠降解亞硝酸鹽[16-17]和抑制胺類物質(zhì)形成[18]。傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛乳通過長期自然發(fā)酵構(gòu)成其優(yōu)勢菌群,其優(yōu)良性能得以保存,因此從傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛乳中篩選出具有降解亞硝酸鹽能力的功能性乳酸菌極具可行性。

乳酸菌對外界環(huán)境較為敏感,尤其是在進(jìn)入人體消化道內(nèi),消化道中分泌的各種消化液和消化酶也會影響其生存與繁殖。為了研究具有降解亞硝酸鹽能力的優(yōu)勢菌株能否在人體消化道內(nèi)存活并發(fā)揮作用,在模擬人體消化環(huán)境中培養(yǎng)并觀察其存活狀態(tài)。模擬人體消化道,就是在體外創(chuàng)造和人體消化道相似的環(huán)境。國外早有研究,Izquierdo等[19]模擬胃腸道環(huán)境進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明不同菌株的耐受性存在差異。

本實(shí)驗(yàn)以195株分離自川西高原傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛乳中的乳酸菌為研究對象,篩選出具有亞硝酸鹽降解能力的優(yōu)勢菌株,進(jìn)而研究優(yōu)勢菌株對人體消化環(huán)境的抵抗力,為其能否作為益生菌在人體腸道中發(fā)揮功效提供理論依據(jù),同時對功能性食品的研發(fā)有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

195株乳酸菌 分離自31份川西高原不同發(fā)酵牦牛酸乳樣品;MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基 成都瑞普信生物技術(shù)有限公司;亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰乙酸、硼酸鈉、鹽酸、氯化鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、氫氧化鈉、磷酸氫鉀 成都市科龍化工試劑廠;胃蛋白酶(酶活力1∶3000)、胰蛋白酶(酶活力1∶250) 如吉生物科技公司;牛膽鹽 科漢森公司。

UV-2000紫外分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司;PYX-DHS-50X65-BS-Ⅱ型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療機(jī)械廠;高壓蒸汽滅菌鍋、SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;MP512-02型精密pH計 德國Matthaus公司;ZWY-100H型恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的傳代培養(yǎng)與活化 將195株乳酸菌按4%的比例接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中,并混勻,在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,傳代培養(yǎng)兩代后得到生長狀況良好的菌液。

1.2.2 乳酸菌降解亞硝酸鹽能力實(shí)驗(yàn) 根據(jù)國標(biāo)GB 5009.33-2016中的鹽酸奈乙二胺法[20],檢測川西高原傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛乳中分離出的195株待測菌株亞硝酸鹽的降解能力。在波長538 nm處測出吸光度,以亞硝酸鹽質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo),吸光度(y)為縱坐標(biāo),繪制亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為y=0.5736x-0.0015,決定系數(shù)R2=0.9957。取活化后的菌株吸取50 μL菌液接種到5 mL MRS肉湯培養(yǎng)基(含150 mg/L亞硝酸鈉)中,于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后按鹽酸奈乙二胺法要求處理,在波長538 nm處測殘余亞硝酸鹽吸光值,代入亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程測定剩余亞硝酸鹽質(zhì)量濃度并計算降解率,對每株菌降解亞硝酸鹽能力測定重復(fù)3次,降解率公式如下:

式中:B0為培養(yǎng)基中亞硝酸鹽原始質(zhì)量濃度,mg/L;B1為發(fā)酵后殘余亞硝酸鹽質(zhì)量濃度,mg/L。

1.2.3 模擬人工胃液耐受力實(shí)驗(yàn) 用蒸餾水稀釋2 mL 1 mol/L的鹽酸,調(diào)節(jié)pH分別達(dá)到1.5、2.5、3.5、4.5、5.5。以1 g/100 mL的比例加入胃蛋白酶,充分溶解,用0.20 μm的微孔濾膜除菌。將活化后的菌液以10%的體積分?jǐn)?shù)接種于處理好的人工胃液中,混勻后進(jìn)行37 ℃、100 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)[21],用涂布稀釋法分別測定0、1、2、3和4 h時的活菌數(shù),每個時間段重復(fù)測定三次。

1.2.4 模擬人工腸液耐受力實(shí)驗(yàn) 取3.4 g KH2PO4加入蒸餾水250 mL,采用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.6后稀釋至500 mL,以1 g/100 mL的比例加入胰蛋白酶,充分溶解。用0.20 μm的微孔濾膜除菌。將活化后的菌液以10%的接種量接種于處理好的人工腸液中,混勻后進(jìn)行37 ℃、100 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)[22],用涂布稀釋法測定0、1、2、3和4 h時的活菌數(shù),每個時間段重復(fù)測定三次。

1.2.5 耐膽鹽實(shí)驗(yàn) 分別配制膽鹽質(zhì)量濃度為0、0.03、0.08、0.13、0.18、0.23、0.28和0.33 g/100 mL(8個梯度)的MRS肉湯培養(yǎng)基,121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min,冷卻,將活化后的菌液以10%的體積分?jǐn)?shù)接種到該培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,用涂布稀釋法進(jìn)行活菌計數(shù),重復(fù)測定三次。

1.2.6 耐高鹽實(shí)驗(yàn) 配制NaCl質(zhì)量濃度分別為0、1、1.5、2、2.5、3、3.5和4 g/100 mL(8個梯度)的MRS肉湯培養(yǎng)基,121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min,冷卻,將活化后的菌液以10%的體積分?jǐn)?shù)接種到該的培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,用涂布稀釋法進(jìn)行活菌計數(shù)[23],重復(fù)測定三次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 具有降解亞硝酸鹽能力菌株的篩選結(jié)果

通過對195株乳酸菌的亞硝酸鹽降解率進(jìn)行統(tǒng)計(表1),總體上觀察可知,不同菌株降解亞硝酸鹽的能力不同,亞硝酸鹽降解率范圍為35.79%～96.51%。由圖1可知,降解率在80%～90%的菌株數(shù)量最多,占比54.87%,僅有1.54%的菌株亞硝酸鹽,降解率在50%以下,23.08%的菌株降解率在80%以下,98.46%的菌株降解率在95%以下,而降解率在95%以上的菌株有3株,占總數(shù)的1.54%。這三株乳酸菌分別是菌株5、26和150,它們顯示出了較強(qiáng)的降解亞硝酸鹽的能力。在這3株菌中,菌株26和菌株150的亞硝酸鹽降解率分別為95.64%和95.06%,菌株5的亞硝酸鹽降解率最高,達(dá)到了96.51%。后續(xù)對3株優(yōu)良的亞硝酸鹽降解能力極強(qiáng)的菌株進(jìn)行耐受力研究。

表1 195株菌亞硝酸鹽降解率(%)Table 1 Nitrite degradation rate of 195 strains(%)

圖1 195株菌亞硝酸鹽降解率統(tǒng)計圖Fig.1 Statistical diagram of nitrite degradation of 195 strains

2.2 對人工胃液耐受力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

乳酸菌需要通過口腔進(jìn)入人體胃腸道才能發(fā)揮作用,胃液的pH一般在3.0左右,通過胃的時間一般為1～2 h。而胃液的酸性環(huán)境會刺激胃蛋白酶原發(fā)揮作用,殺死食物中的細(xì)菌[24],這就要求所篩選的乳酸菌必須具有耐酸和耐胃蛋白酶的能力。由圖2～圖4可以看出,在不同的pH下,3株乳酸菌的活菌數(shù)隨培養(yǎng)時間的延長均逐漸減少,菌株26下降的趨勢最為明顯,菌株5稍緩。在培養(yǎng)3 h時后,菌株5、26、150在pH5.5時的活菌數(shù)分別為3.7、3.6、4.1×108CFU/mL,均保持在較高的水平。其中菌株150在pH為1.5的人工胃液中作用一段時間后稍有減少,在pH2.5～5.5的人工胃液中保持了較高的活力,相對于其他兩株菌有較高的耐受性。

圖2 菌株5在不同pH的人工胃液中在不同時間的活菌數(shù)Fig.2 Number of viable cells of strain 5 at different timein artificial gastric juice with different pH

圖3 菌株26在不同pH的人工胃液中在不同時間的活菌數(shù)Fig.3 Number of viable cells of strain 26 at different timein artificial gastric juice with different pH

圖4 菌株150在不同pH的人工胃液中在不同時間的活菌數(shù)Fig.4 Number of viable cells of strain 150 at different timein artificial gastric juice with different pH

2.3 對人工腸液耐受力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

乳酸菌經(jīng)過胃液后進(jìn)入腸液,腸液pH大約為7.6,食物通過小腸的時間約為4 h[25]。乳酸菌需對小腸液有一定的耐受性,只有在一定時間內(nèi)保持足夠的數(shù)量才能發(fā)揮作用。如圖5可知,在人工腸液中培養(yǎng)4 h后,菌株5、26、150的活菌數(shù)分別為4.3、6.8、5.3×108CFU/mL,均保持在較高水平,表現(xiàn)了良好耐受力。但菌株26和菌株150在人工腸液中的活菌數(shù)變化不大,隨培養(yǎng)時間便逐漸減少。菌株5和菌株150在4 h時存活率分別為34.96%、46.49%,而菌株26在4 h時存活率則達(dá)到了51.13%,表明菌株26對胰蛋白酶的耐受力高于菌株5和菌株150。

圖5 3株乳酸菌在人工腸液中培養(yǎng)后的活菌數(shù)Fig.5 Number of viable cells of 3 strains oflactic acid bacteria cultured in artificial intestinal juice

2.4 耐膽鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果

小腸中膽汁濃度在0.03%～0.30%范圍內(nèi)波動[26],乳酸菌必須能在高膽鹽環(huán)境中存活才能發(fā)揮其性能,所以可以檢測這3株菌在不同的膽鹽濃度中的生存情況來判斷其對膽鹽的耐受力強(qiáng)弱[27]。如圖6可知,3株菌在不同膽鹽濃度的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后,其活菌數(shù)隨膽鹽濃度的增加而減少。其中在膽鹽濃度0.33 g/100 mL菌株5的活菌數(shù)最高,為1.12×108CFU/mL,菌株26、150活菌數(shù)也在108CFU/mL以上,證明它們對胃腸道有良好的適應(yīng)性,可以在食品工業(yè)中有很好的應(yīng)用。

圖6 3株乳酸菌在膽鹽中培養(yǎng)后的活菌數(shù)Fig.6 Number of viable cells of 3 strains oflactic acid bacteria cultured in bile salts

2.5 耐高鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果

當(dāng)鹽濃度增加時,水會透過細(xì)胞膜向高濃度的外界環(huán)境轉(zhuǎn)移,菌體內(nèi)水分越來越少。會嚴(yán)重影響菌體內(nèi)部的各種生化反應(yīng),嚴(yán)重時反應(yīng)都將終止,結(jié)果便是菌體死亡[28]。3株菌在人體腸道的NaCl濃度范圍內(nèi)要有一定的活性。由圖7可知,3株菌在不同的NaCl質(zhì)量濃度的MRS肉湯中培養(yǎng)24 h之后,活菌數(shù)都隨NaCl質(zhì)量濃度的升高而減少,并且質(zhì)量濃度越高對活菌數(shù)的影響越大,但活菌數(shù)均在108CFU/mL以上,在4 g/100 mL的濃度下也能存活,說明這3株亞硝酸鹽降解能力極強(qiáng)的菌株都對NaCl有較好的耐受力,可以在人體消化道的滲透壓條件下生存并且發(fā)揮作用。此外,菌株5下降的趨勢較為緩慢,表明其相對于菌株26和菌株150有更高的耐高鹽能力。

圖7 3株乳酸菌在高鹽環(huán)境中培養(yǎng)后的活菌數(shù)Fig.7 Number of viable cells of 3 strains oflactic acid bacteria cultured in high salt environment

3 結(jié)論

本研究對川西高原發(fā)酵牦牛乳中分離出的195株乳酸菌進(jìn)行降解亞硝酸鹽能力的篩選,各菌株的耐受力存在較大差異,其中有3株乳酸菌的降解率在95%以上,經(jīng)16 S rRNA測序,菌株5和26均為發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum),菌株150為德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbruckii)。其中降解率最高的是菌株5,降解率為96.51%。根據(jù)耐受力實(shí)驗(yàn),可看出3株菌對人工胃液的耐受性良好,菌株150在胃液中的耐受性相較于其他兩個菌株更強(qiáng);3株乳酸菌對人工腸液也有很好的耐受性,活菌數(shù)隨培養(yǎng)時間的延長而減少,培養(yǎng)4 h后活菌數(shù)最高的是菌株26;3株菌在膽鹽中培養(yǎng)時也表現(xiàn)出了較強(qiáng)的耐受性,其活菌數(shù)隨膽鹽濃度的增加而減少;在不同濃度梯度的高鹽MRS肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)3株菌,24 h后檢測到的活菌數(shù)隨NaCl濃度的升高而減少,但都表現(xiàn)了很強(qiáng)的耐滲透壓的能力,其中較強(qiáng)的是菌株5。

因此,這些實(shí)驗(yàn)表明了川西高原藏區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛乳中分離出的這195株乳酸菌具有很好的亞硝酸鹽降解能力,其中篩選出的3株降解亞硝酸鹽的優(yōu)良菌株在人工胃液、人工腸液、膽鹽和高鹽四個模擬人工胃腸道消化環(huán)境中均能夠存活,且生長狀況良好,表現(xiàn)出了這3株乳酸菌良好的耐受性?？梢源藶榛A(chǔ),后續(xù)研究可對相關(guān)采樣地的傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛乳中的微生物進(jìn)行更加深入探究,尋找其中的多功能優(yōu)勢菌。本研究僅僅對乳酸菌亞硝酸鹽降解能力及耐受力進(jìn)行了探究,后續(xù)還可在分子水平上對菌株發(fā)酵特性的差異進(jìn)行分析,探究不同種類乳酸菌在基因表達(dá)上的差異。由于乳酸菌在醫(yī)藥,食品和生物領(lǐng)域的應(yīng)用較廣,本研究對川西地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的研究及功能食品的開發(fā)有著重要意義。