張開平1,劉燕麗1,黃江奇2,農(nóng)建鵬1,周利宏1,吳文標

(1.百色學院農(nóng)業(yè)與食品工程學院,廣西百色 533000; 2.龍邦海關(guān),廣西靖西 533800; 3.西南大學食品科學學院,重慶 400716)

醋的流行源于其具有調(diào)節(jié)高血脂的作用[1]。此外,有大量的研究表明食醋還具有其它一些保健作用如:緩解靜脈曲張[2]、降血糖[3-7]、抗氧化作用、改善非酒精型脂肪肝患者的生育力[8]和減輕高脂飲食導致的肝損傷[9]等。

芒果(MangiferaindicaL.)屬于仙人掌漆樹科杧果屬,富含各種維生素和人體必需礦物質(zhì)元素,俗稱“熱帶水果之王”[10-11]。隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的高速發(fā)展以及國家政策對農(nóng)業(yè)的大力支持,芒果種植面積大幅增加,產(chǎn)量逐年升高,因此,其資源十分豐富[12-13]。但是,我國對于芒果的加工程度仍然不高,造成了較大的資源浪費,不能發(fā)揮其優(yōu)勢創(chuàng)造良好的經(jīng)濟效益[14-15]。以芒果為原料釀制成果醋,不僅具有芒果固有的果香,而且還具有比芒果更高的營養(yǎng)價值,芒果經(jīng)發(fā)酵制成芒果醋后,其總抗氧化能力(FRAP法測定)為(4.8±0.5) mmol·L-1,較芒果果實高,同時還能增加芒果醋中揮發(fā)性脂肪酸含量,賦予芒果醋特殊風味[16-17]。

混菌發(fā)酵是指利用兩種或兩種以上具有共生作用的微生物,聯(lián)合完成某種發(fā)酵過程的新型技術(shù),是單一菌株純培養(yǎng)技術(shù)上的創(chuàng)新,目前混菌發(fā)酵主要研究熱點在于酵母-乳酸菌、酵母-醋酸菌的混合發(fā)酵。Wang等采用釀酒酵母與巴氏醋桿菌混合發(fā)酵,并對發(fā)酵工藝進行正交優(yōu)化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)混菌發(fā)酵能減少發(fā)酵損失,提高產(chǎn)酸率,混菌發(fā)酵產(chǎn)酸率為66.0 g/L,比對照組提高約50%[18]。Nguyen等[19]采用酵母菌-醋酸菌混菌發(fā)酵葡萄糖醛酸,酵母菌(23×108CFU·mL-1)與醋酸菌(2×108CFU/mL)最佳初始組合比例為4∶6,該比例下葡萄糖醛酸產(chǎn)量為175.8 mg·L-1,發(fā)酵周期7 d,顯著提高了生產(chǎn)效率(P<0.05)。我國民間傳統(tǒng)紅茶菌發(fā)酵飲料一般都是由幾種醋酸菌與酵母菌共同發(fā)酵而成,其中,醋酸菌和酵母菌共生,酵母菌是“啟動子”,酵母菌分解蔗糖,供自身繁殖并生成乙醇;醋酸菌利用酵母分解蔗糖獲得碳源,酵母產(chǎn)生的乙醇會刺激醋酸菌產(chǎn)生乙酸,而乙酸又能刺激酵母菌產(chǎn)生乙醇;此外,不同醋酸菌、酵母菌菌種發(fā)酵紅茶,由于菌種差異性和代謝途徑的復雜性,所形成的發(fā)酵產(chǎn)物的風味物質(zhì)、活性成分數(shù)量和含量也有所差異[20-22]。由此可見,與傳統(tǒng)的純種分段發(fā)酵相比,混菌發(fā)酵中的多種微生物之間形成特殊的共生關(guān)系及復雜代謝通路,使得發(fā)酵過程得以縮短,簡化工藝,提高生產(chǎn)效率,還可改進傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品風味欠佳的缺點[23]。雖然近幾年在采用其它原料混菌發(fā)酵生產(chǎn)食醋方面有研究報道,例如王陶等[24]開展了以紫薯和杏鮑菇為原料,經(jīng)果酒酵母和醋桿菌混合發(fā)酵生產(chǎn)復合醋方面的研究,但混菌發(fā)酵應(yīng)用于生產(chǎn)芒果醋目前鮮見報道。

本研究以百色市芒果為原料,對采用酵母菌醋酸菌混菌發(fā)酵生產(chǎn)芒果醋的條件進行優(yōu)化,并對生產(chǎn)的芒果醋的質(zhì)量進行了評價,旨在為芒果的進一步深加工利用提供有效的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芒果 購于百色市芒果街水果批發(fā)市場;酵母菌 安琪葡萄酒果酒專用酵母粉(SY10 g);醋酸菌SS-019 實驗室保藏;果膠酶(30萬 U/g) 泰安信得利生物工程有限公司;白砂糖(一級品) 柳冰食品廠;異抗壞血酸鈉(食品級) 河南康之旺生物科技有限公司;其它試劑 均為分析純。

LRH-70型生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司;FAI2048型電子分析天平 上海市安享電子儀器廠;HH-S1型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金怡儀器有限公司;HYG-B型全溫搖瓶柜 江蘇常州金壇良友儀器有限公司;JYL-Y917型榨汁機 九陽股份有限公司;手持折光儀 上海勃基儀器儀表有限公司;GJJ-0.03/100型高壓均質(zhì)機 上海諾尼輕工機械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 醋酸菌活化培養(yǎng)基(g/L):酵母膏12.0,葡萄糖12.0,碳酸鈣15.0,瓊脂18.0,pH5.5,培養(yǎng)基滅菌后,加入5%經(jīng)過濾除菌的無水乙醇。

醋酸菌種子培養(yǎng)基(g/L):酵母膏12.0,葡萄糖12.0,pH5.5,培養(yǎng)基滅菌后,加入5%經(jīng)過濾除菌的無水乙醇。

1.2.2 芒果醋釀制工藝流程 在Kaushik等[25]所報道的制取芒果漿工藝流程基礎(chǔ)上加以改進制作出芒果汁;然后發(fā)酵芒果汁生產(chǎn)芒果醋。整個試驗過程中具體的操作流程如下:

1.2.3 芒果醋釀制工藝的操作要點 芒果汁的制備:挑選芒果表皮光滑且果皮皮色黃橙,無機械損傷、無病蟲害的新鮮芒果,洗凈之后放入90 ℃的熱水浴中燙3 min,剝皮切塊、打漿,加0.01%異抗壞血酸鈉防止果汁發(fā)生酶促褐變[26],然后再加0.1%果膠酶于55 ℃的恒溫水浴鍋中酶解1.5 h,用四層無菌紗布過濾,得芒果汁備用。

調(diào)整芒果汁糖度與酸度:取少量芒果汁先溶解白砂糖,然后加入芒果汁中,調(diào)整芒果汁糖度到發(fā)酵用糖度,再添加適量的檸檬酸調(diào)整果汁酸度到pH5.0。

滅菌:將調(diào)配糖度和酸度后的芒果汁放入熱水浴中進行殺菌滅酶,待果汁中心溫度達到80 ℃時,繼續(xù)保溫8 min,保溫時間結(jié)束后,立即冷卻至28～30 ℃,備用。

菌種活化:酵母菌活化種子液:按照10 g酵母粉加100 mL 5%糖濃度的芒果汁的比例,稱取所需酵母于38 ℃條件下攪拌,活化約15～20 min,出現(xiàn)大量小氣泡即可[27],備用。醋酸菌活化種子液:將保藏菌種進行平板劃線培養(yǎng),然后將活化的醋酸菌接入種子培養(yǎng)基中,于30 ℃、130 r/min的恒溫搖瓶柜培養(yǎng)36 h[24],備用。

果醋釀造:將50 mL調(diào)配糖度和酸度后的芒果汁裝入經(jīng)過高溫滅菌的三角瓶中,分別接入一定量的酵母菌與醋酸菌種子液,然后分別放置在一定的溫度條件下,于130 r/min的恒溫搖瓶柜分別培養(yǎng)6～11 d。發(fā)酵期間每天測定醋酸含量,直到醋酸含量不再上升或上升緩慢時即可停止發(fā)酵。發(fā)酵原果醋經(jīng)過陳釀、過濾、均質(zhì)、殺菌、無菌裝瓶等工序,即得芒果醋成品。

1.2.4 混菌發(fā)酵單因素實驗

1.2.4.1 芒果汁初始糖度對混菌發(fā)酵的影響 按照“1.2.3”所述的基本步驟,調(diào)節(jié)芒果汁初始糖度分別為10、12、14、16、18和20 °Bx,其它固定因素如下:酵母菌接種量0.15%,醋酸菌接種量8%,發(fā)酵溫度30 ℃,發(fā)酵時間7 d,發(fā)酵結(jié)束后,測定果醋中乙酸含量。

1.2.4.2 酵母菌接種量對混菌發(fā)酵的影響 按照“1.2.3”所述的基本步驟,酵母菌接種量分別為0.05%、0.1%、0.15%、0.20%、0.25%(v/v),其它固定因素如下:芒果汁糖度16 °Bx,醋酸菌接種量8%,發(fā)酵溫度30 ℃,發(fā)酵時間7 d,發(fā)酵結(jié)束后,測定果醋中乙酸含量。

1.2.4.3 醋酸菌接種量對混菌發(fā)酵的影響 按照“1.2.3”所述的基本步驟,醋酸菌接種量分別為4%、6%、8%、10%、12%、14%(v/v),其它固定因素如下:芒果汁糖度16 °Bx,酵母菌接種量0.15%,發(fā)酵溫度30 ℃,發(fā)酵時間7 d,發(fā)酵結(jié)束后,測定果醋中乙酸含量。

1.2.4.4 發(fā)酵溫度對混菌發(fā)酵的影響 按照“1.2.3”所述的基本步驟,將發(fā)酵溫度分別設(shè)置為26、28、30、32、34、36 ℃,其它固定因素如下:芒果汁糖度16 °Bx,酵母菌接種量0.15%,醋酸菌接種量8%,發(fā)酵時間7 d,發(fā)酵結(jié)束后,測定果醋中乙酸含量。

1.2.4.5 發(fā)酵時間對混菌發(fā)酵的影響 按照“1.2.3”所述的基本步驟,發(fā)酵時間分別為6、7、8、9、10、11 d,其它固定因素如下:芒果汁糖度16 °Bx,酵母菌接種量0.15%,醋酸菌接種量8%,發(fā)酵溫度30 ℃,發(fā)酵結(jié)束后,測定果醋中乙酸含量。

1.2.5 正交試驗 為了確定混菌發(fā)酵芒果醋的最優(yōu)條件,以發(fā)酵結(jié)束時果醋中乙酸含量為指標,根據(jù)單因素實驗的結(jié)果分析,固定酵母菌添加量為0.15%(v/v)、恒溫搖瓶柜的轉(zhuǎn)速為130 r/min,選取芒果汁初始糖度、醋酸菌添加量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間4個因素進行L9(34)正交實驗,因素與水平見表1。按照“1.2.3”所述的基本步驟進行了各種組合試驗。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.6 芒果醋指標的測定 總糖:DNS法,準確量取適量待測液,加入DNS試劑并沸水浴5 min后定容,在520 nm處測定吸光值,以g/100 mL的葡萄糖為單位[28]?？偹?采用酸堿滴定法,準確量取適量待測樣品,用80 ℃煮沸過的水在沸水浴中提取30 min后,定容并過濾,濾液用NaOH溶液滴定,以g/100 mL的乙酸為單位[29]?？扇苄怨绦挝?采用阿貝折光儀直接測定,數(shù)值表示為20 ℃時的質(zhì)量分數(shù)(%)[30]。大腸菌群:依據(jù)GB 4789.3-2010中大腸菌群MPN計數(shù)法對芒果醋中大腸菌群進行計數(shù),通過觀察月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯管、煌綠乳糖膽鹽肉湯管產(chǎn)氣情況來檢驗,以每mL檢樣中大腸菌群最可能數(shù)(MPN)計[31]。沙門氏菌:依據(jù)GB 4789.4-2016對芒果醋中的沙門氏菌進行檢驗,以每mL樣品中檢出或未檢出沙門氏菌為結(jié)果[32]。金黃色葡萄球菌:依據(jù)GB 4789.10-2016第一法對芒果醋中金黃色葡萄球菌作定性檢驗,以每mL樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌為結(jié)果[33]。

1.2.7 芒果醋感官評價方法 將在優(yōu)化條件下發(fā)酵得到的芒果醋按照國家標準配制成含0.4%醋酸濃度與鮮芒果汁配制成芒果醋飲料后,以《NY/T 2987-2016 綠色食品果醋飲料》[34]標準為感官評價依據(jù),采用9段愉悅標度[35]評價芒果醋飲料的感官屬性(色澤、滋味和氣味、組織狀態(tài)、雜質(zhì))和整體評價;給分標準如下:1-極討厭,2-很討厭,3-中度討厭,4-稍討厭,5-既不討厭也不喜歡,6-稍喜歡,7-中度喜歡,8-很喜歡,9-極喜歡。評價小組成員人數(shù)為50名,男女各占一半,成員通過在自然光亮處目測色澤、組織狀態(tài)和雜質(zhì),嗅其氣味、品嘗滋味后對芒果醋的感官屬性和整體評價進行賦分。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個試驗點重復三次,結(jié)果用平均值±標準偏差來表示。實驗數(shù)據(jù)采用PASW Statistics 18軟件進行方差分析,多重比較采用LSD法。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 芒果汁初始糖度對果醋發(fā)酵的影響 由圖1可知,乙酸含量隨發(fā)酵糖度的增加而呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢,不同芒果汁初始糖度對醋酸發(fā)酵的影響顯著(P<0.05)。當初始糖度小于14° Bx時,果醋中乙酸含量隨著芒果汁糖度的增加而升高;初始糖度超過14° Bx后,生成乙酸的含量反而下降。前者糖濃度低,導致酵母菌與醋酸菌得不到充足的營養(yǎng)進行生長繁殖與代謝,因此產(chǎn)乙酸量較低;后者初始糖度過高,對酵母菌的生物活性起到抑制作用,葡萄糖轉(zhuǎn)化率下降,進而被醋酸菌轉(zhuǎn)化成的乙酸量就少[36]。再者,由多重比較得出,14° Bx的初始糖度產(chǎn)酸能力較強,其乙酸含量與其它糖度的相比差異顯著(P<0.05)。因此,芒果汁初始糖度為14° Bx最佳。

圖1 芒果汁初始糖度對乙酸含量的影響Fig.1 Effect of the initial sugar content ofmango juice on the content of acetic acid注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);圖2～圖5同。

2.1.2 酵母菌接種量對果醋發(fā)酵的影響 由圖2可知,不同酵母菌接種量對產(chǎn)酸含量差異顯著(P<0.05)。酵母菌接種量在小于0.15%范圍內(nèi),芒果醋中乙酸含量隨著酵母菌接種量的增加而逐漸升高;當酵母菌接種量為0.15%(v/v)時,產(chǎn)乙酸含量最高,達到4.68 g/100 mL;當酵母菌接種量超過0.15%(v/v)時,乙酸含量明顯下降,這是由于酵母菌快速繁殖消耗了過多的營養(yǎng),從而導致菌體老化[37],同時,醋酸菌得不到足夠的營養(yǎng),導致生長受到抑制,產(chǎn)醋酸量減少。由LSD法多重比較可知,0.15%(v/v)接種量的乙酸含量顯著高于其它接種量(P<0.05),因此,選擇酵母菌最佳接種量為0.15%(v/v)。

圖2 酵母菌接種量對乙酸含量的影響Fig.2 Effect of the inoculation quantity ofyeast on the content of acetic acid

2.1.3 醋酸菌添加量對乙酸含量的影響 醋酸菌接種量對菌體的產(chǎn)酸能力和發(fā)酵周期具有較大的影響。當接種量過大時,菌體快速增長以及分泌大量的代謝物,從而導致菌體提前老化而衰亡,產(chǎn)酸量減少[38]。醋酸菌的接種量過小,菌體生長慢,發(fā)酵周期延長[39],產(chǎn)酸量低。不同的醋酸菌接種量(4%～14%(v/v))對芒果醋發(fā)酵的影響見圖3。由圖3可知,不同醋酸菌接種量對醋酸發(fā)酵的影響明顯。當接種量為10%(v/v)時,乙酸含量最高,當接種量超過10%時,產(chǎn)乙酸含量迅速下降。由LSD法多重比較可知,10%醋酸菌接種量產(chǎn)酸顯著高于其它接種量(P<0.05),因此,選擇醋酸菌接種量為10%。

圖3 醋酸菌接種量對乙酸含量的影響Fig.3 Effect of the inoculation quantity ofacetic acid bacteria on the content of acetic acid

2.1.4 發(fā)酵溫度對果醋發(fā)酵的影響 由圖4可以看出,不同發(fā)酵溫度對醋酸發(fā)酵的影響顯著(P<0.05)。醋酸含量隨著發(fā)酵溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,當發(fā)酵溫度為32 ℃,芒果醋中乙酸含量最高,為4.66 g/100 mL;發(fā)酵溫度高于32 ℃,加快菌體老化,菌體內(nèi)酶系活性降低,反而會導致果醋中乙酸含量下降。此外,高溫(36 ℃)對菌體酶系活性破壞比低溫(26 ℃)抑制菌體活性還要大,因此36 ℃下產(chǎn)酸量比26 ℃的產(chǎn)酸量減少了8.72%。由LSD法多重比較可知,32 ℃下產(chǎn)酸顯著高于其它溫度(P<0.05),因此,選擇芒果醋醋酸發(fā)酵的發(fā)酵溫度為32 ℃。

圖4 發(fā)酵溫度對乙酸含量的影響Fig.4 Effect of the fermentation temperature on the content of acetic acid

2.1.5 發(fā)酵時間對果醋發(fā)酵的影響 由圖5可以看出,在發(fā)酵過程中,產(chǎn)酸量隨著發(fā)酵周期的延長呈先增加后緩慢下降趨勢,不同發(fā)酵時間對乙酸含量的影響明顯。在9 d時,發(fā)酵液中的乙酸含量最高,繼續(xù)延長芒果醋的發(fā)酵時間,產(chǎn)酸量反而下降。可能的原因是當乙醇被醋酸菌完全消耗后,醋酸菌又將部分乙酸降解為H2O和CO2,發(fā)生過氧化現(xiàn)象[40]。由LSD法多重比較可知,發(fā)酵到第9 d時的產(chǎn)酸量雖然和第10 d的產(chǎn)酸量差異不顯著(P>0.05),但顯著高于其他發(fā)酵時間(P<0.05),考慮時間成本、低耗能等因素,選擇發(fā)酵9 d為最合適的發(fā)酵時間。

圖5 發(fā)酵時間對乙酸含量的影響Fig.5 Effect of the fermentation time on the content of acetic acid

2.2 芒果醋發(fā)酵正交試驗結(jié)果分析

按照表1選取的因素和水平,進行正交試驗,結(jié)果見表2。由表2中極差分析可知,各因素對芒果汁發(fā)酵液中乙酸含量的影響主次順序為:B(醋酸菌接種量)>D(發(fā)酵時間)>C(發(fā)酵溫度)>A(芒果汁糖度);其中芒果醋發(fā)酵的最優(yōu)方案為A2B3C2D2,即:芒果汁發(fā)酵初始糖度為14 °Bx,醋酸菌加入量為12%(v/v),芒果醋發(fā)酵溫度為32 ℃,發(fā)酵周期為9 d。對正交實驗結(jié)果做主效應(yīng)的方差分析,結(jié)果見表3。由表3可知,根據(jù)混菌發(fā)酵芒果醋的四個因素的均方大小來判斷主次因素為B>D>C>A,與極差分析結(jié)果一致;四個因素對醋酸發(fā)酵的影響極顯著(P<0.01)。

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

2.3 驗證實驗

經(jīng)極差分析和正交分析,得出最佳組合為A2B3C2D2,但不在正交試驗表中,因此需要進行驗證實驗。將A2B3C1D2和A2B3C2D2兩個方案分別進行3次重復試驗,結(jié)果:A2B3C2D2工藝產(chǎn)乙酸含量(4.93±0.02) g/100 mL,比A2B3C1D2工藝的產(chǎn)酸量高1.65%,對兩個組合的結(jié)果進行方差分析,結(jié)果顯示A2B3C2D2工藝產(chǎn)乙酸含量顯著高于A2B3C1D2工藝的產(chǎn)酸量(P<0.01)。因此,選擇發(fā)酵條件的最佳組合為A2B3C2D2,即芒果汁糖度為14 °Bx、醋酸菌接種量為12%(v/v),在32 ℃恒溫振蕩器中發(fā)酵9 d,產(chǎn)酸量達到4.93 g/100 mL。

2.4 芒果醋及其飲料的質(zhì)量指標

2.4.1 感官指標 芒果醋感官評價主要從芒果醋色澤、風味(滋味和氣味)、組織狀態(tài)和雜質(zhì)等方面評分,從圖6可以看出,就色澤而言,成品芒果醋飲料色澤金黃、澄清透明、有光澤,視覺感官讓人十分愉悅,分值為7.8分。從風味來看,芒果醋飲料香氣明顯,有伴有芒果清香,醋飲料味酸,滋味豐富,有層次感,爽口,分值為7.9分。對于飲料的組織狀態(tài)來說,醋飲料清澈,較均勻細膩,無分層,無凝塊,分值為6.8分。在正常視力下,芒果醋飲料中無可見外來雜質(zhì),分值最高,為9分。綜合色澤、滋味和氣味、組織狀態(tài)和雜質(zhì)等感官屬性的整體評價為8.0分。

圖6 芒果醋飲料的感官評價Fig.6 Sensory evaluation of mango vinegar drink

2.4.2 微生物和理化指標測定 關(guān)于所得芒果醋的衛(wèi)生指標和理化指標見表4和表5。由這兩個表可以看出,所得芒果醋的衛(wèi)生指標和理化指標都達到了《NY/T 2987-2016 綠色食品果醋飲料》的標準。

表4 芒果醋的微生物指標Table 4 Microbe of mango vinegar

表5 芒果醋的理化指標Table 5 Physicochemical indexes of mango vinegar

3 結(jié)論

采用酵母菌醋酸菌混菌發(fā)酵芒果汁生產(chǎn)芒果醋的優(yōu)化條件如下:酵母菌添加量為0.15%(v/v),芒果汁初始糖度為14 °Bx,醋酸菌接種量為12%(v/v),在32 ℃、130 r/min的恒溫搖瓶柜培養(yǎng)9 d,芒果醋中乙酸含量達到4.93 g/100 mL。發(fā)酵完成后對芒果醋進行離心澄清,經(jīng)過陳釀后可得到色澤均勻、金黃,無懸浮物,酸味柔和不刺激,具有芒果獨特的香味和醋香,衛(wèi)生和理化指標均符合發(fā)酵果醋的國家標準要求。將果醋按國家標準配制成芒果醋飲料后,采用9段愉悅評分法進行的感官評定結(jié)果表明,芒果醋飲料具有很好的消費者可接受性。所發(fā)展出來的新的芒果醋加工方法,能生產(chǎn)出新型的營養(yǎng)保健型果醋及其飲料,具有廣闊的開發(fā)價值。