崔鵬月1,2,彭 燦3,劉松玲2,4,5,朱宗濤2,蘇 敦2,4,5,雙 全

(1.內蒙古農業(yè)大學食品科學與工程學院,內蒙古呼和浩特 010018; 2.深圳市華大農業(yè)應用研究院,廣東深圳 518120; 3.深圳市環(huán)境微生物基因組學與應用重點實驗室,廣東深圳 518083; 4.深圳華大生命科學研究院,廣東深圳 518083; 5.深圳國家基因庫,廣東深圳 518120)

炎癥反應是由組織損傷或病原體感染引發(fā)的免疫反應過程,當免疫反應發(fā)生紊亂或者持續(xù)時間過長,會使細胞持續(xù)分泌促炎因子,從而引發(fā)慢性炎癥損傷,進一步引發(fā)多種慢性疾病,包括動脈粥樣硬化、肥胖、糖尿病等[1]。過去幾十年來,人們對益生菌在這些慢性疾病的炎癥反應中所起的作用表現(xiàn)出濃厚的興趣[2-3]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),益生菌可通過其免疫作用[4]、代謝作用[5]和調節(jié)腸道菌群[6]等多種機制來緩解炎癥反應進而維持機體穩(wěn)態(tài)。

目前的研究主要集中在改善炎癥反應益生菌的鑒定[7-8]和改善炎癥反應機理[9]。然而,如何篩選具有炎癥調節(jié)作用的益生菌菌株是個難題。巨噬細胞是主要的免疫細胞,分泌細胞因子的水平在評價細胞免疫功能中至關重要[10],因此研究益生菌與炎癥巨噬細胞體外的相互作用對具有炎癥調節(jié)作用益生菌的篩選有著重要意義。

為了找到具有潛在調節(jié)炎癥反應的益生菌,本文利用細胞模型分析10株供試菌株對炎癥模型細胞分泌炎性細胞因子的調節(jié)作用,并比較優(yōu)選出的4株潛在益生菌的胃腸道耐受能力、粘附能力、抑菌能力和抗生素敏感性,以期為特定功能益生菌的開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株來源 深圳華大農業(yè)應用研究院,試驗所用10株菌的菌株來源如表1所示,菌種存于50%甘油管中,放置于-20 ℃保存?zhèn)溆?BS培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基 中國青島海博生物技術有限公司;佛波酯、脂多糖Lipopolysaccharides(LPS) Sigma;ELISA:3種免疫因子檢測試劑盒 R&D Systems;PRMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、FALCON胰蛋白酶(1∶250) Gibco;胃蛋白酶(1∶10000) Coolaber;細胞培養(yǎng)板 Axygen;PBS緩沖液 Beyotime;慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、新霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素、紅霉素、克林霉素、氯霉素、甲氧芐啶、環(huán)丙沙星、利福平、萬古霉素 BBI Life Sciences;實驗所用其他試劑 均為國產分析純;HT-29人結腸癌細胞 協(xié)和醫(yī)科大學基礎所細胞中心。

表1 實驗菌種Table 1 Lactobacillus strains in experiment

YXQ-30SII立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業(yè)有限公司;FP1100全自動生長曲線儀 芬蘭百奧斯科林公司;58108冷凍高速離心機 德國Eppendorf;Galaxy170R CO2培養(yǎng)箱 德國Eppendorf;Synergy 2酶標儀 美國BioTek;SHP-250Y生化培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設備有限公司;DW-86L490超低溫保存箱 青島海爾股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株對LPS誘導的THP-1細胞炎性細胞因子調節(jié)作用 參考徐棟花等[11]、謝超等[12]的方法加以改進。將待測菌株中的雙歧桿菌以3%接種量接種于BS培養(yǎng)基中(厭氧管),其余待測菌株以相同的接種量接種于MRS培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)18 h,傳代培養(yǎng)2次。將活化好的待測菌株,37 ℃培養(yǎng)至穩(wěn)定期,離心收集菌體,PBS洗滌2～3次,熱滅活后,將菌體懸浮于RPMI 1640基礎培養(yǎng)基中,調整為1×107CFU/mL備用。

從液氮罐中取出THP-1細胞進行常規(guī)復蘇、傳代培養(yǎng),培養(yǎng)細胞數(shù)量擴增至所需用量。調整THP-1細胞數(shù)為1×106cell/mL,接種于6孔板(共2 mL培養(yǎng)基),加入100 ng/mL的佛波酯(PMA)對THP-1進行誘導處理72 h成為巨噬細胞(Macrophage)。去除培養(yǎng)上清,用RPMI1640基礎培養(yǎng)基洗滌2～3次,加入含有受試菌株菌懸液(1×107CFU/mL)的RPMI 1640培養(yǎng)基進行共培養(yǎng)16 h,每個受試菌株設置3個復孔。對照組為Macrophage+RPMI 1640基礎培養(yǎng)基。模型組為Macrophage+RPMI 1640基礎培養(yǎng)基,然后除對照組以外各孔添加脂多糖(LPS)母液,至終濃度為1 μg/mL,處理6 h后,用相應的試劑盒檢測細胞培養(yǎng)上清液中炎性細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量變化,用以篩選出具有抗炎能力的益生菌。

1.2.2 模擬胃腸液耐受試驗 參考文獻[13-14]方法加以改進后進行試驗。在pH2.0和pH3.0無菌PBS中,加入3.5 g/L胃蛋白酶過濾除菌,制成模擬胃液。在pH8.0無菌PBS中,加入1.0 g/L胰蛋白酶和0.3%膽鹽過濾除菌,制成模擬腸液,試驗前需要對人工模擬胃液、腸液進行37 ℃預熱,備用。

供試菌株傳代培養(yǎng)2次,菌株長至穩(wěn)定期時,各取1 mL菌液,離心收集菌體,PBS洗滌2～3次,分別加入與培養(yǎng)液等量的pH2.0和pH3.0模擬胃液,37 ℃培養(yǎng)3 h,用平板計數(shù)法測活菌數(shù)。菌株存活率的計算公式為:菌株的存活率(%)=3 h活菌數(shù)/0 h活菌數(shù)×100。

取1 mL菌液,離心收集菌體,PBS洗滌2～3次,分別加入與培養(yǎng)液等量的pH3.0模擬胃液,37 ℃培養(yǎng)3 h,離心收集菌體,加入1 mL模擬腸液繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)3 h,用平板計數(shù)法分別檢測菌體與人工模擬胃液37 ℃共培養(yǎng)0 h時的活菌數(shù)和檢測菌體與腸液37 ℃共培養(yǎng)3 h后的活菌數(shù),菌株的存活率的計算公式為:菌株的存活率(%)=3 h活菌數(shù)/0 h活菌數(shù)×100。

1.2.3 菌株粘附能力試驗 參考Gagnon等[15]方法并加以改進。離心收集培養(yǎng)至穩(wěn)定期的供試菌株,并用PBS洗滌2～3次,最后用細胞完全培養(yǎng)基(RPMI 1640+10%胎牛血清)將其重懸至5×108CFU/mL備用。從液氮罐中取出HT-29細胞,進行復蘇、傳代培養(yǎng),培養(yǎng)細胞數(shù)量擴增至所需用量后,將HT-29細胞接種于12孔板中,待細胞長至單層后,用無菌PBS沖洗細胞2～3次,然后加入1 mL供試菌株懸浮液。培養(yǎng)2 h后,PBS沖洗2～3次,用300 μL的胰蛋白酶消化3 min,加入700 μL含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液終止反應。并將所得溶液收集至無菌EP管中,并將收集的溶液進行10倍梯度稀釋,涂板計數(shù)。同時對空白組的細胞進行計數(shù)。供試菌株的粘附能力的計算公式為:粘附能力(CFU/cells)=每個培養(yǎng)皿內粘附的細菌總數(shù)/每個培養(yǎng)皿的總細胞數(shù)。

1.2.4 抑菌試驗 采用牛津杯法[16]檢測供試菌株對四種致病菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和陰溝腸桿菌)的抑制活性。分別取0.1 mL四種致病菌懸液(108CFU/mL)于凝固的營養(yǎng)瓊脂平板涂布,平衡30 min。用無菌的鑷子把無菌的牛津杯放在涂有病原菌平板上,然后吸取0.25 mL供試菌株發(fā)酵液109CFU/mL于牛津杯中。平放37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,檢測抑菌圈直徑大小。

1.2.5 藥敏試驗 參考文獻[17]進行試驗,對供試菌株進行13種抗生素敏感性試驗。依據(jù)實驗室原有說明書配制各類抗生素母液,取50 μL添加于96孔板中。活化菌株,調整菌液濃度到1×109CFU/mL,取50 μL菌液置于各樣孔,培養(yǎng)48 h,OD625分光光度計掃描檢測。以干酪乳桿菌ATCC334為質控,陰性對照組添加50 μL去離子水和50 μL MRS培養(yǎng)液,陽性對照組添加50 μL去離子水和50 μL待測菌株的MRS菌液。當陽性對照組孔內細菌明顯生長時,試驗才有意義。樣品孔的檢測值(OD625)低于陰性對照組的2倍即可視為停止生長,并讀取該孔抗生素濃度即為抗生素對實驗菌株的最小抑菌濃度(MIC)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗中涉及的試驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差(Mean士SD)。采用SPSS 17.0軟件對試驗中涉及的數(shù)據(jù)進行顯著性分析。

2 結果與討論

2.1 改善模型細胞炎癥反應益生菌的篩選

脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性細菌外膜的主要成分,作為一種天然免疫刺激劑,能刺激THP-1巨噬細胞合成并釋放多種細胞因子,如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)及白細胞介素6(interleukin 6,IL-6)和白細胞介素1β(interleukin1β,IL-1β)等[18-19],因此以炎癥巨噬細胞為模型評價供試菌株的抗炎作用。由圖1可知,與空白組相比經LPS誘導的模型組的TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著升高(P<0.05),說明炎癥模型建立成功。供試菌株對炎癥細胞進行干預發(fā)現(xiàn),10株菌對不同的炎癥性細胞因子的表達顯示了不同的作用。由圖1A可知,與模型組相比,各組均未顯著降低TNF-α的水平。而SS-9、JQI-7、SD-H9和LLY-606均顯著降低了炎癥模型細胞的IL-1β的表達(P<0.05),并且與空白對照組無顯著差異(圖1B)。同時,菌株WX-94和SS-9顯著降低了炎癥模型細胞的IL-6的表達(P<0.05),并且與空白對照組無顯著差異(圖1C)。菌株SD-L8雖未顯著降低炎癥模型細胞IL-1β和IL-6的分泌,但可以發(fā)現(xiàn)其干預結果從數(shù)值上是降低了炎癥模型細胞IL-1β和IL-6的分泌,并與SS-9干預的結果無顯著差異(圖1B、圖1C)。因此推測菌株SD-L8具有降低炎性細胞因子分泌的潛能。目前研究證明,許多菌株可以在體外具有降低炎性細胞因子分泌的能力,但其作用的炎性細胞因子的類型存在差異。王侃[20]在研究中驗證了乳酸桿菌(LactobacilluscaseiCICC6002)能顯著降低炎癥模型細胞TNF-a的分泌(P<0.05)。Yoon等[21]研究表明,鼠李糖乳桿菌BFE5264和植物乳桿菌NR74能抑制由LPS刺激、PMA誘導的THP-1細胞分泌炎性細胞因子IL-1β和TNF-α。池海波等[22]研究發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌ATCC53608能夠明顯抑制脂多糖(LPS)刺激的小鼠巨噬細胞系RAW 264.7R分泌炎性細胞因子IL-6。本試驗中的供試菌株除不能顯著降低炎癥模型細胞TNF-a的分泌外,SS-9、SD-H9、WX-94和SD-L8對模型細胞炎癥反應的干預情況與以上研究結果相近。

圖1 菌株對巨噬細胞THP-1炎癥性細胞因子分泌的調節(jié)作用Fig.1 Regulatory of strains on macrophagesTHP-1 inflammatory cytokine secretion注:*代表與空白組相比較,差異顯著,P<0.05;#代表與模型組相比較,差異顯著,P<0.05;Δ代表與SS-9組相比較,差異不顯著,P>0.05。

綜合考慮試驗菌株對模型細胞炎癥反應的干預情況,認為SS-9、SD-H9、WX-94和SD-L8具有改善炎癥反應的潛力,因此選取以上四株菌對胃腸道耐受能力、粘附能力、抑菌能力和抗生素敏感性進行評價。

2.2 菌株胃腸道耐受能力評價

益生菌相關產品通常以口服方式,經過胃到達腸道發(fā)揮其益生作用。攝入食物不同時胃的pH也不盡相同,其范圍為1.5～5,并且正常人體內,十二指腸中膽汁鹽的濃度可達到0.3～3 g/kg[18-19]。因此,對胃液低pH和腸液中的膽鹽在一定時間內有良好的耐受性是選擇益生菌的重要標準之一[20]。從表2可以看出所有菌株在pH3.0的人工胃液3 h后均能保持較高的存活率(81.02%～98.55%),表現(xiàn)出對pH3.0的人工胃液有良好的耐受性;而經過pH2.0的人工胃液處理后,所有菌株的存活率較pH3.0的人工胃液低,SD-L8的存活率最高可達到46.82%;SS-9的存活率次之,可達到12.30%;其余兩株菌的存活率均未達到1%,推測以上4株菌在pH2.0的人工胃液下耐受性較差。

表2 菌株在模擬胃腸道環(huán)境下的存活率Table 2 Survival rate of bacteria insimulated gastrointestinal environment

所有菌株在pH3.0的人工胃液3 h后進入人工腸液,處理3 h后,表現(xiàn)出對人工胃腸液具有不同程度的耐受能力,SS-9的存活率最高可達到58.40%;SD-L8、WX-94和SD-H9存活率分別為32.53%、39.41%和34.00%。

本試驗中供試菌株對人工胃液耐受結果與劉蕓等[23]研究結果相近:植物乳桿菌FJAT-7926和干酪乳桿菌FJAT-7928對pH3.0人工胃液有良好的耐受性,處理2 h后,存活率分別為82.98%和77.42%。而pH2.0的人工胃液對植物乳桿菌FJAT-7926和干酪乳桿菌FJAT-7928的存活影響較大,處理2 h后,存活率分別為0.02%和0.07%。供試菌株對人工腸液耐受性優(yōu)于高彩霞等[24]研究結果中干酪乳桿菌 BD0054、干酪乳桿菌LC2W和腸膜明串珠菌腸膜亞種BD1710對人工腸液的耐受性。

2.3 菌株粘附能力評價

菌株粘附于腸壁細胞的能力是其發(fā)揮作用的首要因素[25]。本研究以HT-29結腸細胞為模型評價菌株的粘附潛力。由圖2可以看出各菌株粘附能力存在顯著差異(P<0.05),SD-L8的粘附能力最強,可達到(14.5±1.3) CFU/cells,WX-94的粘附能力最弱,也可達到(5.2±1.0) CFU/cells,SD-H9與SS-9的粘附能力,分別為(9.5±0.8)、(7.5±0.8) CFU/cells。以上結果表明,四株菌均可定植于腸道上皮細胞,并且與李海紅等[26]研究結果相似:鼠李糖乳桿菌具有較強的定植能力。乳酸菌對細胞粘附具有菌株差異性,即使是同源菌株對腸上皮細胞也具有不同的粘附特性[27]。目前普遍認為乳酸菌的粘附性是決定其免疫調節(jié)活性的重要因素之一,粘附能力強的乳酸菌能更好地增強機體的免疫應答[28]。菌株對細胞粘附能力的特異性與環(huán)境之間相互作用中涉及的結構分子直接相關,例如胞外多糖、菌毛、脂磷壁酸、表面蛋白等[27]。推測以上物質可能在菌株調節(jié)機體免疫應答中發(fā)揮一定作用。

圖2 菌株對HT-29 細胞的粘附能力Fig.2 Adhesion of bacteria to HT-29 cells注:字母不同表示差異顯著,P<0.05。

2.4 菌株抑菌能力評價

目前普遍認為益生菌可以通過產生有機酸、過氧化氫和類似細菌素的蛋白或肽類等物質,抑制或殺死病原菌,以維持腸道微生態(tài)平衡,保護人體免疫系統(tǒng)[29]。本試驗采用牛津杯法分別探究以上四株乳酸菌對四株指示菌的抑制能力,結果如表3所示。四株乳酸菌對四株指示菌均有不同程度的抑制作用。SD-H9較其他三株菌相比對大腸桿菌的抑制能力較強,差異顯著(P<0.05);WX-94對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的抑制能力較強,差異顯著(P<0.05);菌株SD-H9和WX-94對陰溝腸桿菌的抑制作用與菌株SD-L8和SS-9相比較弱,差異顯著(P<0.05)。

表3 菌株對指示菌的抑菌圈直徑Table 3 Bacteriostatic zone of the bacterial strain against the indicator bacteria

2.5 菌株抗生素敏感性評價

在現(xiàn)代醫(yī)學中,抗生素是防御細菌感染的主要方法,但細菌可以通過各種機制來對抗抗生素[30]。抗生素耐藥性正在以驚人的速度發(fā)展,并已成為一個日益增長的全球公共衛(wèi)生問題[31]。一些乳酸菌對一種或多種抗生素具有抗性[32]。本試驗中抗生素敏感性測定參考歐洲食品安全局(EFSA)現(xiàn)行標準[33]和WHO提供的NCCLS標準[34]。分析以上四株乳酸菌對13種抗生素的敏感性,與其相應的MIC安全臨界值進行比較,并選用干酪乳桿菌ATCC334為質控菌株。結果如表4所示,質控菌株干酪乳桿菌ATCC334對抗生素的敏感性與報道[17]中的相符,試驗結果可信。SD-L8對新霉素的MIC值超過了其MIC安全臨界值;WX-94對慶大霉素的MIC值超過了其MIC安全臨界值;SS-9對紅霉素和克林霉素的MIC值超過了其MIC安全臨界值;SD-H9對13種抗生素的MIC值均符合MIC安全范圍。因鼠李糖乳桿菌、羅伊氏乳桿菌和植物乳桿菌在中國食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《可用于保健食品的益生菌菌種名單》中,因此這三株菌可以在食品生產加工使用(嬰幼兒食品除外)。

表4 菌株對13種抗生素的MIC(μg/mL)Table 4 MIC values of bacteria to 13 kinds of antibiotics(μg/mL)

3 結論

本研究通過評價菌株對巨噬細胞炎癥模型的干預作用,篩選出四株(SD-H9、WX-94、SD-L8和SS-9)具有抑制模型細胞分泌炎性細胞因子的潛在益生菌,并且通過檢測菌株的胃腸道耐受能力、粘附能力、抑菌能力和抗生素耐受性發(fā)現(xiàn),SS-9的整體胃腸道耐受能力最好,SD-L8的粘附能力最強,SD-H9對13種抗生素的敏感性均在安全范圍內,并且四株菌對指示菌都有抑制作用。因此以上四株菌可作為具有抗炎能力的潛在后選菌株,后續(xù)還需要進行動物試驗和臨床試驗來進一步驗證菌株在體內的功效。