(湖北中醫(yī)藥大學藥學院,湖北武漢 430065)

甘草是一種常見的可藥食同源的草本生植物,因其具有補脾益氣、調(diào)和諸藥、清熱解毒等功效[1],而在醫(yī)藥、食品、煙草等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。甘草的主要成分有三萜皂苷類、黃酮類、多糖類等[2],其中三萜皂苷類的甘草酸和黃酮類的甘草苷通常被認為是甘草的主要生物活性成分,因此,已有大量關(guān)于其提取工藝、生物活性等相關(guān)報道[3-5]。目前,在甘草的加工應(yīng)用過程中,通常是提取其中的主要有效成分使用,提取后的副產(chǎn)物甘草渣當作殘渣或是丟棄或是用作飼料,這樣不僅污染環(huán)境,也造成了甘草資源浪費。雖然,已有眾多研究學者日漸關(guān)注甘草渣的再利用[6-7],但是對于甘草渣中有效成分提取再利用關(guān)注較多的當屬黃酮類,對多糖的研究甚少。

植物多糖是由多個單糖以糖苷鍵相連而成的高分子化合物[8],它作為一種天然的生物分子,具有良好的生物相容性、生物降解性和低細胞毒性。現(xiàn)代藥理研究表明,植物多糖還具有多重藥理活性[9],如調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗腫瘤、降血脂、抗菌等,因此已在醫(yī)藥、食品、輕工業(yè)等領(lǐng)域有廣闊應(yīng)用。目前,植物多糖的提取方法眾多[10],因此,不同提取方法對植物多糖的提取率和生物活性等影響引起了眾多研究學者的關(guān)注。例如,He等[11]比較了水熱提取法、冷壓萃取法、凍融冷壓萃取法、超聲-水熱提取法、微波-水熱提取法和酶解-水熱提取法對鐵皮石斛莖中多糖理化性能的影響。Shang等[12]考察了水熱提取法、超聲提取法、酶提取法和酶解-超聲提取法對紫云英多糖的理化性能和生物活性的影響。華思敏等[13]采用水、纖維素酶及堿液提取黑木耳多糖,比較了不同工藝提取得到的黑木耳多糖的抗氧化性與糖苷酶抑制作用。Hu等[14]比較了水熱提取法和超聲提取法得到的烏拉草多糖的結(jié)構(gòu)和體外抗氧化活性。近年來,酶提法作為一種高效、綠色的提取方法越來越受到關(guān)注[15]。它是以酶為催化劑通過破壞植物細胞壁從而釋放細胞內(nèi)的有效成分,并且利用酶的特異性和選擇性可以在溫和條件下反應(yīng)進而有效保持生物活性物質(zhì)的生物潛力。然而,鮮見不同酶提取對植物多糖的生物活性等的影響研究。

基于此,本文以甘草渣為研究對象,采用纖維素酶和果膠酶在實驗優(yōu)化條件下分別提取甘草渣多糖,研究不同酶提取對甘草渣多糖的抗氧化性和抗腫瘤性能的影響,以期為后續(xù)甘草資源的有效再利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘草渣 隨州神農(nóng)百草藥業(yè)有限公司;葡萄糖標準品、果膠酶(30000 U/g)、纖維素酶(10000 U/g)、水楊酸(分析純)、2,2-二(4-叔辛基苯基)-1-苦肼基自由基(DPPH)、2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS,98%) 阿拉丁試劑公司;無水乙醇、苯酚、檸檬酸、檸檬酸鈉、二水合磷酸二氫鉀、十二水合磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵(FeSO4)、30%雙氧水(H2O2)、二甲亞砜(DMSO) 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;濃硫酸 分析純,成都市科龍化工試劑廠;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS) Hyclone;PBS緩沖液 Life;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT) Sigma;肝癌細胞HepG2 武漢普健生物有限公司。

DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司;WGL-125B型電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;JJ124BC型電子天平 常熟市雙杰測試儀器廠;SC-04型低速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司;MX-S型試管振蕩器 北京大龍公司;UV-2600型紫外分光光度儀 島津企企業(yè)管理有限公司;TENSOR II型傅里葉變換紅外光譜儀 德國BRUKER公司;Envision型全功能微孔板檢測儀 PerkinElmer公司;HF90 CO2培養(yǎng)箱、HF-1200LC型生物安全柜 Heal force。

1.2 實驗方法

1.2.1 甘草渣中粗多糖的提取

1.2.1.1 纖維素酶提取甘草渣中粗多糖 精密稱取干燥至恒重的甘草渣粉末2.0 g,按料液比1∶20加入pH5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,加入2%的纖維素酶,在55 ℃下水浴加熱酶解2 h。再于100 ℃水浴中加熱20 min滅酶活性,冷卻后,轉(zhuǎn)移至離心管中4000 r/min離心20 min,取上清液,水浴濃縮至體積1/5,然后加4倍量的無水乙醇,4 ℃靜置過夜,得到粗多糖[16-17]。

1.2.1.2 果膠酶提取甘草渣中粗多糖 精密稱取干燥至恒重的甘草渣粉末2.0 g,按料液比1∶20加入pH5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,加入2%的果膠酶,在50 ℃下水浴加熱酶解2 h。再采用與1.2.1.1相同的步驟進行滅酶、醇沉等處理。

1.2.2 甘草渣多糖的純化 采用Savege法[18]除蛋白。按照粗多糖溶液:Sevage試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1)=5∶1 (v∶v)的比例,混合后于振蕩器強烈振蕩20 min,產(chǎn)生乳白色沉淀,4000 r/min離心15 min,收集上清液,如此重復(fù)至少三次,直到?jīng)]有明顯的蛋白層出現(xiàn)。

1.2.3 甘草渣多糖的紫外吸收光譜 采用紫外分光光度計測定甘草渣多糖在200～400 nm范圍內(nèi)的紫外可見吸收光譜[19]。

1.2.4 甘草渣多糖含量的測定 以葡萄糖為標準物,采用硫酸-苯酚法[20]繪制葡萄糖標準曲線。精密移取一系列濃度梯度的葡萄糖標準溶液0.2 mL,加入0.2 mL 5%的苯酚溶液搖勻,再加入1.0 mL濃硫酸充分振蕩2 min后,置于95 ℃的沸水浴中加熱15 min中后冷卻,以等量蒸餾水替代葡萄糖標準品溶液作為空白,采用紫外-可見分光光度法測定最大吸收波長處的吸光度,以吸光度為縱坐標,葡萄糖濃度為橫坐標,得到標準曲線。根據(jù)回歸方程按下式測定甘草渣多糖的總含量。

其中,c為回歸方程中得到的甘草渣多糖的質(zhì)量濃度(mg/mL);V為定容體積(mL);N為稀釋倍數(shù);m為甘草藥渣質(zhì)量(g)。

1.2.5 甘草渣多糖的紅外表征 將甘草渣多糖溶液滴涂在CsI窗片上,待溶劑揮干后采用傅里葉變換紅外光譜儀測定4000～400 cm-1的光譜[21]。

1.2.6 甘草渣多糖抗氧化性能研究

1.2.6.1 DPPH自由基清除活性 DPPH自由基清除活性的測定參考李珊珊等[22]的方法稍作修改。取0.225 mg/mL的DPPH乙醇溶液0.5 mL,加入1.5 mL 0.000393、0.000783、0.00118、0.00157和0.00236 mg/mL的果膠酶提取甘草渣多糖溶液或1.5 mL 0.00298、0.00895、0.01491、0.04971、0.07457 mg/mL的纖維素酶提取甘草渣多糖溶液立即混勻后,在室溫下避光30 min,測定517 nm處的吸光度A1;以等量乙醇替代DPPH溶液測定吸光度A2,以等量乙醇溶液替代多糖溶液測定吸光度A0。以等體積的0.000393、0.000783、0.00118、0.00157和0.00236 mg/mL維生素C反應(yīng)液作為陽性對照,每次實驗重復(fù)三次。DPPH自由基的清除率按下式計算:

1.2.6.2 羥基自由基清除活性 羥基自由基清除活性的測定參考Yin等[23]的方法稍作修改。0.45 mL 0.00380、0.0110、0.0200、0.0230和0.0300 mg/mL的甘草渣多糖溶液與0.6 mL 9 mmol/L的水楊酸乙醇溶液、0.6 mL 9 mmol/L的FeSO4水溶液和0.6 mL 9.8 mmol/L的H2O2混合后,在37 ℃下水浴30 min后,測定溶液在510 nm處的吸光度A1;以蒸餾水替代H2O2測定吸光度A2,以蒸餾水替代多糖溶液測定吸光度A0。以等體積的0.00380、0.0230、0.0300、0.0360和0.0450 g/mL維生素C反應(yīng)液作為陽性對照,每次實驗重復(fù)三次。羥基自由基的清除率按下式計算:

1.2.6.3 ABTS自由基清除活性 ABTS自由基清除活性的測定參考Hu等[14]的方法稍作修改。取5 mL 2.45 mmol/L的K2S2O8水溶液與5 mL 7 mmol/L的ABTS水溶液混合,在室溫下于暗處避光放置12 h后,取1.2 mL用pH7.4的PBS緩沖溶液稀釋至10 mL得到ABTS+溶液。取等體積的ABTS+溶液與0.00550、0.0110、0.0170、0.0220、0.0280、0.0340和0.0400 mg/mL的甘草渣多糖溶液混合,測定其在734 nm處的吸光度A1;以蒸餾水代替ABTS+溶液測定吸光度A2,以蒸餾水替代多糖溶液測定吸光度A0。以等體積的0.000840、0.00167、0.00335、0.00502、0.00669和0.00837 mg/mL維生素C反應(yīng)液作為陽性對照,每次實驗重復(fù)三次。ABTS自由基的清除率按下式計算:

1.2.7 甘草渣多糖的抗腫瘤研究 采用MTT法[24]測定甘草渣多糖的抗腫瘤性能。在96孔板上按照7000個/孔接種HepG2細胞,采用10% DMEM+10% FBS作為培養(yǎng)基在37 ℃下培養(yǎng)。待細胞貼壁后,每孔加入200 μL上述培養(yǎng)基或0.125、0.0833、0.0227、0.0119、0.00250 mg/mL多糖溶液。37 ℃培養(yǎng)24 h后,向每孔中加入20 μL PBS緩沖液配制的5 mg/mL的MTT 溶液。繼續(xù)孵育4 h后,停止培養(yǎng),小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基上清液。對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基上清液。再向每孔中加入150 μL DMSO,振蕩10 min溶解結(jié)晶。采用酶標儀在490 nm處測定OD值。根據(jù)下式計算細胞的抑制率:

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Origin 8.6進行繪圖,SPSS 24.0進行統(tǒng)計分析,選取可信度為95%,計算IC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘草渣多糖的紫外可見吸收光譜

兩種酶提取得到的甘草渣多糖的紫外吸收光譜如圖1所示,均在260和280 nm沒有明顯的吸收峰,由此可知甘草渣多糖中不含蛋白質(zhì)和核酸[25]。

圖1 甘草渣多糖的紫外吸收光譜Fig.1 UV spectra of licorice residue polysaccharide

2.2 甘草渣多糖的含量測定

采用硫酸-苯酚法測定了兩種酶提取得到的甘草渣多糖的含量。以蒸餾水代替葡萄糖標準溶液為空白,測定葡萄糖標準溶液在200～800 nm內(nèi)的紫外吸收光譜,得到最大吸收波長為490 nm。測定一系列濃度梯度的葡萄糖標準溶液在490 nm處的吸光度,繪制標準曲線如圖2所示,得知葡萄糖標準溶液在0.005～0.030 mg/mL范圍內(nèi),具有良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為A=31.427c+0.0276,R2=0.9998,式中,A為吸光度,c為葡萄糖標準溶液濃度。

圖2 葡萄糖標準溶液的標準曲線Fig.2 Standard curve for glucose standard solution

根據(jù)葡萄糖標準曲線方程,可得纖維素酶提取甘草渣多糖的得率為10.71%,果膠酶提取甘草渣多糖的得率為8.43%,表明纖維素酶提取得到的多糖得率更高。這可能是由于纖維素酶對甘草細胞壁及細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的降解和破壞作用更強,進而有利于釋放細胞內(nèi)的多糖[26]。

2.3 甘草渣多糖的紅外表征

兩種酶提取得到的甘草渣多糖的紅外光譜如圖3所示,兩者較為相似,均表現(xiàn)出明顯的多糖特性吸收峰。在3390 cm-1附近有-OH的伸縮振動峰,C-H在2935 cm-1附近的彎曲伸縮振動峰歸因于-CH2。1720 cm-1附近的吸收峰對應(yīng)C=O的吸收峰位,1600 cm-1附近的吸收峰說明C=O未酯化,這表明多糖中含有糖醛酸[27]。1406和1235 cm-1附近的吸收峰對應(yīng)的C-O-H彎曲振動和C-O伸縮振動。此外,840 cm-1附近的吸收峰為α-糖苷鍵的特征吸收峰,610 cm-1附近的吸收峰對應(yīng)吡喃糖骨架的伸縮振動吸收峰[28],這表明甘草渣多糖的糖環(huán)為α-吡喃環(huán)。

圖3 甘草渣多糖的紅外光譜Fig.3 IR spectra of licorice residue polysaccharide

2.4 甘草渣多糖的抗氧化性能研究

2.4.1 DPPH自由基的清除活性 由圖4可知,果膠酶提取多糖和纖維素酶提取多糖分別在0.000393～0.00236和0.00298～0.07457 mg/mL濃度范圍內(nèi)對DPPH自由基的清除活性呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。隨著多糖濃度的增加,兩種多糖對DPPH自由基的清除率隨之增加。經(jīng)擬合,果膠酶提取的多糖和纖維素酶提取的多糖對DPPH自由基的IC50值分別為0.00243和0.226 mg/mL,維生素C的IC50值為0.00220 mg/mL。說明在相同濃度的情況下,果膠酶提取的多糖對DPPH自由基的清除能力略低于維生素C,但明顯地高于纖維素酶提取的多糖。

圖4 甘草渣多糖的DPPH自由基清除能力Fig.4 Scavenging ability of licorice residuepolysaccharide on DPPH radicals

2.4.2 羥基自由基的清除活性 圖5給出了以維生素C為對照,兩種酶提取的甘草渣多糖對羥基自由基的清除活性。從圖5中可以看出,在0.0038～0.0300 mg/mL濃度范圍內(nèi),甘草渣多糖對羥基自由基的清除活性呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。并且,隨著多糖濃度的增加,纖維素酶提取的甘草渣多糖對羥基自由基的清除率遠高于果膠酶提取的多糖。當濃度為0.03 mg/mL時,纖維素酶提取的多糖和果膠酶提取的多糖對羥基自由基的清除率分別為59.12%和23.31%,維生素C對羥基自由基的清除率為11.23%,纖維素酶提取的多糖和果膠酶提取的多糖對羥基自由基的清除率分別是維生素C對羥基自由基的清除率的5倍和2倍。經(jīng)擬合,果膠酶提取的多糖和纖維素酶提取的多糖對羥基自由基的IC50值分別為0.305和0.0238 mg/mL,維生素C的IC50值為0.156 mg/mL。由此可見,纖維素酶提取的甘草渣多糖對羥基自由基有較強的清除能力。

圖5 甘草渣多糖的羥基自由基清除能力Fig.5 Scavenging ability of licorice residuepolysaccharide on hydroxyl radicals

2.4.3 ABTS自由基的清除活性 圖6是以維生素C為對照,兩種酶提取的甘草渣多糖對ABTS自由基的清除活性。從圖6中可以看出,在0.0055～0.0400 mg/mL的濃度范圍內(nèi),果膠酶提取的甘草渣多糖的總抗氧化能力明顯強于纖維素酶提取的多糖;但隨著濃度的增加,這種差異性減弱。經(jīng)擬合,果膠酶提取的多糖和纖維素酶提取的多糖對ABTS自由基的IC50值分別為0.0403和0.0401 mg/mL,維生素C的IC50值為0.00310 mg/mL。表明果膠酶和纖維素酶提取的多糖的總抗氧化能力幾乎相當,均明顯低于維生素C。目前,已有文獻報道多糖的化學成分、結(jié)構(gòu)、分子質(zhì)量和構(gòu)象對多糖的生物活性和其它藥用性能具有一定的影響[29]。因此,不同酶提取的甘草渣多糖對各種自由基的清除率不同,這很可能是與其組成中不同單糖的比例及其側(cè)鏈連接有關(guān)[30]。

圖6 甘草渣多糖的ABTS自由基清除能力Fig.6 Scavenging ability of licorice residuepolysaccharide on ABTS radicals

2.5 甘草渣多糖的抗腫瘤性能研究

選取肝癌細胞HepG2細胞作為研究對象,纖維素酶和果膠酶提取的甘草渣多糖的抗腫瘤性能如圖7所示。從圖7中可以看出,甘草渣多糖具有明顯的抗腫瘤性能。此外,在相同的濃度下,纖維素酶提取的多糖比果膠酶提取的多糖抗腫瘤性能更優(yōu),且隨著多糖的濃度降低更顯著。例如,當濃度為0.125 mg/mL時,纖維素酶提取的多糖腫瘤抑制率為35.18%,此時果膠酶提取的多糖腫瘤抑制率為31.23%;當濃度為0.0025 mg/mL時,纖維素酶提取的多糖腫瘤抑制率為13.84%,為果膠酶提取的多糖腫瘤抑制率的3倍。

圖7 甘草渣多糖的抗腫瘤特性Fig.7 Antitumor property of licorice residue polysaccharide

3 結(jié)論

果膠酶和纖維素酶提取的甘草渣多糖得率分別為8.43%和10.71%,表明纖維素提取多糖的得率更高。紅外光譜結(jié)果表明兩種酶提取的多糖的紅外光譜沒有明顯差別,均具有α-吡喃環(huán)糖環(huán)?？寡趸詫嶒灲Y(jié)果表明果膠酶和纖維素酶提取的多糖對DPPH自由基、羥基自由基和ABTS自由基的IC50分別為0.00243、0.305、0.0403 mg/mL和0.226、0.0238、0.0401 mg/mL,說明果膠酶提取的多糖對DPPH自由基有較好的清除能力,而纖維素酶提取的多糖對羥基自由基有更好的清除能力,兩者對ABTS自由基的清除能力幾乎相同?？鼓[瘤結(jié)果表明在相同的濃度下,纖維素酶提取的多糖對HepG2腫瘤細胞的抑制率更高,說明纖維素酶提取的多糖抗腫瘤性能更優(yōu)。本研究結(jié)果為甘草渣的提取再利用提供了指導(dǎo)意義,也為后期甘草資源的進一步有效利用奠定了基礎(chǔ)。