李 婷，劉金燕，劉朝俊，李潔瑤，陳壬寅，王麗萍，張 毅

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細(xì)胞治療中心 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心 鄭州 450052 3)河南省腫瘤免疫和生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052 4)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科 鄭州 450052

肺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在世界范圍惡性腫瘤中均居首位[1]。肺癌傳統(tǒng)治療方法包括手術(shù)、放療和化療，盡管近年來(lái)肺癌的治療效果不斷提高，但5 a生存率仍不足15%[2]。腫瘤免疫治療的發(fā)展為腫瘤的治療提供了新的方法，其中程序性細(xì)胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1, PD-1)/程序死亡性配體1(programmed cell death ligand-1, PD-L1)單抗在臨床腫瘤治療中顯示出良好的療效[3]。有研究[4]結(jié)果顯示，PD-1主要表達(dá)于活化或耗竭的T細(xì)胞表面，屬于B7-CD28家族成員。PD-1有PD- L1和PD-L2兩種配體。腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞高表達(dá)PD-L1，可與PD-1結(jié)合來(lái)抑制T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的分泌，從而發(fā)生免疫逃逸[5]。有研究[6]發(fā)現(xiàn)PD-1不僅表達(dá)于T細(xì)胞，也在其他各種免疫細(xì)胞表面表達(dá)，并發(fā)揮免疫調(diào)解作用。近年來(lái)有研究[7-9]發(fā)現(xiàn)PD-1也表達(dá)在某些腫瘤細(xì)胞表面，例如黑色素瘤起始細(xì)胞通過(guò)表達(dá)PD-1，活化mTOR信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。也有文獻(xiàn)[10-11]報(bào)道，BRAF和MEK抑制劑聯(lián)合治療促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞PD-1的表達(dá)，增強(qiáng)PD-1單抗的抗腫瘤作用，為BRAF和MEK抑制劑聯(lián)合PD-1單抗治療提供了理論基礎(chǔ)。在肝癌的研究[12-13]中，肝癌患者的癌細(xì)胞及肝癌細(xì)胞系中均表達(dá)PD-1，且PD-1的表達(dá)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。有文獻(xiàn)[14]報(bào)道，PD-1在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)。然而，目前尚無(wú)大樣本研究NSCLC患者腫瘤細(xì)胞PD-1的表達(dá)及其與患者的臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。因此，本研究采用免疫組化方法檢測(cè)138例NSCLC患者腫瘤細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)水平，揭示PD-1在肺癌患者中的表達(dá)模式，并探究其與NSCLC患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象選取2013年1月至2018年4月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的且病理診斷證實(shí)為NSCLC的患者，共138例?；颊呤中g(shù)前均未接受放、化療及其他抗腫瘤藥物治療。收集入選患者的臨床資料，包括：年齡、性別、病理類(lèi)型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和TNM分期(肺癌TNM分期均依據(jù)第8版國(guó)際肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn))。其中男88例，女50例；患者年齡33～83(60.1±10.9)歲；病理分型：腺癌83例，鱗癌55例；TNM分期：Ⅰ期30例，Ⅱ期20例，Ⅲ期36例，Ⅳ期52例。

1.2治療方案對(duì)于早期(Ⅰ、Ⅱ期)NSCLC患者，行根治性手術(shù)治療；Ⅰb到Ⅱ期高危人群加以輔助化療。對(duì)于晚期NSCLC患者，行放、化療或化療藥聯(lián)合治療。常用化療藥有：順鉑、紫杉醇、吉西他濱等。部分患者使用靶向藥物，如EGFR突變患者行EGFR酪氨酸激酶抑制劑治療；ALK重排陽(yáng)性患者行ALK抑制劑治療。

1.3免疫組化法檢測(cè)肺癌組織中的PD-1表達(dá)將入選患者的石蠟組織標(biāo)本切片、依次脫蠟、脫水后，進(jìn)行抗原修復(fù)；采用體積分?jǐn)?shù)3%過(guò)氧化氫室溫孵育10 min以滅活過(guò)氧化氫酶，PBS洗3次，5 min/次，向切片滴加封閉液，濕盒中室溫孵育1 h；滴加PD-1兔源單克隆抗體(購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，使用時(shí)按1∶200稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜。次日取出濕盒室溫放置1 h，PBS洗4次，5 min/次；滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗(按1∶200稀釋)，濕盒室溫孵育15 min，然后用PBS洗3次，5 min/次；滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，記錄顯色時(shí)間，保證后續(xù)樣品顯色時(shí)間一致。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，水化，滴加中性樹(shù)膠封片。顯微鏡觀(guān)察，拍照記錄。

由我院兩位高年資病理醫(yī)師分別判讀免疫組化結(jié)果：在400倍鏡下觀(guān)察，每個(gè)標(biāo)本選取5個(gè)視野，每個(gè)視野約100個(gè)癌細(xì)胞。以細(xì)胞膜出現(xiàn)棕色顆粒作為陽(yáng)性細(xì)胞，0為不表達(dá)，1為弱染色，2為中等強(qiáng)度染色，3為強(qiáng)染色；同時(shí)，以PD-1陽(yáng)性細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分比計(jì)算分值，<10%、10%～、25%～、50%～、>75%分別計(jì)為0、1、2、3、4分。兩項(xiàng)指標(biāo)乘積結(jié)果：0為陰性，1～4為“低表達(dá)”，5～8為“中表達(dá)”，9～12為“高表達(dá)”。

1.4隨訪(fǎng)采用門(mén)診隨訪(fǎng)和電話(huà)隨訪(fǎng)相結(jié)合的方式，獲取患者生存資料。隨訪(fǎng)開(kāi)始時(shí)間為確診時(shí)間，終點(diǎn)為患者死亡或隨訪(fǎng)截止時(shí)間，隨訪(fǎng)截止時(shí)間為2019年9月30日；失訪(fǎng)患者9例。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用Fisher精確概率法分析腫瘤患者PD-1表達(dá)情況與臨床病理參數(shù)的關(guān)系；采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，并行Log-rank檢驗(yàn)；利用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行預(yù)后影響因素的多因素分析；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1PD-1在NSCLC腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)見(jiàn)圖1。免疫組化結(jié)果顯示，PD-1蛋白主要定位在腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜，呈淺黃色至棕黃色顆粒。

A：PD-1陰性組；B：PD-1低表達(dá)組；C：PD-1中表達(dá)組；D： PD-1高表達(dá)組

2.2肺癌組織PD-1的表達(dá)和臨床病理參數(shù)的關(guān)系見(jiàn)表1。由表1可知，肺癌組織PD-1的表達(dá)與患者年齡、性別、病理類(lèi)型及腫瘤大小無(wú)關(guān)(P>0.05)，與TNM分期(P=0.024)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P=0.004)。

表1 肺癌組織PD-1表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 例

2.3NSCLC組織PD-1表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系結(jié)果見(jiàn)圖2，PD-1陰性組與PD-1低表達(dá)組、中表達(dá)組、高表達(dá)組患者生存曲線(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=19.503,P<0.001)。PD-1陰性組中位生存期(28.7個(gè)月)長(zhǎng)于PD-1低表達(dá)組(15.1個(gè)月)、中表達(dá)組(10.9個(gè)月)、高表達(dá)組(14.5個(gè)月)。Cox回歸結(jié)果顯示，PD-1表達(dá)是NSCLC患者不良預(yù)后的預(yù)測(cè)因素，其他因素與NSCLC預(yù)后無(wú)關(guān)(表2)。

圖2 不同PD-1表達(dá)水平NSCLC患者的生存曲線(xiàn)比較

因素HR95%CIP性別(參照:男)0.9190.553～1.5280.745年齡(參照:≤60歲組)1.2530.747～2.1020.392TNM分期(參照:Ⅰ-Ⅱ期)1.3610.691～2.6800.372腫瘤大小(參照:≤35.7 mm)1.6540.984～2.7800.058淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(參照:否)1.4220.801～2.5270.229PD-1表達(dá)(參照:陰性) 低表達(dá)2.3301.293～4.2010.005 中表達(dá)4.3121.905～9.760<0.001 高表達(dá)1.8960.695～5.1690.211

3 討論

研究[4]表明，PD-1可作為一個(gè)免疫檢查點(diǎn)，通過(guò)抑制酪氨酸磷酸酶SHP-2在T細(xì)胞抗原受體(T cell receptor，TCR)下游信號(hào)通路的去磷酸化反應(yīng)，從而抑制T 細(xì)胞免疫功能。當(dāng)T 細(xì)胞在慢性感染和腫瘤微環(huán)境中被抗原反復(fù)刺激時(shí)，PD-1表達(dá)水平升高，誘導(dǎo)T細(xì)胞發(fā)生表觀(guān)遺傳修飾，轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)也發(fā)生改變，從而導(dǎo)致T細(xì)胞分化進(jìn)入耗竭狀態(tài)[15]。體外培養(yǎng)條件下，PD-1在不同亞群T細(xì)胞表達(dá)水平也有所不同，并且PD-1的表達(dá)影響T細(xì)胞的分化[16]。近年來(lái)，有研究[7-9,14]發(fā)現(xiàn)PD-1在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)，并對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生一定的影響。早期關(guān)于PD-1的研究主要集中在T細(xì)胞功能上，這也是腫瘤免疫逃逸的主要機(jī)制之一。在此研究中，我們收集了138例NSCLC患者腫瘤組織標(biāo)本，檢測(cè)了PD-1的表達(dá)，驗(yàn)證了PD-1不僅表達(dá)于T細(xì)胞，還表達(dá)于NSCLC腫瘤細(xì)胞表面。之前有文獻(xiàn)[7]報(bào)道，PD-1被發(fā)現(xiàn)表達(dá)于黑色素瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)不僅發(fā)生在腫瘤發(fā)展的過(guò)程中，還發(fā)生在腫瘤藥物治療的情況下。有文獻(xiàn)[10]報(bào)道，BRAF和MEK抑制劑聯(lián)合治療可促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞PD-1的表達(dá)，這提示腫瘤細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)受藥物治療的影響。有研究[8]顯示，腫瘤細(xì)胞PD-1的表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展；我們的研究發(fā)現(xiàn)，PD-1的表達(dá)雖然與患者年齡、性別、病理分型無(wú)關(guān)，但卻與NSCLC患者TNM分期及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移有關(guān)，這與之前的報(bào)道結(jié)果相吻合，說(shuō)明PD-1的表達(dá)可能促進(jìn)了NSCLC的侵襲和轉(zhuǎn)移。雖然有個(gè)案[14]報(bào)道NSCLC患者腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)PD-1，但他們的樣本過(guò)少，研究范圍小，且尚未報(bào)道其表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。在本研究中，我們以138例NSCLC標(biāo)本為研究對(duì)象，不僅揭示了PD-1在NSCLC的表達(dá)模式，而且分析了其表達(dá)與NSCLC患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，揭示了NSCLC患者腫瘤細(xì)胞PD-1表達(dá)的臨床意義，這對(duì)后續(xù)研究PD-1在NSCLC中的表達(dá)具有重要指導(dǎo)意義。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)，PD-1在NSCLC腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)與TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，是NSCLC患者不良預(yù)后的預(yù)測(cè)因素；PD-1在NSCLC腫瘤細(xì)胞的表達(dá)是否通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為從而促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。