畢永華，伊夢飛，尉澤鵬，徐 克，鐘紅珊，韓新巍

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院放射介入科 鄭州 450052 2)中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院放射科 沈陽 110001

腹主動脈瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)的病因尚不完全清楚，其特征性表現(xiàn)為動脈壁慢性炎癥浸潤，彈性纖維碎裂、降解以及中膜變薄[1]。彈性蛋白酶誘導(dǎo)的AAA模型已廣泛用于AAA的病因研究[2-6]。其中，彈性蛋白酶灌注模型常見于嚙齒類AAA模型的建立[7-8]。但該建模方法比較復(fù)雜，需要阻斷腹主動脈血流并穿刺髂動脈，沒有動脈外周浸潤法簡單易行。有學者[9-10]用彈性蛋白酶溶液浸潤主動脈外壁成功誘導(dǎo)AAA形成,但浸潤時間需要120 min，建模時間過長，容易導(dǎo)致動物死亡。此外，以上建模方法均采用進口的彈性蛋白酶，采用國產(chǎn)彈性蛋白酶建模鮮有報道。本研究旨在探討國產(chǎn)彈性蛋白酶溶液浸潤動脈外壁建立兔AAA模型的可行性。

1 材料與方法

1.1實驗動物及試劑20只雄性新西蘭大白兔，體重(2.4±0.4) kg，由中國醫(yī)科大學動物實驗中心提供，隨機分成A、B、C、D組, 每組5只。國產(chǎn)豬胰彈性蛋白酶(型號M0139)購自上?？笊锛夹g(shù)有限公司, 以生理鹽水配制成0.0、0.1、1.0和10.0 U/μL備用。超敏SP(鼠)免疫組織化學試劑盒(型號KIT-9701)購自福州邁新生物技術(shù)有限公司，MMP-2、MMP-9小鼠單克隆抗體購自Abcam公司，小鼠抗兔巨噬細胞單克隆抗體RAM11購自丹麥Dako公司。本研究已獲得中國醫(yī)科大學動物實驗倫理委員會批準。

1.2AAA模型的建立兔稱重后，以速眠新Ⅱ(0.3 mL/kg)及戊巴比妥溶液肌內(nèi)注射麻醉。將兔仰臥位固定，腹部備皮，絡(luò)合碘消毒，鋪巾。沿中線切開長約4 cm切口，充分暴露腹主動脈下段近主動脈分叉處。鈍性分離動脈周圍組織，于分叉近端游離出1～2 cm的腹主動脈段。將尖端套有靜脈輸液針塑料管的小彎鑷置于動脈下方使其懸空，貼上3 mm×4 mm的滅菌面巾紙。A～D組分別以微量移液器抽取0.0、0.1、1.0和10.0 U/μL彈性蛋白酶溶液各10 μL緩慢滴注于紙片上，避免溶液滲漏。浸潤30 min后用生理鹽水沖洗腹主動脈段，去除彈性蛋白酶殘留。連續(xù)縫合腹壁，將兔送回籠子，蘇醒之前注意保溫。術(shù)后第5天，采用靜脈推注過量戊巴比妥鈉注射液的方法處死動物。處死后立即絡(luò)合碘消毒、鋪巾，沿中線開腹，充分暴露并分離腹主動脈下段，切取浸潤的腹主動脈段，立即用40 g/L多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，5 μm厚切片。

1.3動脈內(nèi)徑的測量術(shù)前及術(shù)后即刻、第3天和第5天采用經(jīng)靜脈造影方法測量腹主動脈內(nèi)徑變化，必要時行CTA。兔耳緣靜脈留置24G靜脈輸液針，將5 mL造影劑于3 s內(nèi)推注入耳緣靜脈內(nèi)。腹主動脈內(nèi)徑較術(shù)前增大50%以上判定為AAA形成。

1.4病變動脈段組織學表現(xiàn)及MMP-2、MMP-9和RAM11蛋白的檢測取組織切片分別進行HE染色和EVG染色，觀察大致形態(tài)及彈力纖維改變情況。EVG購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。切片脫蠟至水，蘇木精室溫處理0.5 h，水洗后用20 g/L三氧化鐵溶液分化，Van Gieson′s液復(fù)染5 min。采用免疫組化SP法檢測MMP-2、MMP-9和RAM11的表達。MMP-2小鼠單克隆抗體(1∶150稀釋)、MMP9小鼠單克隆抗體(1∶300稀釋)購自美國Abcam公司，RAM11小鼠抗兔巨噬細胞單克隆抗體(1∶100稀釋)購自丹麥Dako公司。MMP-2、MMP-9一抗加入后4 ℃過夜，加生物素化山羊抗小鼠IgG室溫孵育20 min，DAB顯色，中性樹脂封片。采用Image-Pro Plus 6.0進行半定量分析。于200倍鏡下選擇2個非重復(fù)視野進行觀察和陽性細胞計數(shù)。胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞，計算陽性細胞百分率(取2個視野的均數(shù))，陽性細胞百分率<10%計1分(弱陽性表達)，10%～50%計2分(中度陽性表達)，>50%計3分(強陽性表達)。

1.5統(tǒng)計學處理用GraphPad Prism 5.0進行數(shù)據(jù)分析。4組不同時間點浸潤處腹主動脈內(nèi)徑的比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，4組MMP-2、MMP-9和RAM11表達的比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.14組動脈內(nèi)徑的變化術(shù)中及術(shù)后均未見動物死亡。A、B組均未見AAA形成，C組僅1只兔形成AAA，D組最終5只均形成AAA。4組浸潤處腹主動脈內(nèi)徑變化見表1。

2.24組浸潤處腹主動脈組織學表現(xiàn)A組動脈壁規(guī)整，平滑肌細胞形態(tài)及分布正常，內(nèi)外彈力板及中膜彈力纖維排列規(guī)整、連續(xù)。B組和C組動脈壁厚度及平滑肌細胞數(shù)量基本穩(wěn)定，但外彈力板和中膜彈力纖維有所破壞。D組動脈壁結(jié)構(gòu)紊亂，動脈壁明顯變薄，伴大量紅細胞滲出；中膜彈力纖維受到破壞、消失，僅殘留少許內(nèi)彈力板；平滑肌細胞數(shù)量丟失嚴重(圖1)。

表1 4組浸潤處腹主動脈內(nèi)徑變化(n=5) mm

F時間=85.410，F(xiàn)組間=17.930,F交互=19.510,P均<0.001；*：與A組相比，P<0.05

圖1 腹主動脈組織病理學變化

2.34組浸潤處腹主動脈MMP-2、MMP-9和RAM11表達的比較見圖2、表2。術(shù)后第5天B組和C組在動脈外膜和中膜內(nèi)可見MMP-9和RAM11弱陽性表達。D組動脈瘤壁全層均可見MMP-9強陽性表達，炎癥細胞浸潤以巨噬細胞(RAM11陽性表達細胞)為主。術(shù)后第5天D組MMP-2、MMP-9和RAM11表達評分均強于其他3組。

A：陰性表達；B～D：D組MMP-2、MMP-9和RAM11的表達

表2 4組浸潤處腹主動脈MMP-2、MMP-9和RAM11表達評分

*：與其他3組相比，P<0.05

3 討論

彈性蛋白酶灌注是最為常見的AAA動物模型制備方法，該方法需經(jīng)髂總動脈插管并阻斷腹主動脈血流，經(jīng)導(dǎo)管向動脈腔內(nèi)灌注彈性蛋白酶溶液；操作較為復(fù)雜，手術(shù)難度大，動物死亡率高。因此，有必要尋找一種更簡易、創(chuàng)傷小的AAA動物模型制備方法。

本實驗中，我們應(yīng)用10 U/μL國產(chǎn)豬胰彈性蛋白酶溶液10 μL浸潤腹主動脈外壁30 min，成功誘導(dǎo)兔AAA形成，建模成功率高達100%，未見動物因AAA破裂而死亡。造模過程中，浸潤處動脈表面包裹一層吸水紙，可使彈性蛋白酶均勻地作用于動脈壁，并可避免溶液滲漏。該建模方法簡單易行，創(chuàng)傷小，且浸潤段腹主動脈具有AAA特征性表現(xiàn)，如平滑肌細胞數(shù)量減少，動脈壁內(nèi)發(fā)生以巨噬細胞為主的炎癥細胞浸潤，MMP-2和MMP-9表達增高，彈力纖維破壞、降解，血管中膜變薄。本研究采用國產(chǎn)彈性蛋白酶10 μL固定用量，當用量不同時，最佳濃度可能會不同。另外本研究只觀察了術(shù)后5 d的病理變化，不能較好地觀察AAA長期變化。

日本學者Origuchi等[11]報道彈性蛋白酶浸泡法誘導(dǎo)的AAA存在自我修復(fù)現(xiàn)象，建模術(shù)后6周AAA逐漸縮小，術(shù)后3個月幾乎恢復(fù)到正常水平。我們推測，僅依靠術(shù)中彈性蛋白酶破壞血管壁，術(shù)后損傷因素無法持續(xù)存在，可能是此類快速誘導(dǎo)的AAA無法進一步增大的原因。多數(shù)學者認為外源性彈性蛋白酶作用于血管壁后，會引起以MMP-2和MMP-9為主的內(nèi)源性MMPs表達增高，導(dǎo)致彈力纖維破壞降解，從而形成AAA。本研究發(fā)現(xiàn)低濃度彈性蛋白酶浸潤后MMP-9表達也增高，但并不能成功誘導(dǎo)AAA發(fā)生，推測MMP-9表達增高可能與手術(shù)創(chuàng)傷以及彈性蛋白酶破壞引起的局部炎癥反應(yīng)有關(guān)，未必是誘導(dǎo)AAA形成的原因[12]。MMP-2主要由血管平滑肌細胞表達，該指標的持續(xù)增高可能與AAA形成、轉(zhuǎn)歸關(guān)系更為密切。

國內(nèi)學者往往采用進口的豬胰彈性蛋白酶，其中Sigma公司的E1250彈性蛋白酶應(yīng)用最廣泛，但價格昂貴。本研究應(yīng)用10 U/μL國產(chǎn)彈性蛋白酶10 μL浸潤腹主動脈壁30 min可成功誘導(dǎo)AAA，該方法簡單易行，大大節(jié)省了建模時間和費用，有利于推廣。本研究為AAA相關(guān)研究提供了新的動物模型。