蔡青云，許麗君

1)駐馬店市中心醫(yī)院急診科 河南駐馬店 463000 2)河南省人民醫(yī)院急診科 鄭州 450003

既往研究[1]報(bào)道，大黃素在治療急性胰腺炎過程中具有重要作用，但是大黃素治療胰腺炎的作用機(jī)制仍是一個(gè)需要深入研究的問題。外泌體是多種細(xì)胞分泌的納米大小的細(xì)胞外囊泡，在體內(nèi)隨處可見。在過去幾年里外泌體從被認(rèn)為是細(xì)胞的垃圾桶，發(fā)展到被認(rèn)為是細(xì)胞間信使和健康、疾病過程中具有重要貢獻(xiàn)的參與者[2-3]。據(jù)報(bào)道[4]，外泌體在神經(jīng)退行性疾病、炎性疾病中均具有重要作用，但是其對(duì)急性胰腺炎的作用尚不十分清楚。本研究觀察了大黃素對(duì)急性胰腺炎胰腺腺泡細(xì)胞氧化應(yīng)激標(biāo)志物SOD、GSH、MDA表達(dá)的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本、細(xì)胞及主要試劑急性胰腺炎患者和正常對(duì)照血清標(biāo)本各35例，均由河南省人民醫(yī)院急診科于2018年10月至2019年11月收集。急性胰腺炎患者中，男21例，女14例，年齡25～70歲，中位年齡40歲；正常對(duì)照為同期體檢健康者，男20例，女15例，年齡22～75歲，中位年齡45歲。大鼠胰腺外分泌細(xì)胞AR42J購自美國菌種保藏中心；DMEM培養(yǎng)基購自美國Sellect公司；大黃素(批號(hào)20161028)購自北京索萊寶公司；雨蛙素購自美國Sigma公司；淀粉酶(AMY)ELISA檢測(cè)試劑盒購自英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司；TNF-α、GSH、SOD、MDA ELISA檢測(cè)試劑盒均購自美國Bio Science公司；磁珠購自上海秉宏科技有限公司；細(xì)胞液外泌體提取試劑盒購自杭州知維生物科技有限公司。

1.2血清中外泌體表面抗原CD69的檢測(cè)血清中外泌體的分離參照文獻(xiàn)[5]的方法。將100 μL磁珠用300 μL MEST洗滌2次，再用碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺活化(37 ℃30 min)；加入5 μL CD69抗體，37 ℃搖床孵育3 h，移去上清，PBST重懸，反應(yīng)30 min，PBST清洗3次；加入50 μL外泌體溶液，37 ℃搖床孵育1 h，除去上清，PBS洗滌3次。加入0.5 mL 30 μmol/L Dio染料，孵育30 min，棄上清，用無水乙醇清洗，PBS重懸，上流式細(xì)胞儀測(cè)量CD69的表達(dá)情況。

1.3AR42J細(xì)胞培養(yǎng)上清中AMY、TNF-α的檢測(cè)AR42J細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，記為對(duì)照組；用10-7mol/L雨蛙素處理AR42J細(xì)胞24 h誘導(dǎo)為胰腺炎模型細(xì)胞，記為模型組。分別用AMY、TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)2組細(xì)胞培養(yǎng)上清中AMY活性、TNF-α含量，具體操作步驟參考試劑盒說明書。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4不同濃度大黃素處理后AR42J模型細(xì)胞增殖抑制率的檢測(cè)采用大黃素(0、10、20、30 μmol/L)處理模型AR42J細(xì)胞48 h，分別記為0、10、20、30 μmol/L大黃素組，使用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖抑制率。將細(xì)胞制成混懸液，調(diào)整密度至104個(gè)/mL，然后取100 μL接種至96孔板，每孔加MTT溶液(5 g/L)20 μL，孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，然后每孔加入150 μL DMSO，振蕩使結(jié)晶充分融解，在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞吸光度(A)。細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)孔A值/對(duì)照孔A值)×100%。每組3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5大黃素處理后AR42J模型細(xì)胞培養(yǎng)上清中SOD、GSH、MDA活性及CD69的檢測(cè)用大黃素20 μmol/L處理模型細(xì)胞48 h，記為大黃素組；采用DMSO代替大黃素做陰性對(duì)照處理模型細(xì)胞，記為陰性對(duì)照組；另設(shè)模型組。采用GSH、SOD、MDA ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中GSH、SOD、MDA活性；CD69的檢測(cè)方法同1.2。每組3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正常對(duì)照組和急性胰腺炎組血清中CD69表達(dá)水平的比較、對(duì)照組和模型組AR42J細(xì)胞培養(yǎng)上清中AMY活性、TNF-α含量的比較均采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；不同組間細(xì)胞增殖抑制率，SOD、GSH、MDA活性及CD69表達(dá)水平的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1正常對(duì)照組和急性胰腺炎組血清中CD69表達(dá)水平的比較與正常對(duì)照組[(20.95±2.25)%]相比，急性胰腺炎組血清中CD69的表達(dá)水平[(83.98±6.29)%]升高(t=28.306，P<0.001)。

2.2對(duì)照組、模型組細(xì)胞培養(yǎng)上清中AMY活性、TNF-α含量的比較結(jié)果見表1。與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞培養(yǎng)上清中AMY活性、TNF-α含量均升高。

表1 對(duì)照組、模型組細(xì)胞培養(yǎng)上清中AMY活性、TNF-α含量的比較(n=3)

2.34組細(xì)胞增殖抑制率比較結(jié)果見表2。與0 μmol/L大黃素組相比，10、20、30 μmol/L大黃素組細(xì)胞增殖抑制率均升高，20、30 μmol/L大黃素組升高更顯著。故選用20 μmol/L大黃素用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 4組細(xì)胞增殖抑制率的比較(n=9)

F=516.374，P<0.001；*：與0 μmol/L大黃素組比較，P<0.05；#：與10 μmol/L大黃素組比較，P<0.05

2.43組細(xì)胞培養(yǎng)上清中SOD、GSH、MDA活性及CD69表達(dá)水平的比較結(jié)果見表3。與其他2組相比，大黃素組細(xì)胞培養(yǎng)上清中SOD、GSH活性均升高，MDA活性、CD69表達(dá)水平降低。

表3 3組細(xì)胞培養(yǎng)上清中SOD、GSH、MDA活性及CD69表達(dá)水平的比較(n=9)

*：與其他2組比較，P<0.05

3 討論

大黃最早是在《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載，其在中國的臨床應(yīng)用已有2 000多年。近代醫(yī)學(xué)認(rèn)為大黃具有下淤、通下的功能，常用來治療胰腺炎、膽囊炎等炎性疾病。重癥急性胰腺炎發(fā)病急，極易引起全身感染，病死率極高。據(jù)報(bào)道[5]，在重癥急性胰腺炎早期階段應(yīng)用大黃治療可明顯減輕患者的腹痛、惡心、嘔吐癥狀。大黃素是大黃的主要成分之一，可治療胰腺炎[6]。李慧艷等[7]報(bào)道，大黃素聯(lián)合黃芩苷可抑制急性胰腺炎大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)。本研究采用雨蛙素建立AR42J細(xì)胞損傷模型，大黃素(0、10、20、30 μmol/L)處理模型細(xì)胞，篩選最適濃度20 μmol/L；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，大黃素治療可使細(xì)胞中抗氧化應(yīng)激標(biāo)志物SOD、GSH活性上調(diào)，氧化應(yīng)激標(biāo)志物MDA活性下調(diào)，說明大黃素可減弱炎性損傷的胰腺腺泡細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，這與以往報(bào)道[7]結(jié)果一致。

近年，外泌體的研究成為熱點(diǎn)。外泌體可攜帶脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)，在病理生理?xiàng)l件下將內(nèi)含物在母體細(xì)胞和靶細(xì)胞之間傳遞，參與機(jī)體免疫應(yīng)答、炎癥、腫瘤生長(zhǎng)、神經(jīng)退行性疾病等病理生理過程[8-10]。李騰達(dá)等[4]報(bào)道，自身免疫性胰腺炎患者血清中外泌體表面抗原CD69表達(dá)水平升高，并刺激CD4+T細(xì)胞分泌IL-4、IFN-γ、TGF-β，參與胰腺炎的病程。還有報(bào)道[11]，重癥急性胰腺炎小鼠的脾臟T細(xì)胞中CD25和CD69表達(dá)水平升高，小鼠免疫應(yīng)答得到激活。本研究中發(fā)現(xiàn)，CD69水平在急性胰腺炎患者血清中異常升高；大黃素處理的急性胰腺炎胰腺腺泡細(xì)胞中CD69表達(dá)水平降低，提示大黃素對(duì)急性胰腺炎的治療作用可能與減少外泌體有關(guān)。

綜上所述，大黃素可抑制急性胰腺炎胰腺腺泡細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，下調(diào)外泌體水平，這為大黃素的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。