許雅娟，張 淼，張婧喆，孫宗宗，班彥杰，王 彪，侯曉峰，蔡琰鈞，李晶晶

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院產(chǎn)科 鄭州 450052

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)指妊娠期發(fā)生的糖代謝異常，可導(dǎo)致妊娠期羊水過多、巨大兒、胎兒生長受限、流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎兒窘迫、胎兒畸形等，對母嬰結(jié)局影響深遠(yuǎn)[1]。腸道菌群是腸道中存在的數(shù)量龐大的菌類，參與內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等的發(fā)育和成熟[2-4]。近年來，研究腸道菌群的相關(guān)技術(shù)日益成熟，其中最常用的是16S rRNA測序技術(shù)，qRT-PCR也因其快速、簡便的優(yōu)點(diǎn)備受青睞。研究[5]表明2型糖尿病患者均有中等程度的腸道菌群紊亂，且表現(xiàn)出產(chǎn)丁酸細(xì)菌種類的缺乏。 也有研究[6]指出腸道菌群一旦失衡，可引起肥胖和糖尿病等代謝性疾病。近年來，越來越多的報(bào)道[7]指出，GDM與腸道菌群關(guān)系密切。我們采用16S rRNA測序技術(shù)探求GDM患者孕晚期腸道菌群特征，并使用qRT-PCR技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證。

1 對象與方法

1.1研究對象選擇2018年1月至2019年3月于鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院圍保的GDM孕婦(n=33)和健康對照孕婦(n=30)。GDM診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]：服糖前及服糖后1、2 h血糖值應(yīng)分別低于5.1、10.0、8.5 mmol/L，任何一項(xiàng)血糖值達(dá)到或超過上述標(biāo)準(zhǔn)。對照組口服葡萄糖耐量試驗(yàn)值均正常且無產(chǎn)科疾病。兩組的所有孕婦均處于孕晚期并在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院經(jīng)剖宮產(chǎn)分娩。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡<18歲。②多胎妊娠及胎兒死亡。③人工受孕。④妊娠前糖尿病和多囊卵巢綜合征。⑤發(fā)生嚴(yán)重的壓力、焦慮和抑郁事件。⑥接受過腸道手術(shù)。⑦過去兩周使用了抗腹瀉藥物、益生菌和抗生素。⑧既往長期或近期具有腹脹、腹瀉、便秘等胃腸道不適。⑨大便常規(guī)異常。研究對象均自愿簽署知情同意書。

1.2標(biāo)本收集用無菌勺收集新鮮糞便樣本，置于2.0 mL無菌管中，2 h內(nèi)-80 ℃液氮冷凍。

1.3DNA提取及16S rRNA基因測序由武漢華大基因測序中心進(jìn)行DNA提取和16S rRNA基因測序。采用打珠法從標(biāo)本中提取總DNA，設(shè)計(jì)16S rRNA基因PCR引物，以總DNA為模板，擴(kuò)增16S rRNA v3～v4高變區(qū)。隨后，使用Illumina Hiseq 2500 PE250協(xié)議進(jìn)行靶向擴(kuò)增子測序。使用軟件Flash[9]合并原始對端序列，并用標(biāo)簽分割，最小重疊15 bp，允許不匹配率<0.1。在默認(rèn)設(shè)置下，usearch(v7.0.1090)[10]用于將每個讀取值聚集到OTU(操作分類單元)中，并通過與參考數(shù)據(jù)庫比對，進(jìn)行分類注釋。

1.4菌群群落多樣性及分類特征分析通過與數(shù)據(jù)庫比對，對OTU進(jìn)行物種分類并針對每個樣品菌群門分類水平作物種概述柱狀圖。測量α多樣性(每個樣本的物種多樣性)，通過chao指數(shù)、ace指數(shù)、shannon指數(shù)以及simpson指數(shù)[11]對比兩組α多樣性的差異。β多樣性(樣本之間的總體差異)使用Weighted UniFrac的單分式距離矩陣[3]測量，并通過非度量多維標(biāo)度(NMDS)方法進(jìn)行可視化。利用Lefse選擇與GDM相關(guān)的菌群特征，并用于在高維數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物和揭示基因組特征。

1.5腸道γ-變形桿菌DNA的qRT-PCR檢測γ-變形桿菌的引物來源于Yang等[12]。PCR反應(yīng)體系50 μL：H2O 22 μL，2×buffer 25 μL, 上、下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，與T載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)成重組菌，PCR法鑒定重組菌，使用Qiagen質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，使用NanoDrop測定質(zhì)粒濃度。以所提取的質(zhì)粒10倍系列稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(橫坐標(biāo)代表拷貝數(shù)，縱坐標(biāo)代表CT值)。用稀釋后的重組質(zhì)粒作為模板，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。引物序列：γ877-F：5’-GCTAACGCATTAAGTRYCCCG-3’；γ1066-R：5’-GCCATGCRGCACCTGTCT-3’，產(chǎn)物大小189 bp。反應(yīng)體系16 μL：H2O 6.6 μL，2×PCR Mix(Qiagen) 8 μL, 上、下游引物各0.2 μL，模板DNA 1 μL。反應(yīng)條件: 95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性10 s, 60 ℃變性10 s, 72 ℃退火40 s，40個循環(huán)。反應(yīng)在ABI ViiA 7 PCR儀進(jìn)行，每個標(biāo)本做3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 24.0分析。兩組孕婦一般臨床資料的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)或精確概率法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1兩組孕婦一般臨床資料的比較見表1。兩組孕婦年齡、孕前BMI、孕期增重、孕次、產(chǎn)次、孕周等差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.216S rRNA測序結(jié)果選擇50 000個高質(zhì)量16S rRNA擴(kuò)增子序列進(jìn)行分析，2個GDM患者因糞便DNA含量低被排除。由物種注釋分析圖(圖1)可見，GDM組優(yōu)勢門包括變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門。由圖2可見兩組α多樣性(左)和β多樣性(右)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Lefse分析(圖3)顯示，GDM組中γ-變形桿菌明顯增多。

表1 兩組孕婦一般臨床資料的比較

*：精確概率法

圖1 門分類水平中物種概述柱狀圖

圖2 α多樣性(左)及β多樣性(右)分析

圖3 Lefse分析

2.3兩組腸道γ-變形桿菌DNA的qRT-PCR檢測結(jié)果GDM組腸道γ-變性桿菌DNA的CT值為31.790±2.340，高于對照組的9.890±2.290(t=16.367，P<0.001)。

3 討論

近年來，腸道菌群的研究成為各個領(lǐng)域的熱點(diǎn)。有研究[7，13-14]表明腸道菌群可能通過影響炎癥反應(yīng)、促進(jìn)脂肪儲存等引起胰島素抵抗，因此，調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)可能是一種治療全身炎癥的新方法。

Mie等[7]的研究結(jié)果表明GDM組腸道菌群中門水平的放線菌和屬水平的柯林斯氏菌、羅氏菌和脫硫弧菌的豐度較高。Hasan等[15]研究卻發(fā)現(xiàn)GDM組和對照組的腸道菌群組成差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們的研究結(jié)果表明，GDM患者的腸道菌群中變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門比例明顯升高，其中γ-變形桿菌升高最為顯著。GDM組與對照組的α多樣性及β多樣性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GDM是一種多因素疾病，懷孕期間菌群的動態(tài)變化、研究人群之間的遺傳和表型差異以及實(shí)驗(yàn)性誤差、樣本量不足等都可導(dǎo)致結(jié)果的差異。

有研究[16]發(fā)現(xiàn)γ-變形桿菌與炎癥反應(yīng)及胰島素抵抗密切相關(guān)。我們也通過16S rRNA測序，利用Lefse分析方法發(fā)現(xiàn)了GDM與γ-變形桿菌的關(guān)聯(lián)，為GDM的診療打開了新的思路。

綜上所述，GDM患者孕晚期腸道γ-變形桿菌的增加可能成為監(jiān)測GDM狀態(tài)的非侵入性生物標(biāo)志物。然而目前對于腸道菌群與GDM之間的機(jī)制研究較少，可進(jìn)一步從脂代謝等方面進(jìn)行深入研究。此外，通過調(diào)節(jié)腸道菌群可能對GDM的防治產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。