袁偉權(quán) 黎藝強(qiáng) 陳志鵬 林瑋 趙勝利 莫小毅 陳柏齡

1中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院脊柱外科（廣州510080）；2廣東省骨科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣州510080）；3廣州市婦女兒童醫(yī)療中心骨科（廣州510623）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是常見的全身性骨骼疾病，表現(xiàn)為骨密度降低、骨微結(jié)構(gòu)損壞、骨強(qiáng)度降低和易發(fā)生脆性骨折［1-2］。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是OP 中最常見的一種。據(jù)估計(jì)，全世界超過2 億人患有OP，歐美國家大約30%的絕經(jīng)后婦女患有OP［3］。雙膦酸鹽是治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的一線藥物，能特異的與骨質(zhì)中的羥膦灰石結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞活性，從而抑制骨質(zhì)吸收［4-5］。福美加（阿侖膦酸鈉維D3）為阿侖膦酸鈉和維生素D3的復(fù)方制劑，是目前臨床上常用的抗骨質(zhì)疏松藥物，能顯著抑制骨質(zhì)流失，增加骨密度，減少髖部、椎體和非椎體骨折［6-7］。既往研究中，OP 治療的療效觀察主要集中在骨密度及骨代謝產(chǎn)物方面［8］，而在干骺端骨組織形態(tài)學(xué)和生物力學(xué)方面的結(jié)論尚未知曉。本研究旨在探討福美加對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松大鼠長(zhǎng)骨干骺端骨組織計(jì)量學(xué)和生物力學(xué)的影響，進(jìn)一步觀察松質(zhì)骨富集區(qū)和皮質(zhì)區(qū)在骨質(zhì)疏松發(fā)病和治療過程中的變化情況對(duì)骨質(zhì)疏松的預(yù)測(cè)、預(yù)防和治療具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3月齡雌性SPF 級(jí)Sprague Dawley（SD）大鼠30 只，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境為SPF 級(jí)，溫度為（25 ± 1）℃，相對(duì)濕度為55%，每日照明12 h，分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水和飼料。本研究經(jīng)過中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。福美加（2800U）由杭州默沙東制藥有限公司提供（國藥準(zhǔn)字J20140022）。

1.2 動(dòng)物分組將大鼠編號(hào)，用隨機(jī)數(shù)表法將其隨機(jī)分成3組，每組10只，分別為假手術(shù)組（Sham）、去卵巢組（OVX）和福美加組（ALN）。其中OVX、ALN 組大鼠采用背部脊柱旁切口行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，Sham 組大鼠采用相同切口，保留卵巢及輸卵管等結(jié)構(gòu)功能完整，于卵巢周圍切除相同體積的脂肪組織。

1.3 動(dòng)物給藥造模8 周后，ALN 組給予大鼠等效劑量7 mg/kg 的福美加，每周灌胃1 次。Sham 和OVX 組每周灌服10 mL/kg 的生理鹽水。福美加劑量的選擇根據(jù)NAIR 等［9］報(bào)道的動(dòng)物與人之間藥物劑量轉(zhuǎn)換進(jìn)行等效劑量換算。所有的處理持續(xù)12 周后，將所有大鼠處死獲取股骨、脛骨和腰5 椎骨。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 骨密度測(cè)量獲取的股骨和腰5 椎骨，采用雙能X 線吸收測(cè)定法（DXA，GE LUNAR?Prodigy，Madison，WI，USA）測(cè)量股骨和第5腰椎的骨密度。

1.4.2 骨組織計(jì)量學(xué)檢測(cè)所有大鼠的脛骨行骨組織形態(tài)學(xué)檢查。具體方法與我們之前的研究［10］相似。將脛骨用4%多聚甲醛固定24 h，用不同濃度的乙醇（70%、95%和100%）梯度脫水24 h，浸蠟包埋。然后用SP2500 切片機(jī)（Leica Microsystems，Wetzlar，Germany）在脛骨干骺端制作冠狀切片，切片厚度為5 μm，Masson 三色染色試劑盒對(duì)切片進(jìn)行染色。采用半自動(dòng)數(shù)字化圖像分析軟件（BioQuant Osteo 2009）進(jìn)行骨組織形態(tài)學(xué)分析。分析結(jié)果包括總組織體積（TV）、骨體積（BV）和骨表面積（BS）等。然后根據(jù)這些參數(shù)計(jì)算出骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）。

1.4.3 骨生物力學(xué)指標(biāo)測(cè)定骨生物力學(xué)指標(biāo)測(cè)定在材料測(cè)試系統(tǒng)（MTS 858 bionix Ⅱmachine，MTS System Inc.，Minneapolis，MN，USA）下進(jìn)行。每只大鼠的股骨均被隨機(jī)分配進(jìn)行股骨干彎曲試驗(yàn)和股骨干骺端彎曲試驗(yàn)。這兩種生物力學(xué)彎曲試驗(yàn)測(cè)定方法與我們之前的研究相同［10-11］。將股骨干和干骺端（骨骺近5 mm）分別水平固定在MTS 平臺(tái)上，并向其施加5 mm/min 恒定位移的垂直力，直到股骨樣本破壞。記錄載荷和位移，根據(jù)載荷-位移曲線計(jì)算了最大載荷、破壞載荷和剛度［11］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0（SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用單因素方差分析，多組間比較采用LSD?t檢驗(yàn)法。以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨密度ALN 組大鼠1只在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前死亡，被排除在外。不同組別大鼠的體質(zhì)量和骨密度結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)前大鼠組間在體質(zhì)量上無明顯差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，Sham 組大鼠體質(zhì)量明顯低于其他組（P<0.05）。ALN和OVX組的體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。OVX組股骨和L5椎體骨密度明顯低于ALN 組（P< 0.05）。ALN 和Sham 組股骨和L5 椎體骨密度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表1 不同組別大鼠的體質(zhì)量（g）和骨密度（g/cm2）Tab.1 Body weight（g）and BMD（g/cm2）of the rats in groups±s

表1 不同組別大鼠的體質(zhì)量（g）和骨密度（g/cm2）Tab.1 Body weight（g）and BMD（g/cm2）of the rats in groups±s

組別實(shí)驗(yàn)前體質(zhì)量實(shí)驗(yàn)后體質(zhì)量股骨骨密度L5椎體骨密度OVX（n=10）238.2±37.5 361.3±22.2 0.202±0.029 0.149±0.014 Sham（n=10）251.2±30.7 310.5±37.6 0.221±0.033 0.172±0.011 ALN（n=9）236.6±33.2 365.1±18.4 0.241±0.018 0.177±0.011 P值0.748 0.001 0.006<0.001

2.2 骨組織計(jì)量學(xué)Sham 和ALN 組骨量明顯高于OVX 組（圖1A）。ALN 組骨質(zhì)量參數(shù)（BV/TV，Tb.N，Tb.Th）均明顯大于OVX 組（P< 0.05，圖1B）。在骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）上，ALN 和Sham 組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖1B）。

2.3 生物力學(xué)股骨干彎曲試驗(yàn)和股骨干骺端彎曲試驗(yàn)結(jié)果見表2。Sham 和ALN 組股骨干及干骺端的最大載荷、破壞載荷和剛度明顯高于OVX 組（P< 0.05）。Sham 和ALN 組之間股骨干生物力學(xué)參數(shù)無明顯差異（P> 0.05）。OVX 組與ALN 組股骨干骺端彎曲試驗(yàn)最大載荷、破壞載荷的均值顯著高于股骨干彎曲試驗(yàn)（P< 0.05，圖2）。

表2 不同組別兩種生物力學(xué)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Tab.2 Biomechanical results in groups ±s

表2 不同組別兩種生物力學(xué)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Tab.2 Biomechanical results in groups ±s

組別骨干彎曲試驗(yàn)最大載荷（N）破壞載荷（N）剛度（N/mm）干骺端彎曲試驗(yàn)最大載荷（N）破壞載荷（N）剛度（N/mm）OVX（n=10）101.01±12.60 85.08±8.17 106.62±14.77 60.24±2.82 41.57±5.33 66.70±8.20 Sham（n=10）119.56±15.56*106.44±13.73*147.83±14.60*108.07±15.29*91.94±10.31*110.21±13.25*ALN（n=9）127.98±14.62*110.14±13.68*143.30±14.26*106.63±14.40*92.13±13.23*100.92±12.11*

3 討論

圖2 兩種股骨彎曲試驗(yàn)ALN?OVX 平均差值的比較Fig.2 Comparison of mean difference ALN?OVX in two femur bending tests

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥中最常見的類型［2］。3月齡雌性大鼠的性器官已經(jīng)成熟、體重已趨于穩(wěn)定，體內(nèi)骨的形成和吸收處于平穩(wěn)狀態(tài)［12］，能很好地模擬絕經(jīng)后的OP。在本研究中，我們采用卵巢切除大鼠骨質(zhì)疏松模型，觀察到OVX 組大鼠骨骺部松質(zhì)骨富集區(qū)較Sham 組明顯減少，而經(jīng)過福美加治療后大鼠骨骺部松質(zhì)骨富集區(qū)明顯增多并與Sham 組無明顯差異，而在皮質(zhì)區(qū)上則未見明顯差異。這可能是由于在雌激素缺乏誘導(dǎo)的OP 模型中，干骺端松質(zhì)骨富集區(qū)骨量的丟失早于皮質(zhì)區(qū)［13］，而福美加的運(yùn)用，能逆轉(zhuǎn)雌激素缺乏誘導(dǎo)的松質(zhì)骨富集區(qū)骨量丟失。既往有研究表明卵巢切除大鼠股骨骨干未見BMD、骨幾何學(xué)或機(jī)械強(qiáng)度的改變，可能是因?yàn)槠べ|(zhì)骨比松質(zhì)骨更不易受卵巢切除影響而引起骨丟失［14］。而在JU 等［13］的研究中發(fā)現(xiàn)，卵巢切除大鼠模型中松質(zhì)骨富集區(qū)小梁骨的厚度、數(shù)目和連接減少。破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的活動(dòng)失衡是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的主要原因［15］。阿侖膦酸鹽與骨骼羥磷灰石的親和力高，能特異性地結(jié)合到骨表面抑制破骨細(xì)胞的功能，抑制松質(zhì)骨富集區(qū)骨的吸收來減少骨重塑，而在皮質(zhì)骨組織中則未見明顯改變［16-17］。福美加能逆轉(zhuǎn)雌激素缺乏誘導(dǎo)的松質(zhì)骨富集區(qū)骨量的丟失，這可能與鈣磷代謝密切相關(guān)［18］。有研究表明絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松婦女運(yùn)用福美加一段時(shí)間后能明顯改善血清和尿中鈣磷及相關(guān)代謝物的含量［19］、減少骨量丟失和提高腰椎BMD［18］。SAKKA 等［8］在治療Hajdu?Cheney 綜合征時(shí)發(fā)現(xiàn)阿侖膦酸鹽的運(yùn)用可提高患者腰椎BMD 和縱向皮質(zhì)厚度和密度。研究發(fā)現(xiàn)，類固醇可通過增強(qiáng)皮質(zhì)骨的形成進(jìn)而增加大鼠長(zhǎng)骨的尺寸、骨密度和強(qiáng)度，而雌激素則可通過抑制骨吸收來維持松質(zhì)骨富集區(qū)骨小梁的骨密度［20］。MOSEKILDE 等［16］觀察單側(cè)后肢固定大鼠模型4 周后發(fā)現(xiàn)松質(zhì)骨富集區(qū)骨強(qiáng)度顯著下降約16%～28%，而骨干中央?yún)^(qū)皮質(zhì)骨未觀察到明顯的變化。TOLEDANO 等［21］提出骨小梁質(zhì)量的測(cè)定可以衡量骨質(zhì)疏松的程度?？傮w而言，筆者認(rèn)為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者骨量的丟失是從松質(zhì)骨富集區(qū)小梁骨丟失開始，逐漸發(fā)展到皮質(zhì)骨骨量的丟失，而福美加等藥物的運(yùn)用早期即可通過抑制松質(zhì)骨富集區(qū)骨的吸收來增強(qiáng)骨的強(qiáng)度、提高患者的骨質(zhì)量和骨密度。因此，骨骺部松質(zhì)骨富集區(qū)骨量情況可作為骨質(zhì)疏松早期診斷和藥物治療的監(jiān)測(cè)部位，將對(duì)骨質(zhì)疏松的早期診斷和治療監(jiān)測(cè)發(fā)揮重要的作用。

雌激素缺乏可使干骺端骨小梁體積減少，增加遠(yuǎn)端干骺端和骨干中央?yún)^(qū)皮質(zhì)骨的體積［22］。THORMANN 等［23］在研究骨質(zhì)疏松與生理性骨骺端骨折愈合中發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松性骨和非骨質(zhì)疏松性骨的干骺端骨缺損愈合存在差異。目前，動(dòng)物股骨生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)常用檢測(cè)方式為股骨干彎曲試驗(yàn)，即三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)［8，24］。股骨干彎曲試驗(yàn)在診斷骨質(zhì)疏松和早期治療療效觀察中存在靈敏度較差、差異性較大的情況［11］。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松早期和骨質(zhì)疏松治療早期，骨量的丟失和生成主要集中在松質(zhì)骨富集區(qū)［25-26］，而股骨干骺端彎曲試驗(yàn)可反映干骺端松質(zhì)骨富集區(qū)骨強(qiáng)度的情況。我們既往的研究表明股骨干骺端彎曲試驗(yàn)可用于評(píng)估骨質(zhì)疏松大鼠的股骨生物力學(xué)特性變化，且具有靈敏度較高，穩(wěn)定性較好的特征［11］。本研究進(jìn)行了兩項(xiàng)生物力學(xué)試驗(yàn)的比較，發(fā)現(xiàn)股骨干骺端彎曲試驗(yàn)最大載荷和破壞載荷中，OVX 組與治療組的差值差異顯著高于股骨干彎曲試驗(yàn)。表明股骨干骺端彎曲試驗(yàn)可用于評(píng)估骨質(zhì)疏松的診斷和治療療效觀察，并且股骨干骺端彎曲試驗(yàn)在評(píng)估骨質(zhì)疏松大鼠的生物力學(xué)性能變化方面比股骨干彎曲試驗(yàn)更敏感。

綜上所述，雌激素缺乏誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松，松質(zhì)骨富集區(qū)骨量丟失較皮質(zhì)區(qū)明顯。福美加的運(yùn)用可顯著提高骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度、骨組織計(jì)量學(xué)參數(shù)和生物力學(xué)性能，且作用于長(zhǎng)骨干骺端松質(zhì)骨富集區(qū)的效果大于皮質(zhì)區(qū)。在今后的研究中，我們將進(jìn)一步探討抗骨質(zhì)疏松藥物預(yù)防、治療骨質(zhì)疏松的具體機(jī)制和分子機(jī)制，與臨床相結(jié)合，為骨質(zhì)疏松的早期預(yù)測(cè)、預(yù)防和治療提供新的證據(jù)。