向濤 梁巍巍 柯文 徐梓筠 修玲玲 衛(wèi)國紅

中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科（廣州510080）

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)持續(xù)升高，是全球增速最快的惡性腫瘤［1］。甲狀腺癌按組織形態(tài)學(xué)可分為起源于濾泡上皮細(xì)胞的甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid cancer，PTC）、濾泡狀甲狀腺癌（follicular thyroid cancer，F(xiàn)TC）和未分化甲狀腺癌（anaplastic thyroid cancer，ATC）以及起源于濾泡旁C 細(xì)胞的甲狀腺髓樣癌（medullary thyroid cancer，MTC）［2］。PTC 在甲狀腺癌中約占90%［3］，盡管大多數(shù)PTC 患者預(yù)后很好，但它具有較強(qiáng)的侵襲和定植能力，容易抵抗失巢凋亡發(fā)生淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移，甚至?xí)シ只葑優(yōu)楦鼝盒缘陌┌Y［4］。因此研究PTC 惡性進(jìn)展過程中的分子機(jī)制，尋找調(diào)控PTC 發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素和作用分子具有重要意義［5］。LncRNAs 是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過200 nt 的不編碼蛋白的RNA 分子，它們可以通過對(duì)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控、基因組印跡和染色質(zhì)修飾等多種機(jī)制在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮廣泛的調(diào)控作用［7］，如LncRNA RP11?356I2.2 在胃癌中表達(dá)降低能抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和成瘤［8］。在甲狀腺癌中，目前也發(fā)現(xiàn)多種異常表達(dá)的lncRNAs，其中部分lncRNAs 的功能得到了初步研究，例如一些在甲狀腺癌中表達(dá)下降的lncRNAs（如NAMA 等）具有抑癌作用［8］，而表達(dá)增加的lncRNAs（如h19 等）則具有致癌作用［10］，關(guān)于lncRNAs 調(diào)控甲狀腺癌功能的機(jī)制也有初步的研究，如LINC00377 在甲狀腺癌組織中低表達(dá)，在SW579 細(xì)胞中證實(shí)過表達(dá)LINC00377 能夠通過下調(diào)miR?29a?3p 表達(dá)促進(jìn)ADAMTS9 基因的表達(dá)進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖和遷移［11］。AC244502.3?201 是一種長(zhǎng)為844 nt 的lncRNA 分子，它位于14 號(hào)染色體22，415，362?22，418，657，由3 個(gè)外顯子組成。目前關(guān)于AC244502.3?201 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用還未被報(bào)道。

本研究旨在探討AC244502.3?201 在PTC 中的表達(dá)水平，并分析AC244502.3?201 對(duì)PTC 細(xì)胞增殖及侵襲遷移的影響以及可能的分子機(jī)制，為理解PTC 發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制及新的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本收集收集2019年在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院進(jìn)行外科手術(shù)治療的10 例PTC 患者的癌組織及癌旁組織。取得的標(biāo)本用無菌PBS（phosphate buffer saline）洗滌后快速放入液氮儲(chǔ)存待測(cè)。本研究通過中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞以及主要試劑Nthy?ori3?1、BCPAP 、TPC1、KTC1 和K1 細(xì)胞購自于北納生物（BNCC）細(xì)胞庫。DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培養(yǎng)基和胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）購自美國Gibco 公司。BCA 蛋白定量試劑盒、核漿分離試劑盒、TRIzol 試劑及Lipofectamine 3000 購自美國Invitrogen 公司。Transwell 小室購自美國Corning 公司。RIPA 裂解液、CCK?8 試劑盒購自美國Sigma 公司。逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)試劑購買于日本TaKaRa 公司。一抗和二抗均購自于美國CST 公司。qRT?PCR 引物于金唯智公司合成。EdU 試劑盒購自銳博公司，Smart Silencer 也由銳博公司設(shè)計(jì)合成。

1.3 RNA 提取和實(shí)qRT?PCR 檢測(cè)用TRIzol 試劑提取組織和細(xì)胞中的總RNA。采用MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)獲得互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA）。qRT?PCR 實(shí)驗(yàn)采用SYBR Green 法，用CFX96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)程序。β?actin 用于標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參，用2?ΔΔCt計(jì)算最終基因表達(dá)差異。相關(guān)引物序列如下：AC244502.3?201 上游引物：5'?GACAGGGAAGAAGATGAAT?3'，下游引物：5'?CGTCTCCTTGTTGATGTA?3'；β?actin 上游引物：5'?AGCCATGTACGTAGCCATCCA?3'，下游引物：5'?TCTCCGGAGTCCATCACAATG?3'；U1 上游 引物：5'?TCCCAGGGCGAGGCTTATCCATT?3'，下游引物：5'?GAACGCAGTCCCCCACTACCACAAAT?3'；CCND1上游引物：5'?GCTGCGAAGTGGAAACCATC?3'，下游引物：5'?CCTCCTTCTGCACACATTTGAA?3'；MYC 上游引物：5'?GGCTCCTGGCAAAAGGTCA?3'，下游引物：5'?CTGCGTAGTTGTGCTGATGT?3'；MMP9 上游引物：5'?TGTACCGCTATGGTTACAC?TCG?3'，下游引物：5'?GGCAGGGACAGTTGCTTCT?3'；VEGF 上游引物：5'?ATGGACCAGTGAAGCGAT?CAT?3'，下游引物：5'?GTTCCTCCAAACTAGAAGC?AGC?3'。

1.4 核漿分離試驗(yàn)核漿分離試劑盒用于分離細(xì)胞核和細(xì)胞漿的RNA 組分。qRT?PCR 實(shí)驗(yàn)用于探測(cè)AC244502.3?201 的亞細(xì)胞定位。β?actin 用于細(xì)胞漿的參照標(biāo)準(zhǔn)，U1 用于細(xì)胞核的參照標(biāo)準(zhǔn)，引物序列見1.3。

1.5 細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染細(xì)胞用含有10%FBS的DMEM 培養(yǎng)基，放置于在37 ℃的5%CO2恒溫孵箱中培養(yǎng)。為了敲低AC244502.3?201在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，由銳博公司設(shè)計(jì)合成特異性敲低AC244502.3?201 的Smart Silencer。Smart Silencer 由3 條siRNAs和3 條ASOs 構(gòu) 成。3 條siRNAs 的靶 序 列為：5'?GCAAATCTTCACTGTGAAA?3'；5'?TCACTCCTAAT?GGAATCAA?3'；5'?GCGAGCAGAACAAATCAAA?3'；3 條ASOs 的靶序列為：5'?CCCTATCCATGGT?GACTCCC?3'；5'?CTTGCTGAGGTCCCTTCCAC?3'；5'?TGATTTGTCTGGTGCACCCA?3'。其對(duì)照Nega?tive control（NC）也由銳博公司提供，是由不包含人、鼠和兔的同源序列的3 條siRNAs 和3 條ASOs 構(gòu)成。Smart Silencer 和NC 的轉(zhuǎn)染均采用Lipofectamine 3000，按照試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.6 細(xì)胞增殖檢測(cè)將細(xì)胞接種于96孔板，CCK?8試劑孵育30 min 后，采用分光光度計(jì)測(cè)量450 nm處的吸光度，每24 h 檢測(cè)1 次細(xì)胞增殖水平。細(xì)胞接種于24 孔板，在EdU 試劑盒說明書的指導(dǎo)下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行孵育標(biāo)記，通過計(jì)數(shù)熒光顯微鏡下能被EdU 標(biāo)記的陽性細(xì)胞數(shù)目來檢測(cè)細(xì)胞增殖效率。細(xì)胞接種于6 孔板，10% FBS 培養(yǎng)7 d，4%多聚甲醛固定后采用結(jié)晶紫染色，漂洗后于顯微鏡下拍照并進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.7 細(xì)胞侵襲遷移能力檢測(cè)運(yùn)用8 μm 孔徑的Transwell 小室進(jìn)行細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)。提前在小室的上室中鋪50 μg 基質(zhì)膠，加入含4×104個(gè)細(xì)胞的200 μL 無血清DMEM，下室加入500 μL 含有20%FBS 的DMEM，培養(yǎng)48 h 后，用4%多聚甲醛固定30 min，并用結(jié)晶紫染色30 min，漂洗后于顯微鏡下拍照并統(tǒng)計(jì)遷移入下室的細(xì)胞。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)則不采用基質(zhì)膠讓腫瘤細(xì)胞遷移24 h。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)NF?κB 信號(hào)通路活性檢測(cè)采用報(bào)告質(zhì)粒pNFκB?TA?Luc（Clon?tech）。該質(zhì)粒在熒光素酶基因（Luciferase）前含有NF?κB順式作用增強(qiáng)元件（NF?κB cis?acting enhanc?er element），能夠檢測(cè)NF?κB 信號(hào)通路的活性。細(xì)胞接種于24 孔板，運(yùn)用Lipofectamine 3000 共轉(zhuǎn)染Smart Silencer 或NC、pNFκB?TA?Luc 以及Renilla 內(nèi)參基因，轉(zhuǎn)染6 h 后更換為含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，36 h 后根據(jù)Dual?luciferaseTMReport Assay Kit說明書檢測(cè)熒光素酶活性。

1.9 Western Blot 檢測(cè)采用RIPA 裂解液裂解細(xì)胞收集總蛋白，運(yùn)用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度。制備蛋白樣品，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS?PAGE）凝膠電泳，聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）轉(zhuǎn)膜后，用5%的脫脂牛奶封閉60 min。一抗4 ℃孵育過夜、二抗室溫孵育2 h，之后采用ECL 化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影。

1.10 TANRIC（The Atlas of Noncoding RNAs in Cancer）數(shù)據(jù)分析TANRIC（https：//bioinformatics.mdanderson.org/public?software/tanric/）分析了來源于TCGA（The Cancer Genome Atlas Program）的RNA?seq 數(shù)據(jù)，使得研究者能夠快速且直觀地分析感興趣的lncRNAs。為了鑒定在甲狀腺癌中具有差異表達(dá)的lncRNAs，筆者從TANRIC 中下載了497 例甲狀腺癌樣本及59 例癌旁非癌組織樣本的lncRNAs 數(shù)據(jù)。利用SPSS 20.0 軟件的成組t檢驗(yàn)方法分析腫瘤組和癌旁組的差異表達(dá)的lncRNAs。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有統(tǒng)計(jì)分析均使用IBM SPSS Statistics 20.0 軟件，統(tǒng)計(jì)方法使用t檢驗(yàn)。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AC244502.3?201在PTC 中高表達(dá)為了尋找在甲狀腺癌中具有差異表達(dá)的lncRNAs，本研究分析了TANRIC 下載的甲狀腺癌lncRNAs 表達(dá)數(shù)據(jù)。取差異倍數(shù)≥20倍且P<0.01的lncRNAs（共96個(gè)）進(jìn)一步分析。筆者注意到其中AC244502.3?201 表達(dá)明顯升高（P< 0.05，圖1A），且在腫瘤中尚無相關(guān)研究報(bào)道，于是筆者選擇其進(jìn)一步深入研究。在收集的10 對(duì)成對(duì)PTC 組織與相應(yīng)癌旁組織中采用qRT?PCR 驗(yàn)證其表達(dá)情況，結(jié)果顯示AC244502.3?201 在PTC 中的表達(dá)量相較癌旁組織明顯升高（P< 0.05，圖1B）。同時(shí)qRT?PCR 檢測(cè)人正常甲狀腺細(xì)胞（Nthy?ori3?1）和4 株P(guān)TC 細(xì)胞系（BCPAP、TPC1、KTC1 和K1）中AC244502.3?201 的表達(dá)量，結(jié)果顯示AC244502.3?201 在PTC 細(xì)胞系中的表達(dá)明顯升高（P<0.05，圖1C）。

圖1 AC244502.3?201 在PTC 中表達(dá)明顯升高Fig.1 The expression of AC244502.3?201 is upregulated in PTC

2.2 AC244502.3?201 的基本生物學(xué)特征采用生物信息學(xué)軟件（CPC，http：//cpc.cbi.pku.edu.cn/）預(yù)測(cè)AC244502.3?201 的編碼能力，結(jié)果表明其不具備蛋白編碼的能力（圖2A）。進(jìn)一步利用ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）分 析AC244502.3?201 的序列，結(jié)果顯示AC244502.3?201的序列中不含有>100 個(gè)氨基酸的開放閱讀框（圖2B），進(jìn)一步證實(shí)AC244502.3?201 不具備編碼蛋白的能力。在PTC 細(xì)胞系（BCPAP 和TPC1）中，核漿分離RNA 實(shí)驗(yàn)結(jié)合qRT?PCR 檢測(cè)AC244502.3?201細(xì)胞定位，結(jié)果顯示AC244502.3?201 主要定位于細(xì)胞漿（圖2C）。

2.3 細(xì)胞水平敲低AC244502.3?201 的表達(dá)抑制PTC 細(xì)胞的增殖前面結(jié)果已表明AC244502.3?201的表達(dá)量在BCPAP和TPC1中升高更為明顯，所以選擇BCPAP 和TPC1 細(xì)胞用來做敲低實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證生物學(xué)功能。采用Smart silencer 敲低AC244502.3?201 的表達(dá)，qRT?PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Smart silencer能顯著降低細(xì)胞內(nèi)AC244502.3?201 的表達(dá)（P<0.05，圖3A）。CCK?8檢測(cè)結(jié)果顯示敲低AC244502.3?201 表達(dá)后細(xì)胞活力較對(duì)照組明顯降低（P<0.05，圖3B）。EdU 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲低AC244502.3?201表達(dá)的細(xì)胞在24 h 之后EdU 標(biāo)記的陽性細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組明顯減少（P<0.05，圖3C）。克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲低AC244502.3?201 表達(dá)之后細(xì)胞集落數(shù)目顯著低于對(duì)照組（P<0.05，圖3D）。

2.4 細(xì)胞水平敲低AC244502.3?201 的表達(dá)抑制了PTC 細(xì)胞的遷移和侵襲在PTC 細(xì)胞系（BC?PAP 和TPC1）中敲低AC244502.3?201 表達(dá)，Tran?swell 實(shí)驗(yàn)證明敲低AC244502.3?201 表達(dá)后，無論是細(xì)胞的侵襲還是遷移能力都較對(duì)照組顯著下降（P<0.05，圖4A、4B）。

2.5 敲低AC244502.3?201 表達(dá)抑制了NF?κB 信號(hào)通路在PTC 細(xì)胞系（BCPAP 和TPC1）中敲低AC244502.3?201 表達(dá)后通過qRT?PCR 檢測(cè)增殖、侵襲相關(guān)基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)MYC、CCND1、MMP9及VEGF的表達(dá)均明顯下調(diào)（P<0.05，圖5A，5B）?？紤]這些基因是NF?κB 信號(hào)通路的下游效應(yīng)分子，進(jìn)一步通過NF?κB 信號(hào)通路報(bào)告質(zhì)粒分析AC244502.3?201 是否調(diào)控NF?κB 信號(hào)通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AC244502.3?201 敲低顯著抑制NF?κB 信號(hào)通路活性（P< 0.05，圖5C）。同時(shí)提取相應(yīng)細(xì)胞的核蛋白，發(fā)現(xiàn)AC244502.3?201 敲低顯著抑制NF?κB p65 入核（P< 0.05，圖5D）。以上結(jié)果表明AC244502.3?201 調(diào)控NF?κB 信號(hào)通路。

3 討論

LncRNAs 本身不具有編碼蛋白的能力，長(zhǎng)期以來被認(rèn)為是不具有生物學(xué)功能的“轉(zhuǎn)錄噪音”［12］。近年來大量的研究發(fā)現(xiàn)lncRNAs 廣泛參與細(xì)胞的各種生物學(xué)行為如分化［13］、增殖［14］、衰老［15］、自噬［16］等，在基因轉(zhuǎn)錄翻譯及或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等個(gè)方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用。在PTC 中已經(jīng)證實(shí)多種lncRNAs 的差異表達(dá)并在PTC 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，如lncRNA HIT000218960 能夠增強(qiáng)HM?GA2 表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)PTC 的惡性進(jìn)展［17］，而BANCR在PTC 中低表達(dá)起抑癌基因的作用［18］。然而這些差異表達(dá)的lncRNAs 中大部分的功能和分子機(jī)制還未被深入了解。

圖2 AC244502.3?201 的基本生物學(xué)特征Fig.2 Characters of AC244502.3?201

圖3 敲低AC244502.3?201 對(duì)PTC 細(xì)胞增殖能力的影響Fig.3 Effects of knockdown of AC244502.3?201 on the proliferation of PTC cell

圖4 敲低AC244502.3?201 對(duì)PTC 細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響Fig.4 Effects of knockdown AC244502.3?201 on the migration and invasion of PTC cell

圖5 敲低AC244502.3?201 表達(dá)對(duì)NF?κB 信號(hào)通路的影響Fig.5 Effects of knockdown AC244502.3?201 on the NF?κB signal pathway

關(guān)于AC244502.3?201 在腫瘤中的作用目前尚無相關(guān)報(bào)道。本研究通過對(duì)TANRIC 的數(shù)據(jù)和收集的PTC 患者的癌及癌旁組織進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)AC244502.3?201 在PTC 組織中表達(dá)明顯上調(diào)。并進(jìn)一步驗(yàn)證了相較于人正常甲狀腺細(xì)胞，其在PTC 細(xì)胞系的表達(dá)也明顯上調(diào)。這些提示了AC244502.3?201 在PTC 的發(fā)生發(fā)展中可能具有重要作用。然后明確了其作為長(zhǎng)鏈非編碼RNA 的生物學(xué)特性。并進(jìn)一步通過多種體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了敲低AC244502.3?201 能夠抑制PTC 細(xì)胞增殖、侵襲和遷徙能力，這證明了AC244502.3?201 能調(diào)控PTC 的生物學(xué)功能。既往研究證實(shí)NF?κB 信號(hào)通路參與PTC 的發(fā)生發(fā)展。如安石榴苷能夠通過NF?κB 信號(hào)通路抑制BCPAP 細(xì)胞的衰老［19］。也有報(bào)道證實(shí)了lncRNAs 是NF?κB 信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的重要一員［20］。然而在PTC 中l(wèi)ncRNAs 與NF?κB 信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)尚未被深入研究。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)敲低AC244502.3?201 抑制了NF?κB 信號(hào)通路的活化，同時(shí)NF?κB 信號(hào)通路下游增殖及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因的表達(dá)也被抑制。這些結(jié)果表明AC244502.3?201 通過調(diào)控NF?κB 信號(hào)通路參與PTC 的惡性進(jìn)展。本研究首次闡明了AC244502.3?201 在PTC 中的表達(dá)、生物學(xué)功能及相關(guān)分子機(jī)制，為PTC 發(fā)生發(fā)展的理論添加了新的內(nèi)容，同時(shí)為尋找可能的PTC 新的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了AC244502.3?201 參與PTC 的發(fā)生發(fā)展，本研究不足之處：首先缺乏過表達(dá)AC244502.3?201 的相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)；其次缺乏體內(nèi)動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)證據(jù)；另外AC244502.3?201調(diào)控NF?κB 通路的具體分子機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。后續(xù)將通過AC244502.3?201 過表達(dá)的細(xì)胞模型及體內(nèi)動(dòng)物模型中進(jìn)一步驗(yàn)證其生物學(xué)功能，同時(shí)將深入探討明確AC244502.3?201 調(diào)控NF?κB 信號(hào)通路的具體分子機(jī)制。由于lncRNAs發(fā)揮生物學(xué)功能常常與其亞細(xì)胞定位相關(guān)，因此結(jié)合AC244502.3?201 位于細(xì)胞漿和此前報(bào)道的lncRNAs 發(fā)揮生物學(xué)功能的相關(guān)分子機(jī)制［21-22］，AC244502.3?201 可能作為分子支架在細(xì)胞漿中與NF?κB 信號(hào)通路中的重要調(diào)控分子結(jié)合發(fā)揮作用；也有可能作為誘餌吸附調(diào)控NF?κB 信號(hào)通路的microRNA 發(fā)揮作用。還需相關(guān)研究（RNA?pull down 結(jié)合質(zhì)譜分析等）進(jìn)一步探討AC244502.3?201調(diào)控NF?κB信號(hào)通路的具體機(jī)制。

綜上所述，本研究證實(shí)了AC244502.3?201 在PTC 中高表達(dá)，在BCPAP 和TPC1 細(xì)胞中敲低AC244502.3?201 表達(dá)能夠抑制NF?κB 信號(hào)通路活性及下游相關(guān)基因的表達(dá)，最終抑制細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。研究結(jié)果為理解PTC 發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制和可能治療靶點(diǎn)提供新的內(nèi)容。