陳莉 徐惠麗 王夢漪 張子龍

1華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院腫瘤科（武漢430014）；2華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬荊州醫(yī)院（湖北荊州434020）

2018年全球胃癌新發(fā)病例約100 萬例，死亡病例約78.3 萬例，嚴重威脅人類健康［1］。中國作為胃癌高發(fā)國家，發(fā)病和死亡例數(shù)均約占全世界的50%，疾病負擔(dān)相當(dāng)嚴重［2］。胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個多基因、多分子參與的多步驟復(fù)雜過程，原癌和抑癌基因的表達失調(diào)扮演著重要角色［3］。去乙?；?（sirtuin 4，SIRT4）作為去乙?；讣易宓某蓡T之一，已被證實在胃癌中顯著下調(diào)，發(fā)揮抑癌作用［4］。然而，其影響胃癌發(fā)生發(fā)展的上游調(diào)控機制尚不清楚。近年來，微小RNA（microRNA，miRNA，miR）作為一類長度約為20～25 個核苷酸內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，具有很高的保守性，可通過與靶mRNA 3'端非翻譯區(qū)（3'untransla?tional region，3'UTR）完全或不完全的互補結(jié)合導(dǎo)致靶mRNA 的降解或翻譯抑制，在轉(zhuǎn)錄后水平負性調(diào)控下游靶基因的表達，從而參與惡性腫瘤的進程［5-10］。在前期，筆者通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR?424?5p 在SIRT4 mRNA 的3'UTR 上存在一個潛在的結(jié)合位點，其可能調(diào)控SIRT4 的表達進而影響胃癌細胞的生物學(xué)過程，然而，相關(guān)研究未見報道。基于此，本研究旨在探討miR?424?5p 和SIRT4 在胃癌中的作用及具體分子機制，分析其對胃癌細胞遷移和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集收集2015年6月至2017年1月于武漢市中心醫(yī)院接受胃癌根治術(shù)的57 例胃癌患者的組織標(biāo)本，其中，男37 例，女20 例，年齡36 ～80 歲，平均（62.3 ± 7.8）歲。每例患者均取胃癌組織和腫瘤邊緣5 cm 處的相應(yīng)癌旁組織。并收集所有患者的腫瘤大小、病理分型、腫瘤分期等相關(guān)臨床病理資料。所有患者在術(shù)前均經(jīng)病理證實，且均未接受放化療等抗腫瘤治療措施。本研究經(jīng)武漢市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)，所有患者和家屬均簽署知情同意書。

1.2 實驗材料及來源正常人胃上皮細胞系GES?1和胃癌細胞系（HGC?27，BGC?823，SGC?7901，MKN?28，MKN?45）購自中國科學(xué)院上海細胞庫；胎牛血清和RPMI 1640 培養(yǎng)液購自美國Gibco 公司；miR?424?5p mimic 和inhibitor 及Negative control（NC，陰性對照）購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；sh?SIRT4，SIRT4 及Vector（陰性對照）以及內(nèi)參U6 引物由武漢博士德公司合成；TRIzol、總RNA 提取試劑盒、Lipofectamine2000 購自美國Invitrogen 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR 試劑盒購自美國Thermo 公司；RIPA 裂解液以及BCA 定量試劑盒購自美國Invitrogen 公司；抗SIRT4 單克隆抗體和抗GAPDH 多克隆抗體購于美國Abcam 公司；Tran?swell 小室購自美國Corning 公司；雙熒光素酶檢測試劑盒購自美國Promega 公司。

1.3 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)上述細胞，在37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。選取對數(shù)期生長的HGC?27 和MKN?28 細胞接種于6 孔板中，待細胞融合度為75%左右時利用Lipo2000 參照參照說明書進行轉(zhuǎn)染，包括miR?424?5p inhibitor或mimic 及其陰性對照，sh?SIRT4，SIRT4 及陰性對照。轉(zhuǎn)染后24 h 后于熒光顯微鏡下觀察細胞熒光，檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.4 RT?qPCR檢測胃癌組織及細胞中相關(guān)基因表達水平Trizol法提取組織或細胞的總RNA，-80 ℃冰箱保存。取1 μg RNA 按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成互補脫氧核糖核酸（cDNA），加入SYBR green染料（Qiagen）進行PCR擴增。實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（real?time RT?PCR）的條件為：95 ℃30 s，之后95 ℃5 s，60 ℃30 s，共40 個循環(huán)。采用2?ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)處理。具體引物如下：miR?424?5p 的上下游引物分別為：5'?GGCT?AGTCAGCAGCAATTCATGT?3'和5'?GTGCAGGGT?CCGAGGT?3'；SIRT4 的上下游引物分別為：5'?AT?GAAGATGAGCTTTGCGT?3'和5'?TCAGCATGGGT?CTATCAAAGG?3'；U6 的上下游引物分別為：5'?TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC?3'和5'?CCAGTG?CAGGGTCCGAGGT?3'；GAPDH 的上下游引物分別為：5'?AACTTTGGGATTGTGGAAGG?3'和5'?ACAC?ATTGGGGGTAGGAACA?3'。

1.5 Western Blot法檢測轉(zhuǎn)染后胃癌細胞中SIRT4蛋白的表達水平收集轉(zhuǎn)染后的胃癌細胞，加入提取緩沖液并收集其裂解液，提取總蛋白，應(yīng)用BCA 試劑盒測定蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度調(diào)節(jié)上樣量，10%濃度的SDS?PAGE 膠電泳后進行轉(zhuǎn)膜，按分子量大小剪下相應(yīng)大小的PVDF 膜在5%脫脂奶粉封閉液中行抗原封閉，加入SIRT4 一抗孵育（1∶2 000 稀釋），洗膜后孵育二抗，后進行顯影、定影。

1.6 劃痕愈合實驗轉(zhuǎn)染后，將MKN?28 和HGC?27細胞在6孔板中培養(yǎng)。當(dāng)細胞生長至70%～80%融合時，使用20 μL 移液管尖端進行劃痕。隨后，將分離的細胞用PBS 洗滌3 次，并將細胞在新鮮的RPMI?1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在設(shè)定的治療時間點（24 h 和48 h）下在光學(xué)顯微鏡下對劃痕愈合情況進行成像。通過ImageJ 軟件測量劃痕的寬度。

1.7 Transwell 侵襲實驗預(yù)先將matrigel 基質(zhì)膠鋪在Transwell 小室上室。轉(zhuǎn)染24 h 后，胰酶消化各組細胞并使用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度為2×104/L，取細胞懸液200 μL，加在Tran?swell 小室的上層，Transwell 小室下層加入500 μL含10%血清培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后取出小室，PBS 清洗后使用濕棉簽輕輕拭去上室中未侵襲的細胞，4%多聚甲醛固定20 min，PBS 清洗3 次后使用0.1%結(jié)晶紫染色15 min。PBS 清洗后隨機選取鏡下5 個視野，計數(shù)染色細胞。

1.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炄?shù)生長期的HGC?27 和MKN?28細胞接種到96 孔中 用60 ng的混合物共轉(zhuǎn)染平板螢火蟲熒光素酶報告基因，6 ng pRL?CMV Renilla 熒光素酶報告基因和miR?424?5p 模擬物或抑制劑。孵育48 h 后，螢火蟲和海腎熒光素酶用雙熒光素酶報告基因測量活性測定。具體操作按試劑盒說明書要求。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法所有實驗數(shù)據(jù)均用SPSS 22.0和GraphPad Prism 統(tǒng)計軟件進行分析。實驗均重復(fù)3 次，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組數(shù)據(jù)的比較采用LSD?t檢驗，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（one?way ANOVA），相關(guān)性分析采用使用Spearman 檢驗；計數(shù)資料采用n 表示，用卡方檢驗進行分析。P< 0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT?qPCR 檢測miR?424?5p 和SIRT4 mRNA在胃癌組織中的表達水平及相關(guān)性分析筆者前期通過TargetScan、miRDB 和starBase 三個在線數(shù)據(jù)庫進行預(yù)測分析取交集發(fā)現(xiàn)，SIRT4 可能是miR?424?5p 的一個潛在下游靶標(biāo)，見圖1A。進一步，筆者通過RT?qPCR 檢測胃癌及對應(yīng)癌旁組織中的miR?424?5p 和SIRT4 mRNA 的表達，結(jié)果顯示，與癌旁組織相比較，胃癌組織中miR?424?5p 的表達明顯升高（P< 0.000 1），見圖1B；而SIRT4 mRNA的表達明顯降低（P< 0.000 1），見圖1C。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中miR?424?5p 和SIRT4 mRNA的表達水平呈明顯負相關(guān)（r=-0.382，P=0.034），見圖1D。同時，筆者以miR?424?5p 在胃癌組織表達水平的中位值為臨界值，將57 例胃癌患者分為低表達和高表達兩組，分析其表達水平與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，miR?424?5p 高表達與腫瘤的浸潤深度、TNM 分期、脈管侵犯和神經(jīng)侵犯顯著相關(guān)（均P< 0.05），而與患者的性別、年齡、腫瘤位置、組織病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)前CEA 水平均無關(guān)（均P>0.05），見表1。

2.2 RT?qPCR 檢測轉(zhuǎn)染后胃癌細胞中miR?424?5p 的表達水平RT?qPCR 結(jié)果顯示，miR?424?5p在胃癌細胞中的表達水平顯著高于胃正常黏膜細胞GES?1（均P< 0.05），其中在胃癌細胞MKN?28中的表達水平最高，而在HGC?27 中的表達水平最低，因此，選擇MKN?28 和HGC?27 細胞系作為后續(xù)的研究對象，見圖2A。轉(zhuǎn)染72 h 后RT?qPCR 檢測各組細胞中miR?424?5p 的表達水平，結(jié)果顯示，與miR?NC 組相比，miR?424?5p mimic 組表達水平顯著升高（P< 0.001）；而與inhibitor NC 組相比，miR?424?5p inhibitor 組表達水平顯著降低（P< 0.01），見圖2B。

2.3 劃痕愈合實驗和Transwell侵襲實驗檢測miR?424?5p 對胃癌細胞遷移和侵襲能力的影響劃痕愈合實驗和Transwell 侵襲實驗結(jié)果顯示，與inhibi?tor NC 組相比，miR?424?5p inhibitor 組MKN?28 細胞的劃痕愈合率和穿透微孔膜的細胞數(shù)則均顯著降低（均P< 0.01）；而與miR?NC 組相比，miR?424?5p mimic 組HGC?27 細胞的的劃痕愈合率和穿透微孔膜的細胞數(shù)則均顯著升高（均P< 0.01），見圖3A和3B。

2.4 雙熒光素酶實驗驗證SIRT4 作為miR?424?5p 靶基因的可能性經(jīng)點突變構(gòu)建SIRT4 突變型（SIRT4?mutant，Mut）的pcDNA/EGFP 熒光報告載體，見圖4A。在MKN?28 細胞中共轉(zhuǎn)染miR?424?5p inhibitor+pcDNA/EGFP?WT SIRT4 3'?UTR、inhib?itor?NC+pcDNA/EGFP?WT SIRT4 3'?UTR，熒光素酶報告實驗結(jié)果表明，與對照組相比，miR?424?5p inhibitor 組SIRT4 3'UTR 的熒光素酶活性明顯升高（P< 0.01），而共轉(zhuǎn)染miR?424?5p inhibitor+pcDNA/EGFP?Mut SIRT4 3'?UTR、inhibitor?NC+pcDNA/EGFP? Mut SIRT4 3'?UTR，兩組的的熒光素酶活性差異不明顯，見圖4B；而在HGC?27 細胞中共轉(zhuǎn)染miR?424?5p mimic+pcDNA/EGFP?WT SIRT4 3'?UTR、miR?NC+pcDNA/EGFP?WT SIRT4 3'?UTR，熒光素酶報告實驗結(jié)果表明，與對照組相比，miR?424?5p mimic 組SIRT4 3'UTR 的熒光素酶活性明顯降低（P< 0.01），而共轉(zhuǎn)染miR?424?5p mimic+pcD?NA/EGFP?Mut SIRT4 3'?UTR、inhibitor?NC+pcDNA/EGFP?Mut SIRT4 3'?UTR，兩組的的熒光素酶活性差異不明顯，見圖4C。

表1 胃癌組織中miR?424?5p 表達水平與患者臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Association of miR?424?5p expression in gastric tissues with clinicopathologic factors of gastric cancer patients

2.5 RT?qPCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染miR?424?5p后胃癌細胞中SIRT4 mRNA 和蛋白的表達水平結(jié)果顯示，在MKN?28 細胞中轉(zhuǎn)染miR?424?5p in?hibitor 后，SIRT4 mRNA 和蛋白的表達水平較inhib?itor NC 組明顯升高（P<0.01），見圖5A 和5B；而在HGC?27 細胞中轉(zhuǎn)染miR?424?5p mimic 后，SIRT4 mRNA 和蛋白的表達水平較miR?NC 組均明顯降低（P<0.01），見圖5C 和5D。

2.6 共轉(zhuǎn)染miR?424?5p 和SIRT4 對胃癌細胞遷移和侵襲能力的影響為了進一步驗證上述結(jié)果，我們在MKN?28 細胞共轉(zhuǎn)染miR?424?5p inhibi?tor、sh?SIRT4 及其對照組，在HGC?27 細胞共轉(zhuǎn)染miR?424?5p mimic、SIRT4 及其對照組。結(jié)果顯示，SIRT4 下調(diào)可顯著減弱miR?424?5p inhibitor 對MKN?28 細胞遷移和侵襲能力的抑制作用，見圖6A 和6C；同樣，SIRT4 上調(diào)可顯著減弱miR?424?5p mimic 對HGC?27 細胞遷移和侵襲能力的增強作用，見圖6B 和6D。

3 討論

MiRNAs 具有廣泛的基因調(diào)節(jié)功能，廣泛參與腫瘤細胞的多種生物學(xué)過程，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色［5-8］。新興證據(jù)證實，多條miRNAs 的表達失調(diào)與胃癌的惡性生物學(xué)表型密切相關(guān)［8，11-14］。miR?424?5p 作為新近發(fā)現(xiàn)的與惡性腫瘤密切相關(guān)miRNAs 分子，在多種惡性腫瘤中異常表達并發(fā)揮不同的生物學(xué)功能：WANG 等研究發(fā)現(xiàn)miR?424?5p 在食管鱗狀細胞癌組織和細胞系中均表達下調(diào)，其可通過靶向抑制SMAD7通路介導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial?mesenchymal transition，EMT）過程進而抑制腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［15］；WANG 等［16］發(fā)現(xiàn)在基底樣乳腺癌中miR?424?5p 通過靶向DCLK1 抑制乳腺癌細胞的增殖，遷移和侵襲，發(fā)揮抑癌功能；同樣，miR?424?5p 也被發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中低表達，其可通過抑制YAP1 的表達減弱肝癌細胞的增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，miR?424?5p 在胃癌組織中的表達水平較其癌旁組織明顯升高，且其高表達與腫瘤的浸潤深度、TNM 分期、脈管侵犯和神經(jīng)侵犯等不良臨床病理因素顯著相關(guān)（均P<0.05）；進一步的功能實驗發(fā)現(xiàn)，過表達miR?424?5p 能促進胃癌細胞遷移和侵襲能力，而抑制miR?424?5p 表達則呈現(xiàn)出相反的效果。本研究結(jié)果與既往研究相符：WEI 等［18］研究發(fā)現(xiàn)miR?424?5p 高表達可促進胃癌細胞的增殖；同時，ZHANG 等［19］也發(fā)現(xiàn)miR?424?5p 在胃癌中的上調(diào)表達可促進胃癌細胞的增殖和侵襲。上述結(jié)果表明，miR?424?5p 在惡性腫瘤中的作用具有癌種異質(zhì)性，與在食管癌、乳腺癌和肝癌中不同，miR?424?5p 在胃癌的發(fā)生和發(fā)展中可能發(fā)揮促癌作用。

圖1 miR?424?5p 和SIRT4 mRNA 在胃癌組織和癌旁組織中的表達水平及相關(guān)性分析Fig.1 Expression and correlation of miR?424?5p and SIRT4 mRNA in gastric and adjacent normal tissues

圖2 轉(zhuǎn)染后胃癌細胞中miR?424?5p 的表達水平Fig.2 The expression level of miR?424?5p in gastric cancer cells after transfection

圖3 劃痕愈合實驗和Transwell 侵襲實驗檢測miR?424?5p 對胃癌細胞遷移（A）和侵襲（B）能力的影響Fig.3 The effects of miR?424?5p on migration（A）and invasion（B）of gastric cancer cells by wound?healing assay and Transwell invasion assay

圖4 雙熒光素酶實驗驗證SIRT4 作為miR?424?5p 靶基因的可能性Fig.4 The possibility of SIRT4 as a miR?424?5p target gene validated by dual luciferase gene reporter assay

圖5 轉(zhuǎn)染miR?424?5p 對胃癌細胞SIRT4 mRNA 和蛋白表達水平的影響Fig.5 Effect of miR?424?5p transfection on the expression of SIRT4 mRNA and protein in gastric cancer cells

圖6 共轉(zhuǎn)染miR?424?5p 和SIRT4 對胃癌細胞遷移和侵襲能力的影響Fig.6 The effects of co?transfection of miR?424?5p and SIRT4 on the migration and invasion of gastric cancer cells

SIRT4 作為Sirtuin 家族中特征最不明顯的成員之一，被報道為一種的重要抑癌基因，目前已被證實在多種惡性腫瘤中表達下調(diào)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后密切有關(guān)［4］。目前，關(guān)于SIRT4 在胃癌中作用的研究較少：HUANG 等［20］研究發(fā)現(xiàn)SIRT4 在胃腺癌中的表達降低，且其低表達與多種不良臨床病理學(xué)因素顯著相關(guān)；SUN 等［21］通過一系列細胞功能實驗發(fā)現(xiàn)，SIRT4 可抑制EMT 進程進而抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力；HU等［22］則發(fā)現(xiàn)過表達SIRT4 通過抑制ERK 的磷酸化以及細胞周期相關(guān)蛋白cyclin D、cyclin E 的表達誘導(dǎo)胃癌細胞的G1 期停滯，從而抑制胃癌細胞的增殖。上述研究均表明，SIRT4 在胃癌中發(fā)揮抑癌作用，但未對其上游調(diào)控機制進行探究。在本研究中，筆者首先利用3 個在線軟件TargetScan，miRDB 和starBase 進行聯(lián)合預(yù)測，均提示SIRT4 可能作為miR?424?5p 的下游靶基因。進一步的雙熒光素酶實驗結(jié)果證實miR?424?5p 可與SIRT4 3'UTR 結(jié)合，從而有效減少脫靶效應(yīng)的可能性，證實SIRT4 是miR?424?5p 的下游靶基因。后續(xù)的一系列細胞實驗表明，敲低或過表達miR?424?5p 可引起SIRT4 mRNA 和蛋白的表達水平的顯著上調(diào)或下調(diào)，進一步證實了SIRT4 是miR?424?5p 的下游靶基因。上述結(jié)果表明，miR?424?5p 可通過結(jié)合到SIRT4 的3'UTR，促進SIRT4 mRNA 的降解，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控SIRT4 蛋白的表達，從而影響胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，miR?424?5p 可通過靶向抑制抑癌基因SIRT4 的表達促進腫瘤細胞的遷移和侵襲，從而參與胃癌的的發(fā)生、發(fā)展。miR?424?5p 作為一種致癌基因，可能成為胃癌治療的潛在新靶點。