王 碩，趙家輝，鄒一諾，高明山，李雁冰，黃大鵬，魏國(guó)生，李井春

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

目前，豬人工授精技術(shù)隨著國(guó)內(nèi)外養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展愈加完善，豬精液長(zhǎng)期保存技術(shù)的發(fā)展使得豬人工授精技術(shù)在養(yǎng)豬業(yè)中得到廣泛應(yīng)用[1]。生產(chǎn)實(shí)踐中主要以常溫液態(tài)保存為主，冷凍精液應(yīng)用相對(duì)較少[2]，但常溫保存精子易受活性氧族（ROS）氧化損傷，從而使精子活力、質(zhì)膜完整性及形態(tài)等受到影響[3]。因此，增強(qiáng)豬精子的抗氧化性已成為現(xiàn)今研究的熱點(diǎn)，在稀釋液中添加外源性抗氧化劑是最直接的方法。

枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide，LBP）是由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖等成分組成，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表示枸杞多糖具有抗氧化、防衰老、防止遺傳損傷等作用[4]。何濤等[5]研究表明，枸杞多糖能顯著提高豬精子冷凍后的精子活率、質(zhì)膜完整率、線(xiàn)粒體活性等。然而，在17℃保存環(huán)境下添加枸杞多糖對(duì)豬精液保存效果影響的研究鮮有報(bào)道。研究表明，負(fù)壓處理可提高精液的保存效果[6]。本實(shí)驗(yàn)在Modena 稀釋液中添加不同劑量的枸杞多糖，并采用17℃負(fù)壓處理，從溫度與低氧2 個(gè)途徑降低精子代謝速度，利用邁朗全自動(dòng)精子質(zhì)量檢測(cè)儀檢測(cè)精子質(zhì)量參數(shù)，分析枸杞多糖對(duì)17℃負(fù)壓環(huán)境下豬精子保存質(zhì)量的影響，為豬精液保存技術(shù)以及人工授精技術(shù)的發(fā)展提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 枸杞多糖購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司，Modena 稀釋液藥品組成均購(gòu)自西格瑪公司。Modena 稀釋液組成為每1 L 溶液中含青霉素 0.074 g、鏈霉素 0.05 g、葡萄糖 27.50 g、NaHCO31 g、檸檬酸 2.9 g、檸檬酸鈉 6.9 g、TRIS 5.65 g、EDTA-2Na 2.6 g、BSA 4 g（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)5 組，在Modena 基礎(chǔ)稀釋液中分別添加0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL 的枸杞多糖，共設(shè)4 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 豬精液采集 豬精液采自黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)豬場(chǎng)，采集3 頭健康無(wú)病長(zhǎng)白種公豬混合精液，精子活力在0.8以上的精液。采集后的精液置于保溫箱內(nèi)在1～2 h 內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，在運(yùn)輸過(guò)程中避免劇烈晃動(dòng)，以減少對(duì)豬精子的機(jī)械損傷。

1.4 豬精液的稀釋 精液運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室后，將原精液1 800 r/min 離心5 min，離心后去除上清液，采用精板計(jì)數(shù)法檢測(cè)離心后的濃縮精液的精子密度，用各組室溫的試劑稀釋液將離心后精子稀釋計(jì)算調(diào)整密度為1×108個(gè)/mL，精液離心后對(duì)精液稀釋過(guò)程要在15 min 內(nèi)完成，避免沉積而造成物理?yè)p傷，待用。

1.5 精液保存 將稀釋后的各組試管置于負(fù)壓保存瓶中，用帶有空氣流通開(kāi)關(guān)的活塞密封負(fù)壓保存瓶，將負(fù)壓保存瓶與真空泵機(jī)連接緊密，通過(guò)真空泵機(jī)將負(fù)壓保存瓶?jī)?nèi)氣壓調(diào)整負(fù)壓為0.04 MPa。負(fù)壓處理后將負(fù)壓保存瓶置于17℃恒溫箱中保存。每隔12 h 對(duì)各組試管中的精液進(jìn)行移液槍緩慢沖擊混勻。

1.6 精子質(zhì)量參數(shù)的檢測(cè) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，在保存的各時(shí)間點(diǎn)（1、2、3、4、5 d）定時(shí)取樣，各組取10 μL樣品分別需在37℃加熱板上復(fù)蘇2～3 min，通過(guò)邁朗全自動(dòng)精子分析儀等儀器檢測(cè)精子活率、活力、直線(xiàn)速度、路徑速度、鞭打頻率、畸形率等質(zhì)量參數(shù)，并記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。精子活率是指具有活動(dòng)能力的精子數(shù)占總精子數(shù)的百分率；活力是指精液中呈前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子所占的百分率；直線(xiàn)速度是指精子直線(xiàn)運(yùn)動(dòng)的平均速度；路徑速度是指精子沿其空間軌跡移動(dòng)的平均速度 ；鞭打頻率是指精子每秒中平均鞭打次數(shù)；畸形率是指具有畸形的精子數(shù)占總精子數(shù)的百分率。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 將各時(shí)間段的各試驗(yàn)組質(zhì)量參數(shù)數(shù)據(jù)利用Excel 進(jìn)行匯總初步處理，再利用 StatView 5.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)測(cè)定的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行方差分析和多重比較（模型Duncan′s），實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 枸杞多糖對(duì)精子活率的影響 由表1 可知，保存第3天時(shí)各實(shí)驗(yàn)組精子活率顯著高于0 mg/mL 組，1.5 mg/mL組顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組。第4 天時(shí)，0.5、1 mg/mL 組的精子活率與1.5、2 mg/mL 組差異不顯著，而1.5 mg/mL組顯著高于2 mg/mL 組。第5 天時(shí)，1.5 mg/mL 組的精子活率顯著高于其他試驗(yàn)組，1 mg/mL 組顯著高于0、0.5、2 mg/mL 組，而0.5 mg/mL 組與2 mg/mL 組之間差異不顯著。

2.2 枸杞多糖對(duì)精子活力的影響 由表2 可知，保存第3 天時(shí)，0.5、1、1.5 mg/mL 組精子活力顯著高于其他組，而1.5 mg/mL 組顯著高于0.5、1 mg/mL 組。保存第4天時(shí)，4 個(gè)實(shí)驗(yàn)組的精子活力顯著高于0 mg/mL 組，其中1.5 mg/mL 組顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組，其他實(shí)驗(yàn)組間差異不顯著。保存第5 天時(shí)，1.5 mg/mL 組的精子活力顯著 高 于0、0.5、2 mg/mL 組，而0.5、1、2 mg/mL 組之間差異不顯著，0 mg/mL 組與 0.5 mg/mL 組間差異不顯著，1 mg/mL 組與1.5 mg/mL 組間差異不顯著。

2.3 枸杞多糖對(duì)精子直線(xiàn)速度的影響 由表3 可知，添加枸杞多糖后保存3 d 時(shí)，1、1.5、2 mg/mL 組精子的直線(xiàn)速度顯著高于0、0.5 mg/mL 組，且0 mg/mL 組與0.5 mg/mL組間差異不顯著。保存第4 天時(shí)，1.5 mg/mL 組的精子直線(xiàn)速度顯著高于其他組，0.5 mg/mL 組顯著高于0 mg/mL 組，0、1、2 mg/mL 組之間差異不顯著。保存第5 天時(shí)，1.5 mg/mL 組的精子直線(xiàn)速度顯著高于0、2 mg/mL 組，而與0.5、1 組之間差異不顯著，0、0.5、1、2 mg/mL 組之間差異不顯著。

表1 枸杞多糖對(duì)精子活率的影響 %

表2 枸杞多糖對(duì)精子活力的影響 %

2.4 枸杞多糖對(duì)精子路徑速度的影響 由表4 可知，保存3 d 時(shí)，1.5 mg/mL 組精子路徑速度顯著優(yōu)于其他組，0.5、1、2 mg/mL 組之間差異不顯著，而0.5、1 mg/mL組顯著高于0 mg/mL 組。保存4～5 d 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組顯著高于0 mg/mL 組，0.5、1、2 mg/mL 組之間差異不顯著，但顯著低于1.5 mg/mL 組。

2.5 枸杞多糖對(duì)精子鞭打頻率的影響 由表5 可知，保存第2 天時(shí)，1.5 mg/mL 組與2 mg/mL 組之間精子鞭打頻率差異不顯著，但顯著高于其他3 組；保存在3～5 d時(shí)，1.5 mg/mL 組顯著高于其他組，且其他組間差異不顯著。由此可知，各組間隨著枸杞多糖添加量的增加精子鞭打頻率逐漸上升趨勢(shì)，但當(dāng)枸杞多糖濃度達(dá)到2 mg/mL 時(shí)精子鞭打頻率呈下降趨勢(shì)。

2.6 枸杞多糖對(duì)精子畸形率的影響 由表6 可知，保存第3 天時(shí)，1.5 mg/mL 組與2 mg/mL 組精子畸形率差異不顯著，且兩組顯著低于其他組，0.5 mg/mL 組與0、1 mg/mL 組差異均不顯著。保存第4 天時(shí)，1、1.5 mg/mL組顯著低于0、0.5、2 mg/mL 組，1.5 mg/mL 組顯著低于1 mg/mL 組。保存第5 天時(shí)，4 個(gè)實(shí)驗(yàn)組精子畸形率均顯著低于0 mg/mL 組，1.5 mg/mL 組顯著低于其他實(shí)驗(yàn)組。

表3 枸杞多糖對(duì)精子直線(xiàn)速度的影響 μm/s

表4 枸杞多糖對(duì)精子路徑速度的影響 μm/s

表5 枸杞多糖對(duì)精子鞭打頻率的影響 HZ

表6 枸杞多糖對(duì)精子畸形率的影響 %

3 討 論

在豬精液保存過(guò)程中，隨著保存時(shí)間延長(zhǎng)，產(chǎn)生的ROS 逐漸累加。研究表明在冷凍精子保存過(guò)程中產(chǎn)生過(guò)量的氧自由基會(huì)影響凍融后精子質(zhì)量[7-8]。本實(shí)驗(yàn)在稀釋液中添加一定量枸杞多糖，目的在于提高精液的抗氧化能力，減弱由豬精子和細(xì)菌代謝所產(chǎn)生的ROS 對(duì)豬精子的損傷。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)采用負(fù)壓處理，模擬睪丸負(fù)壓低氧的環(huán)境，從而抑制精子的代謝速度、減弱精子的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、減緩有害物質(zhì)的產(chǎn)生以及抑制一些病原微生物的滋生，進(jìn)而提高精液的保存質(zhì)量。

豬精子的活率和運(yùn)動(dòng)性能參數(shù)與豬精子結(jié)構(gòu)和功能的完整性存在密切的相關(guān)性，依據(jù)該參數(shù)可以對(duì)精子潛在的授精能力作出預(yù)測(cè)[9]。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，各實(shí)驗(yàn)組的精子活率顯著高于對(duì)照組，其中1.5 mg/mL 組精子活率顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組。李文燁[10]研究也表明，在豬精液中添加6%～8%的枸杞多糖可有效提高凍后精子活率。精子活力是保證精子到達(dá)受精部位的重要條件[11]，同時(shí)精子路徑與直線(xiàn)速度可間接反映精子活力以及精子保存效果，而直線(xiàn)運(yùn)動(dòng)的精子才屬于有效精子更具有代表性。本研究中，1.5 mg/mL 組在精子活力、直線(xiàn)速度和路徑速度都優(yōu)于其他組。Hipler 等[12]研究表明，精細(xì)胞比體細(xì)胞更易被ROS 損傷，主要原因是精細(xì)胞膜含有豐富的不飽和脂肪酸，細(xì)胞膜較容易被氧化。研究表明，枸杞多糖在體外溶液中可直接清除羥自由基，同時(shí)能夠抑制自發(fā)或由羥自由基引起的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，并且可以提高超氧化物歧化酶（SOD）活性進(jìn)而清除過(guò)量的自由基，減弱ROS 對(duì)精子細(xì)胞膜的氧化損傷，從而提高豬精子活力以及運(yùn)動(dòng)性，這與馬愛(ài)團(tuán)等[13]研究中通過(guò)枸杞多糖抗氧化性來(lái)保護(hù)倉(cāng)鼠生精細(xì)胞結(jié)論一致。

精子進(jìn)入生殖道內(nèi)后運(yùn)動(dòng)方式發(fā)生很大的變化，而精子的鞭打頻率也可以間接反映精子的超激活以及精子保存效果。本研究中，從第3 天開(kāi)始1.5 mg/mL 組豬精子鞭打頻率顯著優(yōu)于其他組?；温蕦?duì)精子運(yùn)動(dòng)性也存在一定的影響，畸形率影響精子的受精能力[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，1.5 mg/mL 組精子畸形率顯著低于其他組，精子畸形率影響精子運(yùn)動(dòng)性能體現(xiàn)在精子尾部畸形上。精子運(yùn)動(dòng)功能是由線(xiàn)粒體提供能量。線(xiàn)粒體功能的衰弱直接影響精子的運(yùn)動(dòng)性能，精子細(xì)胞膜由于氧化損傷導(dǎo)致精子線(xiàn)粒體等細(xì)胞器機(jī)能表達(dá)受到影響[15]。易康樂(lè)等[16]研究表明，精子活率與質(zhì)膜完整性呈顯著正相關(guān)，精子平均游動(dòng)速度與質(zhì)膜完整性無(wú)明顯相關(guān)性。而本研究各組間整體表現(xiàn)出精子活率越高運(yùn)動(dòng)參數(shù)越高的趨勢(shì)，說(shuō)明添加枸杞多糖可有效提高精子的質(zhì)膜完整性，提高精子的運(yùn)動(dòng)性能以及降低精子的畸形率等。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)采用負(fù)壓處理可有效降低精液含氧量，進(jìn)一步減緩精子和細(xì)菌代謝產(chǎn)生的ROS，從而提高精液配方的抗氧化性，延長(zhǎng)精液的保存時(shí)間以及提高精液質(zhì)量。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)中采用17℃負(fù)壓保存處理，可在提升精液品質(zhì)和精子受精能力的前提下，通過(guò)低溫和低氧2 個(gè)技術(shù)措施弱化精子的代謝強(qiáng)度，使豬精子處于可逆轉(zhuǎn)的半休眠狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，添加一定量的枸杞多糖在17℃負(fù)壓環(huán)境下可顯著提高豬精子的活率、活力等和降低精子畸形率，其中1.5 mg/mL 組各項(xiàng)參數(shù)顯著優(yōu)于其他組，添加1.5 mg/mL 的枸杞多糖最有利于豬精子保存。