李姣清，賴美辰，翁茁先,2，鐘 鳴，李威娜，劉春燕，劉夢(mèng)林，唐 玲，陳燕珊，吳文超，黃勛和*

（1.廣東省山區(qū)特色農(nóng)業(yè)資源保護(hù)與精準(zhǔn)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省五華三黃雞科技創(chuàng)新中心，嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東梅州 514015；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128；3.梅州市水木雨有機(jī)農(nóng)業(yè)專業(yè)合作社，廣東梅州 514000）

育雛是整個(gè)養(yǎng)雞生產(chǎn)中影響生產(chǎn)效益最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。在當(dāng)前集約化養(yǎng)殖條件下，仔雞在育雛階段容易出現(xiàn)以炎癥、消化功能紊亂、外來(lái)病原菌感染、微生物菌群失調(diào)和腹瀉為主的育雛雞應(yīng)激綜合征。如何防治育雛雞應(yīng)激綜合征是現(xiàn)代養(yǎng)雞業(yè)亟待解決的問(wèn)題。飼料中添加抗生素可以促進(jìn)禽類生長(zhǎng)，提高仔雞存活率，但抗生素具有藥物殘留和抗藥性以及對(duì)環(huán)境的污染等危害，限制了其應(yīng)用[1-4]。因此，抗生素的替代品成為研究重點(diǎn)。中草藥是天然綠色植物，兼有營(yíng)養(yǎng)和藥用兩種屬性，不易產(chǎn)生抗藥性，無(wú)藥殘，且具有健脾理氣、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育、提高飼料利用率等功能[5-7]。目前有關(guān)中草藥添加劑在養(yǎng)雞業(yè)中的研究主要集中在免疫調(diào)節(jié)功能方面，而在雛雞腸道發(fā)育及菌群多樣性建立方面的研究較少。本研究根據(jù)中獸醫(yī)學(xué)辯證施治的理論，依據(jù)平補(bǔ)消導(dǎo)、健脾理氣的組方原則組配方劑，探討中藥復(fù)方制劑對(duì)育雛階段的三黃雞生長(zhǎng)發(fā)育、腸道黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)、腸道菌群的影響，分析其促生長(zhǎng)機(jī)理，為生產(chǎn)無(wú)抗生素高品質(zhì)雞飼料以及無(wú)抗生素殘留的雞肉產(chǎn)品、保護(hù)生態(tài)環(huán)境平衡提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 健康的1 日齡五華三黃雞由廣東客家黃畜牧有限公司提供。氟哌酸購(gòu)于上海新城牧業(yè)科技有限公司。

中藥復(fù)方制劑主要原料為生地、熟地、玄參、淫羊藿、黃芪、板藍(lán)根、大蒜、生姜、馬齒莧、蒼術(shù)、苦參、山楂、麥芽等，購(gòu)于梅州市中醫(yī)院醫(yī)院。加10 倍中藥材重量的蒸餾水浸泡30 min，加熱至沸騰后文火保持30 min，用6 層紗布過(guò)濾，藥渣再加8倍量蒸餾水，加熱至沸騰文火保持30 min，6 層紗布過(guò)濾，合并2 次濾液，濾液經(jīng)80℃恒溫水浴濃縮至原生藥量1 g/ mL，115℃高壓滅菌20 min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和飼養(yǎng)管理 選取1 日齡健康、體重相近的五華三黃雞母雛雞120 只，隨機(jī)分成3 組，每組4 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10 只。對(duì)照組喂食基礎(chǔ)日糧，抗生素組飼料中按氟哌酸使用說(shuō)明添加0.4%，中藥復(fù)方制劑組按1 g/kg 體重將中藥復(fù)方湯劑添加到半天的飲水中[8]。仔雞從第1 天開始在飼料中分別連續(xù)添加抗生素和中藥復(fù)方制劑，試驗(yàn)期42 d。飼養(yǎng)方式為舍內(nèi)籠養(yǎng)，自由采食和飲水?；A(chǔ)日糧組成參照我國(guó)肉雞標(biāo)準(zhǔn)（2004）[9]配置，日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 生長(zhǎng)性能 準(zhǔn)確記錄每天喂料量和剩余量，分別對(duì)1、21、42 日齡的試驗(yàn)雛雞早晨進(jìn)行空腹稱重并統(tǒng)計(jì)飼料消耗，計(jì)算各重復(fù)的平均日采增重量、平均日采食量、耗料增重比。

平均日采增重量=全期增重（g）/天數(shù)（d）

平均日采食量=全期采食量（g）/天數(shù)（d）

耗料增重比=飼料消耗/增重

1.3.2 腸道形態(tài)結(jié)構(gòu) 于試驗(yàn)第42 天，從各試驗(yàn)組每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)選取5 只體重接近均值的試驗(yàn)雞進(jìn)行屠宰試驗(yàn)。解剖后分離腸道，取盲腸內(nèi)容物迅速放置液氮中并保存于-80℃冰箱中備用，另取空腸中段腸組織1 cm左右，用生理鹽水沖洗干凈后放入固定液中固定，經(jīng)HE 染色，對(duì)絨毛高度和隱窩深度等黏膜形態(tài)學(xué)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 腸道微生物多樣性 將雞盲腸內(nèi)容物樣品（100±10）mg，用Omega D4015 糞便DNA 提取試劑盒購(gòu)于上海生物工程有限公司，按操作手冊(cè)要求提取總DNA，將DNA 樣品送至廣州基迪奧生物科技有限公司完成測(cè)序工作。采用Illumina Miseq 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)肉雞盲腸微生物16S rRNA 基因的V3-V4 區(qū)進(jìn)行測(cè)序，獲得的序列通過(guò)Mothur 軟件平臺(tái)，剔除低質(zhì)量的DNA序列之后，計(jì)算序列之間的距離。每一個(gè)運(yùn)算分類單元OTU 代表序列相似度大于97% 的DNA 序列，用于試驗(yàn)各處理組的樣品進(jìn)行菌群多樣性分析和聚類分析，并使用Sliva 和RPD 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所有OTUs 的代表性序列進(jìn)行物種匹配，對(duì)樣品的各個(gè)細(xì)菌屬組成進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得到菌群分析結(jié)果。通過(guò)QIIME 軟件計(jì)算Alpha 多樣性指數(shù)Chao1、ACE、Shannon 來(lái)反映微生物物種的豐度度信息。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 通過(guò)Excel 整理數(shù)據(jù)后，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并采用Duncan′s 法對(duì)各組平均值進(jìn)行多重比較。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 日糧中添加中藥復(fù)方制劑對(duì)雛雞生長(zhǎng)性能的影響 與對(duì)照組相比，中藥復(fù)方制劑組顯著提高了雛雞的平均日采食量和平均日增量，顯著降低了雛雞生長(zhǎng)期的耗料增重比，試驗(yàn)期間雞體重增重較對(duì)照組提高了21.3%（表2）。與抗生素添加組相比，中藥復(fù)方制劑組雛雞平均日增量和日采食量均顯著增加，但耗料增重比差異不顯著。

2.2 日糧中添加中藥復(fù)方制劑對(duì)雛雞空腸黏膜結(jié)構(gòu)的影響 中藥復(fù)方制劑組的空腸絨毛高度、黏膜層厚度和絨毛高度/隱窩深度顯著高于其他處理組（表3）。中藥復(fù)方制劑組的隱窩深度較對(duì)照組顯著降低，但抗生素組的隱窩深度較中藥復(fù)方制劑組顯著增加，且黏膜層厚度明顯變薄?？股亟M的絨毛高度顯著大于對(duì)照組。中藥復(fù)方制劑組空腸絨毛高度較抗生素處理顯著增加。

雛雞飼料中添加中藥復(fù)方制劑后，空腸的絨毛排列緊密且整齊，數(shù)量明顯增多（圖1）。

2.3 日糧中添加中藥復(fù)方制劑對(duì)雛雞盲腸微生物群落的影響

2.3.1 日糧中添加中藥復(fù)方制劑對(duì)雛雞腸道菌群的影響通過(guò)Alpha 多樣性指數(shù)分析，各樣品中有效序列覆蓋度指數(shù)大于0.99，說(shuō)明該測(cè)序結(jié)果基本已覆蓋樣本的多樣性（表4）。通過(guò)Uparse 軟件計(jì)算97% 相似水平上各樣品的OUT 數(shù)量，中藥復(fù)方制劑組中OUT 數(shù)量最多，數(shù)量達(dá)590，顯著高于對(duì)照組。Alpha 多樣性分析也顯示，中藥復(fù)方制劑組的ACE 指數(shù)、Shannon 指數(shù)均顯著高于對(duì)照組和抗生素組，表明中藥復(fù)方制劑組雛雞盲腸微生物物種的豐富度和多樣性更高。

對(duì)照組、抗生素組、中藥復(fù)方制劑組特有的OTU數(shù)目分別是44、47、80 個(gè)，共有的OUT 數(shù)目為453 個(gè)，中藥復(fù)方制劑組微生物物種多樣性高于對(duì)照組（圖2）。

2.3.2 日糧中添加中藥復(fù)方制劑對(duì)雛雞腸道菌群在屬水平結(jié)構(gòu)上的分析 對(duì)雛雞盲腸菌群中豐度最高的13 個(gè)屬進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)（圖3），球菌屬（Torques_group）、擬桿菌屬（Bacteroidales）、糞桿菌屬（Faecalibacterium）、腸桿菌屬（Enterobacter）豐度最高，豐度值均高于10%；中藥復(fù)方制劑添加處理的雛雞盲腸微生物中Torques_group、糞桿菌屬（Faecalibacterium）、乳桿菌屬（Lactobacillales）、瘤胃球菌屬（Ruminococcaceae_UCG-005；Ruminococcaceae_UCG-014）的豐度值顯著高于對(duì)照組和抗生素組，而腸桿菌屬（Enterobacter）、擬桿菌屬（Bacteroidales）、放線菌屬（Actinomycetes）的豐度值較對(duì)照組相比下降顯著。

2.4 日糧中添加中藥復(fù)方制劑對(duì)雛雞盲腸主要優(yōu)勢(shì)菌群的分析 通過(guò)LEFse 分析各處理組間具有顯著差異的物種豐度，LDA 評(píng)分直方圖顯示各組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的生物標(biāo)志（Biomarker），柱形圖的長(zhǎng)度代表LDA 評(píng)分。由圖4 可知，對(duì)照組、抗生素組、中草藥復(fù)方制劑組間豐度顯著差異微生物類群（LDA Score 2.0），中藥復(fù)方制劑組中豐度優(yōu)勢(shì)的菌群較對(duì)照組和抗生素組種類明顯增多，其中含有具有豐度優(yōu)勢(shì)的菌群Teroidesthet_aiotaomicron、Lactobacillus_salivariushe、Bacillaceae等腸道有益菌。

表2 日糧中添加中藥復(fù)方制劑對(duì)雛雞生長(zhǎng)性能的影響

表3 日糧中添加中藥復(fù)方制劑對(duì)雛雞空腸黏膜結(jié)構(gòu)的影響

圖1 雛雞空腸絨毛形態(tài)（40×）

表4 日糧中添加中藥復(fù)方制劑對(duì)雛雞腸道菌群的影響

圖2 OTU venn chart 圖

圖3 屬水平上的物種堆疊圖

3 討 論

圖4 各組中主要的優(yōu)勢(shì)微生物菌群

3.1 日糧添加中藥復(fù)方制劑對(duì)育雛期仔雞生長(zhǎng)性能的影響 日糧中添加中藥可以提高動(dòng)物食欲、增加動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)、促進(jìn)機(jī)體的消化吸收、提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能[10-11]。祝國(guó)強(qiáng)等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在艾維茵肉仔雞詞料中添加當(dāng)歸、黃柏等16 味中藥顯著提高了雞的平均日增重，降低了耗料增重比。錫建中等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在肉雞飼料中添加黃芪、當(dāng)歸、大蒜、紫蘇、小茴香、肉桂、牛膝能顯著提高AA 肉雞的采食量并降低耗料增重比。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，日糧中添加中藥復(fù)方制劑可顯著提高雞的日增重，降低耗料增重比?！毒霸廊珪分性疲骸吧蒲a(bǔ)陽(yáng)者，必于陰中求陽(yáng)，則陽(yáng)得陰助而生化無(wú)窮”。本試驗(yàn)中遂在復(fù)方中添加生地、熟地、玄參等中藥補(bǔ)氣升陽(yáng)，調(diào)補(bǔ)脾胃，以達(dá)于陰求陽(yáng)之功效，同時(shí)中藥成分板藍(lán)根、馬齒莧、苦參、玄參具清熱解毒和抗菌，黃芪、蒼術(shù)行氣健脾，可在雛雞母源抗體逐漸消失的育雛階段保護(hù)機(jī)體免受外界疾病感染，使機(jī)體能集中將更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)用于雛雞生長(zhǎng)。另外，雛雞在舍內(nèi)籠養(yǎng)條件下極為貪吃，易造成胃內(nèi)積食，消化不良。本試驗(yàn)中馬齒莧、山楂等經(jīng)過(guò)科學(xué)組合可以改善雛雞的消化機(jī)能，增強(qiáng)食欲，使新陳代謝加快，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)吸收，從而促進(jìn)其生長(zhǎng)。

3.2 日糧中添加中藥復(fù)方制劑對(duì)育雛期仔雞腸道黏膜結(jié)構(gòu)形態(tài)的影響 小腸尤其是空腸段作為動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)成分吸收的主要場(chǎng)所，在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。小腸絨毛作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要部位，其高度的變化直接影響機(jī)體消化、吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力。Caspay 等[14]報(bào)道，絨毛高度增加使小腸接觸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的面積增大，增強(qiáng)小腸對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。隱窩細(xì)胞與絨毛上皮細(xì)胞的更新密切相關(guān)，其深度反映了隱窩細(xì)胞的增殖率和成熟度，隱窩變淺則分泌功能增強(qiáng)，絨毛上皮細(xì)胞再生能力強(qiáng)，有利于維持腸道強(qiáng)的吸收功能。絨毛高度/隱窩深度綜合反映小腸的功能狀況，其數(shù)值增大表明小腸消化、吸收功能增強(qiáng)[15-16]。本研究結(jié)果顯示，中藥復(fù)方制劑組雛雞空腸的絨毛高度顯著高于對(duì)照組和抗生素組，絨毛高度/隱窩深度也顯著增加，空腸結(jié)構(gòu)明顯優(yōu)于對(duì)照組和抗生素處理組。本研究中的中藥復(fù)方制劑對(duì)小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)有積極影響，可有效地改善腸道健康和功能，促進(jìn)雛雞的生長(zhǎng)。

3.3 日糧中添加中藥復(fù)方制劑對(duì)雛雞盲腸微生物群落的影響 雛雞剛從蛋中孵化出來(lái)腸道是無(wú)菌狀態(tài)，隨著進(jìn)食，腸道群落迅速建立起來(lái)，腸道正常微生物群落相對(duì)穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)抵御外來(lái)病菌侵入、食物的消化和吸收有重要作用，是維持雛雞機(jī)體健康的必要條件[17]。本研究中中藥復(fù)方制劑組使雛雞腸道菌群多樣性指數(shù)ACE、Shannon 升高，多樣性顯著高于對(duì)照組。高多樣性的腸道菌群對(duì)宿主的健康有著非常重要的作用[18]。本研究通過(guò)OUT 聚類豐度和LEFse 分析，結(jié)果顯示中藥復(fù)方制劑組菌群的差異顯著大于對(duì)照組，尤其是乳桿菌的豐度比例大于1%，此菌是公認(rèn)的腸道益生菌；teroides_thetaiotaomicron能阻止外源病原微生物的定殖，維持腸道菌群平衡，同時(shí)放線菌、腸桿菌和擬桿菌的豐度比例與對(duì)照組比均有下降，表明中藥復(fù)方制劑可以改變雛雞腸道菌群的結(jié)構(gòu)和組成，有利于維持腸道微生態(tài)環(huán)境的健康和雞的健康生長(zhǎng)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在日糧中添加中藥復(fù)方制劑可顯著提高三黃雞的日增重和飼料利用率，還可以明顯改善腸道的健康狀況，飼喂效果有優(yōu)于抗生素添加劑的趨勢(shì)。