程 歡，趙 浩，吳建強，李 望，王軍起 (徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，江蘇 徐州 221000)

葉酸是人體內(nèi)主要的甲基基團供體，亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是葉酸代謝途徑的關(guān)鍵酶之一，其催化作用決定了DNA甲基化與DNA合成之間的平衡。MTHFR基因呈多態(tài)性，其中以位于催化區(qū)的677(C→T)轉(zhuǎn)換最為常見[1]，此種基因轉(zhuǎn)換通過破壞總基因DNA甲基化、DNA合成與修復(fù)障礙而發(fā)揮致癌作用[2]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)同源異型域轉(zhuǎn)錄因子在正常個體發(fā)育過程中發(fā)揮非常重要的作用，但一些同源異型域轉(zhuǎn)錄蛋白參與腫瘤的始動和轉(zhuǎn)移過程[3]，如X染色體生殖同源盒基因家族(reproductive homeobox on X-chromosome，Rhox)。研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化使Rhox家族種系特異性基因處于沉默狀態(tài)保證了正常的大鼠胚胎形成[4]。而人類的X染色體生殖同源盒基因F1(Rhox F1)在腫瘤細胞株中表達異常增高，而在正常組織如睪丸中該基因則處于不表達狀態(tài)[5]。因此，本研究分析在腎癌中MTHFR基因多態(tài)性對Rhox F1的甲基化狀態(tài)及其mRNA表達的影響，以期進一步闡明腎癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制。

1 資料與方法

1.1材料：收集2010年3月～2010年9月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科手術(shù)切除且均經(jīng)病理證實為透明細胞癌的新鮮腎癌組織38例，并取相應(yīng)的癌旁正常腎臟組織標本作為正常對照組，切除后立即置液氮凍存，所有患者術(shù)前均未接受過放化療,均有詳細的臨床資料和手術(shù)記錄，此項研究已通過徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會同意并取得受試對象的知情同意。

1.2方法

1.2.1Rhox F1基因的表達情況： 按總RNA提取試劑盒(Trizol)的操作說明分別提取不同來源組織的RNA。在提取的總RNA中取10 μg按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明以50 μl體系反轉(zhuǎn)錄成cDNA，實時PCR采用定量PCR中的相對定量法，以GAPDH作為內(nèi)參照，同時以外周正常組織為基準，癌區(qū)組織RNA的SFRP 1基因(x)表達量均表達成外周正常組織的N倍(即Nx)。用于PCR擴增的SFRP 1特異性引物序列為正向：5′-GTGCGGGTTTGGTTTAAGAA-3′，反向：5′-CCAGAAAAACCCATCTCCAA-3′；內(nèi)參照GAPDH引物序列為正向：5′-CCCTTCATTGACCTCAACTACATGG-3′，反向：5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3′。每次定量反應(yīng)后產(chǎn)物都經(jīng)30 g/L瓊脂糖電泳證明為所需擴增的片段。通常情況下，正常組織Nx位于0.3～3.0之間，Nx≥3.0為陽性表達，而<0.3為陰性表達。反應(yīng)條件94℃ 5 min，92℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)，每次反應(yīng)均設(shè)3復(fù)孔，CT值取其均值。Nx=2-△△Ct?！鳌鰿t=△Ct樣品-△Ct基準=(Ct樣品x﹣Ct樣品GAPDH)-(Ct基準x-Ct基準GAPDH)。內(nèi)參基因序列為TTTTAGGTGTGAAGAGGTGAGTTAGA。

1.2.2Rhox F1基因啟動子甲基化分析：符合后續(xù)實驗要求樣本DNA中取5～12 μl，按EZ DNA Methylation Gold Kit甲基化修飾試劑盒(美國ZYMO公司)說明書進行甲基化修飾，修飾完成并純化的DNA經(jīng)10 μl的M-Elution Buffer洗脫后立即進行分析。甲基化特異性PCR(MSP)引物序列正向：5′-GTGAAGTGGTTTTAGTGTTTATATT-3′，反向：5′-CTCAAAAACTACCCTCCACC-3′。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)，72 ℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物采用20 g/L瓊脂糖電泳，生物電泳圖像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.2.3MTHFR基因型檢測： 將MTHFR PCR擴增產(chǎn)物理想的樣品進行限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)技術(shù)分析。限制性核酸內(nèi)切酶Hinf Ⅰ特異識別GAGTC酶切位點，當677位點C→T顛換后，會產(chǎn)生1個Hinf Ⅰ酶切位點取PCR擴增產(chǎn)物，PCR反應(yīng)體系為25 μl，10×Buffer 2.5 μl，引物終濃度0.2 μmol/L，Taq DNA聚合酶1 U，模板2 μl。擴增條件為：95℃預(yù)變性5 min，然后進行35個循環(huán)(每個循環(huán)包括94℃ 1 min，60.5℃ 1 min，72℃ 1 min)，最后72 ℃延伸8 min。選用PCR擴增產(chǎn)物測序確定是MTHFR 677位基因陽性的腎癌標本作為陽性對照，以高壓雙蒸水代替DNA模板作為空白對照。PCR產(chǎn)物由上海基康生物技術(shù)公司純化并測序。每個酶切體系的體積為20 μl，上述反應(yīng)體系置于37 ℃水浴5～8 h酶切消化，取酶切產(chǎn)物5 μl，20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像圖像分析儀觀察結(jié)果。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理：采用SAS 6.12統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計處理。計數(shù)資料用率(%)表示，兩樣本率比較用χ2檢驗或Fisher確切概率法。通過方差檢驗比較腎癌組織TT、CT和CC基因型mRNA的表達，再通過Dunnett-t法進行兩兩比較。檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Rhox F1 mRNA的表達：正常組織中，14例Rhox F1基因mRNA陽性表達(36.8%)；腎癌組中34例Rhox F1基因mRNA陽性表達(89.5%)。兩組間Rhox F1的mRNA陽性表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=22.619；P<0.001)。Rhox F1 mRNA的表達情況見圖1。

2.2Rhox F1啟動子甲基化狀態(tài)分析：在正常組，30例Rhox F1啟動子甲基化呈陽性；在腎癌組僅有7例甲基化陽性，正常組織中Rhox F1啟動子CpG島甲基化率(78.9%)顯著高于腎癌組織(18.4%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=27.861，P<0.001)。見圖2。

注：Rhox F1為X染色體生殖同源盒基因F1；T為腎癌組織；N為正常組織

注：Rhox F1為X染色體生殖同源盒基因F1；M為甲基化；U為去甲基化

2.3腎癌中Rhox F1啟動子甲基化率與其mRNA表達的關(guān)系：34例表達Rhox F1 mRNA的癌組織中有30例發(fā)生去甲基化，發(fā)生率高達88.2%(30/34)，在4例Rhox F1 mRNA表達缺失的癌組織中1例發(fā)生去甲基化，發(fā)生率為25.0%(1/4)。Rhox F1 mRNA陽性患者的Rhox F1啟動子較Rhox F1 mRNA陰性患者去甲基化率高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.015)。表明Rhox F1 mRNA陽性表達患者，其啟動子更容易去甲基化。

2.4MTHFR 677(C→T)基因多態(tài)性：34例Rhox F1 mRNA 陽性表達的腎癌組織[MTHFR 677(C→T)]中TT基因型患者25例，CT基因型5例，CC基因型4例。TT、CT、CC基因Rhox F1 mRNA表達水平差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=80.201，P<0.001)，其中TT基因Rhox F1 mRNA表達水平(0.91±0.01)顯著高于CT基因型(0.33±0.03)和CC基因型(0.26±0.03)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.001)；CT與CC基因型組間Rhox F1 mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。TT基因型中有24例Rhox F1啟動子去甲基化(96.0%)，CT基因型有2例(40.0%)，CC基因型有1例(25.0%)。TT、CT、CC三組基因Rhox F1啟動子去甲基化率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，其中TT基因Rhox F1啟動子去甲基化率顯著高于CT基因型和CC基因型(P=0.009，P=0.004)。CT與CC基因型組間Rhox F1啟動子去甲基化率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.595)。

注：MTHFR為亞甲基四氫葉酸還原酶；CC、CT、TT為基因型

3 討論

腎癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生、發(fā)展涉及眾多原癌基因和抑癌基因的協(xié)同作用。近年來的研究結(jié)果顯示，DNA甲基化廣泛存在于各種惡性腫瘤，包括泌尿系統(tǒng)腫瘤[6]。在對大鼠的研究中，Rhox家族中超過30種功能性基因已被證實，其中大多數(shù)集中于Rhox 5[7]，最新研究表明異常的Rhox 5表達可干擾神經(jīng)生長因子-1受體基因Unc5c的轉(zhuǎn)錄[8]，而Unc5c在結(jié)腸癌的發(fā)病過程中扮演著抑癌基因的角色[9]。由于Rhox家族基因存在同源性，可見其他功能性基因可能存在著與Rhox 5相同或者相似的生物學(xué)致癌作用，其表達水平的調(diào)節(jié)機制顯得尤為重要。盡管如此，目前對主要存在于人類中的Rhox家族成員Rhox F1、Rhox F2和Rhox F2B的研究甚少，它們在人類癌癥中的表達水平及其甲基化是否參與調(diào)節(jié)機制尚不明了。本研究結(jié)果顯示，在腎透明細胞癌組織中Rhox F1 mRNA表達水平明顯高于正常組織，癌組織中Rhox F1啟動子去甲基化率明顯高于正常組織，二者關(guān)系分析提示Rhox F1 mRNA表達水平異常增高可能是腎透明細胞癌發(fā)生與進展的機制之一，而Rhox F1 mRNA高水平表達可能是通過其啟動子區(qū)域去甲基化來實現(xiàn)的。

在甲基化過程中，葉酸是主要的甲基基團供體，葉酸缺乏或代謝障礙與許多腫瘤的發(fā)病風(fēng)險增高相關(guān)[10]。而MTHFR C677T能夠不可逆地催化5,10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基四氫葉酸，它通過合成S-腺苷基甲硫氨酸(SAM)而參與多種甲基化過程，可使變異體酶對熱不穩(wěn)定且活性顯著降低，影響酶的活性，TT純合基因型的酶活性僅為CC野生型的30%[11]，而酶活性的降低改變了SAM水平，從而導(dǎo)致DNA去甲基化或低甲基化，增加了染色體的不穩(wěn)定性。目前已有研究發(fā)現(xiàn)葉酸攝入和MTHFR基因多態(tài)性與部分腫瘤相關(guān)基因甲基化紊亂有關(guān)。本研究結(jié)果顯示腎癌組織中攜帶677 TT的患者Rhox F1啟動子去甲基化率和mRNA表達明顯高于CT和CC基因型，可能機制為MTHFR 677 TT基因型個體中MTHFR的酶活性較其他兩種基因型低，減少了同型半胱氨酸向甲硫氨酸的轉(zhuǎn)變，使SAM水平異常下降，導(dǎo)致了Rhox F1啟動子區(qū)域去甲基化，異常激活Rhox F1過量表達，干擾抑癌基因的轉(zhuǎn)錄，打破了某些原癌基因與抑癌基因的平衡關(guān)系，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

腎癌的發(fā)生及發(fā)展是一個多階段的復(fù)雜病變過程，位點特異的DNA甲基化調(diào)控基因的表達極其重要[12]。由于去甲基化異常激活及表達，影響了某些抑癌基因的轉(zhuǎn)錄合成，直接導(dǎo)致腎癌的發(fā)生；而葉酸代謝酶MTHFR 677 TT多態(tài)性可影響Rhox F1啟動子的甲基化和核酸的穩(wěn)定性，從而間接參與腫瘤的形成[13]。但由于樣本數(shù)量有限，本研究未能進一步探究其余兩種Rhox基因與MTHFR多態(tài)性的關(guān)系，但從這次實驗中可看出一定趨勢，即MTHFR多態(tài)性通過影響部分Rhox基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)而調(diào)控其表達。因此，大樣本的實驗有待開展，進一步驗證本研究結(jié)果，深入了解腎癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，可為個體化的臨床輔助診斷、病程監(jiān)控和治療提供新的理論參考依據(jù)。