方 軍，沈彥鵬，張雷雷，李騰騰，邵艷卿*

(1.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所、浙江省近岸水域生物資源開(kāi)發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院海洋貝類工程技術(shù)研究中心，浙江 溫州 325005； 2.溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江 溫州 325016)

青蛤(Cyclinasinensis) 俗稱環(huán)文蛤，隸屬雙殼綱、簾蛤目、簾蛤科，是我國(guó)一種重要養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)貝類。隨著青蛤養(yǎng)殖方式多樣化、養(yǎng)殖技術(shù)不斷成熟，越來(lái)越多育種群體及家系被培育出來(lái)，為了避免由于常年人工養(yǎng)殖導(dǎo)致遺傳結(jié)構(gòu)單一，同時(shí)也為保護(hù)青蛤自然種群不被人工多代繁育的養(yǎng)殖群體所污染，需要通過(guò)有效的分子手段評(píng)價(jià)種質(zhì)資源和遺傳多樣性。然而有關(guān)青蛤微衛(wèi)星標(biāo)記十分有限，僅見(jiàn)董志國(guó)等(2011)通過(guò)磁珠富集法從基因組中開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記的報(bào)道[1]。目前迫切需要開(kāi)發(fā)具有共顯性遺傳、多態(tài)性豐富、易于規(guī)?；瘷z測(cè)、檢測(cè)成本低等優(yōu)勢(shì)的分子標(biāo)記，以開(kāi)展青蛤種群遺傳多樣性分析、遺傳育種等研究。

在眾多水生生物分子標(biāo)記中，微衛(wèi)星標(biāo)記又稱簡(jiǎn)單序列重復(fù)(Simple Sequence Repeat, SSR)，由1～6個(gè)核苷酸串聯(lián)重復(fù)片段構(gòu)成，與其他分子標(biāo)記相比，具有共顯性遺傳、高度多態(tài)雜合且穩(wěn)定性好、易操作、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于系譜分析、遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性研究等多項(xiàng)領(lǐng)域。李煉星(2017)通過(guò)對(duì)選育的縊蟶(Sinonovaculaconstricta)后代進(jìn)行微衛(wèi)星分析[2]，結(jié)果表明連續(xù)6代在親本間有近親關(guān)系或者親本數(shù)量有限情況下，人工選育縊蟶苗種遺傳多樣性顯示明顯降低。連續(xù)累代群體選育工作使得縊蟶選育系的遺傳特性純化，可為后續(xù)選育工作中通過(guò)不同種群、家系間雜交或者增加親本數(shù)量來(lái)提高遺傳多樣性和生長(zhǎng)性狀、耐病性、適應(yīng)環(huán)境變化等目標(biāo)性狀；韓學(xué)凱等(2015)利用509個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記構(gòu)建了三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)覆蓋19個(gè)連鎖群[3]，1 940.3 cM(cM為厘摩爾根)的遺傳連鎖圖譜，為三角帆蚌分子標(biāo)記輔助育種打下基礎(chǔ)。可見(jiàn)微衛(wèi)星標(biāo)記在海洋貝類遺傳育種方面應(yīng)用之廣泛。

因此，本研究在通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得生物學(xué)數(shù)據(jù)信息基礎(chǔ)上，拼接組裝獲得大量含SSR的EST(Expressed Sequence Tag)序列，并研究這些EST-SSR在青蛤EST中的分布特征，設(shè)計(jì)并合成部分引物，對(duì)浙江靈昆青蛤群體進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析，以期為青蛤種質(zhì)資源保護(hù)、遺傳多樣性評(píng)價(jià)等提供有力工具。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用青蛤60只，于2016年5月采自浙江省溫州靈昆，活體運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，解剖剪取閉殼肌及斧足，保存于-80℃冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 SSR序列的獲得及引物設(shè)計(jì) 根據(jù)青蛤cDNA文庫(kù)的IlluminaHiseq測(cè)序分析工作，利用MISA (Microsatellite Identification Tool)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行SSR檢測(cè)，找到SSR標(biāo)記后，使用Primer3軟件完成SSR引物設(shè)計(jì)，參數(shù)均設(shè)為默認(rèn)。隨機(jī)選取81條序列的引物送上海生工公司進(jìn)行合成。

1.2.2 DNA制備、PCR反應(yīng)及產(chǎn)物檢測(cè) 基因組DNA的提取參照海洋生物組織基因組DNA提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)的方法提取。

PCR反應(yīng)體系為20μL∶1 μL模板DNA (30 ng/μL)，0.1 μL Taq酶(5 U/μL)，2 μL 10×PCR buffer (Mg2+plus)，1.6 μL dNTP Mixture (2.5 mmol/μL )，0.4 μL正反引物對(duì)(10 μmol/L)，14.5 μL超純水。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min后，進(jìn)入30個(gè)PCR循環(huán)：94 ℃變性45 s，復(fù)性45 s，72 ℃延伸45 s；最后72 ℃下延伸7 min，并將反應(yīng)產(chǎn)物于4 ℃下保存。用1.5%瓊脂糖凝膠檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，鑒定有擴(kuò)增產(chǎn)物后再用8%非變性聚丙烯酰胺膠電泳檢測(cè)，EB銀染、Bio-Rad Universal Hood II拍照。

1.2.3 多態(tài)性檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析 根據(jù)電泳圖譜，參照引物設(shè)計(jì)時(shí)預(yù)期片段的大小統(tǒng)計(jì)條帶，采用POPGENE32軟件計(jì)算青蛤微衛(wèi)星引物的期望雜合度(Expected Heterozygosity，He)、觀察雜合度(Observed Heterozygosity，Ho)、有效等位基因數(shù)(Effective Number of Allele，Ne)和哈代-溫伯格平衡值(Hardy-Weinberg Equilibrium，WE)。應(yīng)用PIC-ALC軟件計(jì)算多態(tài)信息含量(Polymorphic Information Content，PIC)。

2 結(jié)果與討論

2.1 青蛤SSR分布特點(diǎn)

利用MISA將去冗余后得到115 441條Unigene序列進(jìn)行檢測(cè)得到SSR位點(diǎn)12 418個(gè)，主要為單核苷酸重復(fù)、三核苷酸重復(fù)和雙核苷酸重復(fù)。如圖1所示，單核苷酸重復(fù)數(shù)量最多，共有8 422個(gè)，占所有微衛(wèi)星位點(diǎn)的67.82%，在單核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星引物中，以A/T重復(fù)的引物最多，共有4 106個(gè)，占所有單核苷酸重復(fù)的48.75%，其次是三核苷酸重復(fù)，共有1 501個(gè)，占所有微衛(wèi)星位點(diǎn)的12.09%。而其中重復(fù)單元為(TTG/AAC)n的位點(diǎn)數(shù)量最多，共有171個(gè)，占三核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星總數(shù)的11.39%。雙核苷酸重復(fù)共有1 419個(gè)，占所有微衛(wèi)星位點(diǎn)的11.43%，其中AT/TA重復(fù)的位點(diǎn)最多，共有721個(gè)，占雙核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星的50.81%。另外還有部分四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復(fù)以及混合型重復(fù)共1 076個(gè)，占所有SSR位點(diǎn)的8.66%。

圖1 青蛤 EST-SSR重復(fù)類型及所占比例Fig.1 Distribution of microsatellite sequences in the tested clam

2.2 青蛤SSR多態(tài)性引物篩選

利用Primer3軟件，設(shè)計(jì)了81對(duì)SSR引物，以8個(gè)靈昆青蛤的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度上下波動(dòng)5 ℃左右為梯度，對(duì)81對(duì)EST-SSR引物進(jìn)行了初步篩選。研究發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增出穩(wěn)定的可重復(fù)條帶的引物為48對(duì)，占引物總數(shù)的59.26%；通過(guò)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合EB染色檢測(cè)，81對(duì)SSR引物中有27對(duì)表現(xiàn)出個(gè)體多態(tài)性，占引物總數(shù)的33.33%。多態(tài)性引物占有效引物的比例為56.25%。27對(duì)多態(tài)性引物中，11個(gè)雙核苷酸重復(fù)，4個(gè)三核苷酸重復(fù)，3個(gè)四核苷酸重復(fù)，2個(gè)五核苷酸重復(fù)，1個(gè)六核苷酸重復(fù)，5個(gè)混合型重復(fù)。27對(duì)引物序列等詳細(xì)信息如表1所示。

表1 青蛤27對(duì)微衛(wèi)星引物序列及其參數(shù)Tab.1 Primer sequences and parameters of the 27 SSRs for C.sinensis

續(xù)表1

2.3 靈昆青蛤群體遺傳變異分析

用篩選出的27對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)30只靈昆青蛤群體進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，圖2為引物CS83在青蛤中的擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果。

圖2 引物CS83在青蛤30個(gè)個(gè)體中的擴(kuò)增Fig.2 PCR results of EST-SSR primer CS83 amplified in 30 labelled clams 從左到右依次是M：50 bp DNA ladder marker，M1：DNA marker DL2000，1～30號(hào)個(gè)體樣品。

30個(gè)靈昆青蛤群體中，用27對(duì)引物擴(kuò)增共獲得99個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生等位基因數(shù)Na為2～6個(gè)，平均每個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生3.67個(gè)，其中CS78位點(diǎn)的等位基因數(shù)量最多(6個(gè))；有效等位基因數(shù)Ne為1.03～4.89，所有位點(diǎn)大小在116～330 bp之間。青蛤靈昆群體的各遺傳參數(shù)見(jiàn)表2，觀測(cè)雜合度Ho為0.000 0～0.678 6，其中Ho￣值最高的是引物CS80，最低的是引物CS96。期望雜合度He為0.033 0～0.808 5，其中He值最高的是引物CS61，最低的是引物CS71。經(jīng)過(guò)軟件分析，各位點(diǎn)遺傳多態(tài)信息含量PIC在0.032 3～ 0.764 5之間，最高的是引物CS83，最低的是引物CS71。除了CS71、CS78、CS80、CS85、CS90、CS91、CS94、CS104這8對(duì)引物之外其余均顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(p<0.01)。

2.4 討論

目前，微衛(wèi)星標(biāo)記開(kāi)發(fā)主要基于基因組文庫(kù)和轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星標(biāo)記EST-SSR和基因組來(lái)源的微衛(wèi)星標(biāo)記相比，具有種間通用性好，基因功能相關(guān)，開(kāi)發(fā)成本低且周期短等優(yōu)點(diǎn)[4]。在雙殼綱貝類中，已成功開(kāi)發(fā)利用的微衛(wèi)星標(biāo)記有李云峰等(2010)通過(guò)對(duì)蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)外套膜和腎臟組織構(gòu)建cDNA文庫(kù)進(jìn)行的多態(tài)性EST-SSR篩選[5]；李紅蕾等(2003)使用RepeatMasker軟件在櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)的6 935條ESTs中發(fā)現(xiàn)了42條微衛(wèi)星序列，并在設(shè)計(jì)的7對(duì)引物中發(fā)現(xiàn)有6對(duì)能夠產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物[6]；史松富等(2013)利用3 000條泥蚶(Tegillarcagranosa)單拷貝序列設(shè)計(jì)50條引物，得到24個(gè)多態(tài)性SSR位點(diǎn)等[7]。

表2 青蛤群體中各微衛(wèi)星位點(diǎn)分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.2 Statistical results of microsatellite loci in the tested clams

2.4.1 青蛤微衛(wèi)星分布 本研究通過(guò)對(duì)浙江靈昆青蛤進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在青蛤轉(zhuǎn)錄組序列中單核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星數(shù)量遠(yuǎn)高于其他類型，其中A重復(fù)與T重復(fù)總量占所有微衛(wèi)星數(shù)量的65.19%，這與王忠良等(2015)使用MISA軟件對(duì)馬氏珠母貝(Pinctadamartensi)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析得到的EST-SSR主要特征相吻合[8]。在多核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星中，三核苷酸重復(fù)(12.09%)略高于雙核苷酸重復(fù)(11.43%)；而四核苷酸(2.29%)、五核苷酸(0.16%)、六核苷酸重復(fù)(0.03%)三者都較雙核苷酸重復(fù)要少；此外還觀測(cè)到部分混合型重復(fù)微衛(wèi)星(6.18%)。這種三核苷酸重復(fù)出現(xiàn)頻率較高的分布特征與泥蚶[9]以及三角帆蚌[10]類似。另外，在所有類型的微衛(wèi)星中，A/T出現(xiàn)的頻率均高于C/G，這種分布特征同樣出現(xiàn)于紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)[11]，三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)[12]等海洋動(dòng)物的報(bào)道中，倪守勝等(2018)認(rèn)為微衛(wèi)星A/T含量高的原因可能是微衛(wèi)星序列A/T含量高，則退火溫度Tm值降低，DNA鏈容易解開(kāi)，通過(guò)DNA重組機(jī)制和復(fù)制滑動(dòng)機(jī)制，產(chǎn)生富含AT重復(fù)類型的機(jī)率更高[13]。也有研究表明海洋生物在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下DNA中的GC兩個(gè)核苷酸胞嘧啶C被選擇性添加甲基，甲基化的胞嘧啶C很容易經(jīng)過(guò)脫氨基作用突變成胸腺嘧啶T，在DNA復(fù)制及轉(zhuǎn)錄過(guò)程中使得G/C突變A/T，而少量的GC又是維持DNA熱力學(xué)穩(wěn)定性所必需，因此微衛(wèi)星序列中G/C含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如A/T[14]。

2.4.2 微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性 經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增以及聚丙烯酰胺凝膠電泳，自81對(duì)引物中篩選出27對(duì)多態(tài)性引物，多態(tài)性引物占33.33%。觀測(cè)雜合度Ho為0.000 0～0.678 6，期望雜合度He為0.033 0～0.808 5，平均觀測(cè)雜合度為0.292 9；平均期望雜合度為0.585 0。其中大部分位點(diǎn)的觀測(cè)雜合度低于期望雜合度，CS71觀測(cè)雜合度等于期望雜合度，只有CS80觀測(cè)雜合度高于期望雜合度。產(chǎn)生這個(gè)結(jié)果的可能原因之一是養(yǎng)殖群體經(jīng)過(guò)多代人工繁育和近親繁殖使得雜合度顯著低于野生種群，這種情況普遍出現(xiàn)在養(yǎng)殖貝類群體中，如皺紋盤鮑(Haliotisdiscus)[15]、厚殼貽貝(Mytiluscoruscus)[16]等。另一個(gè)可能導(dǎo)致觀測(cè)雜合度低于期望雜合度的原因是未擴(kuò)增的PCR無(wú)效等位基因的存在，因?yàn)槲磾U(kuò)增的雜合子被作為純合子計(jì)算，導(dǎo)致該位點(diǎn)觀測(cè)到的雜合度低于實(shí)際情況[17]，這同時(shí)也可能是本實(shí)驗(yàn)中多數(shù)位點(diǎn)顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(p<0.01)的原因。另外，牛東紅等(2010)認(rèn)為微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性越高，等位基因數(shù)越多，則所需的樣本量也越大，當(dāng)樣本量>30時(shí)，雜合度趨于穩(wěn)定[18]；而魯翠云等(2008)通過(guò)對(duì)鏡鯉(Cyprinuscarpio)養(yǎng)殖群體樣本量和微衛(wèi)星標(biāo)記多態(tài)性水平之間的相關(guān)性分析認(rèn)為當(dāng)樣本量>40時(shí)，雜合度變動(dòng)范圍變小，并出現(xiàn)平臺(tái)現(xiàn)象，得到當(dāng)使用微衛(wèi)星進(jìn)行群體遺傳評(píng)估時(shí)，最適樣本量為40～50個(gè)的結(jié)論[19]。本實(shí)驗(yàn)中所有的微衛(wèi)星位點(diǎn)選取的樣本數(shù)均為30，為牛東紅等人認(rèn)為的最小樣本量，小于魯翠云等人認(rèn)為的最適樣本量，故而多數(shù)位點(diǎn)顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(p<0.01)也可能是由于樣本量不足所導(dǎo)致。

遺傳多態(tài)信息含量PIC指的是一個(gè)親本為雜合子，另一親本為不同基因型的概率，是一個(gè)多態(tài)性遺傳標(biāo)記可提供信息量的度量。在本實(shí)驗(yàn)中，遺傳多態(tài)信息含量PIC為0.032 3～ 0.764 5之間，平均遺傳多態(tài)信息含量為0.515 9。Bostein等(1980)提出，當(dāng)PIC>0.50時(shí)，該位點(diǎn)屬于高度多態(tài)位點(diǎn)；當(dāng)0.25

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用青蛤的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，識(shí)別出大量微衛(wèi)星位點(diǎn)，并成功篩選出27個(gè)青蛤多態(tài)性EST-SSR標(biāo)記，其中19個(gè)為高度多態(tài)性位點(diǎn)。這些微衛(wèi)星多態(tài)性位點(diǎn)的獲得，為進(jìn)一步開(kāi)展青蛤種質(zhì)資源評(píng)估、群體遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建等提供了新的有效分子標(biāo)記。