謝繼安, 劉柏林, 趙紫微, 張 磊, 楊大進(jìn), 趙云峰

(1. 安徽省疾病預(yù)防控制中心, 安徽 合肥 230601; 2. 國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心, 北京 100050)

交鏈孢霉(alternaria)是一類廣泛分布于農(nóng)作物和土壤中的腐植菌,能引起水果、蔬菜和糧食的腐敗,代謝產(chǎn)生交鏈孢霉毒素(alternaria toxins)[1],其中細(xì)交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid, TeA)和騰毒素(tentoxin, TEN)最為常見(jiàn),結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。TeA和TEN主要存在于谷物、番茄、柑橘、櫻桃等農(nóng)作物和水果中,對(duì)小麥的污染非常普遍,檢出率高,檢出量大,世界各地均有報(bào)道[2,3]。2016年歐洲食品安全局(EFSA)開(kāi)展了歐洲人群的交鏈孢霉毒素膳食暴露研究[3],顯示嬰幼兒為TeA和TEN膳食暴露的主要人群,TeA暴露來(lái)源主要為谷基嬰幼兒食品和番茄及其制品,TEN則為番茄等果實(shí)蔬菜類食品。2016～2018年國(guó)家食品污染物監(jiān)測(cè)顯示小麥及其制品中TeA和TEN的污染嚴(yán)重,檢出率超過(guò)90% , TeA最大檢出值超過(guò) 2 000 μg/kg, TEN最大檢出值超過(guò)200 μg/kg。

圖 1 TeA和TEN的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structural formulas of tenuazonic acid (TeA) and tentoxin (TEN)

我國(guó)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》[4]未規(guī)定食品中交鏈孢霉毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)。鑒于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在分析測(cè)試領(lǐng)域中有著重要作用[5],為提高食品中交鏈孢霉毒素的質(zhì)控水平,為交鏈孢霉毒素膳食暴露評(píng)估提供可靠資料,科研人員有必要開(kāi)展食品中交鏈孢霉毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究工作。

本研究以天然受交鏈孢霉毒素污染的小麥籽粒為原料,按小麥粉衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[6]制備成小麥粉,以該小麥粉為基體載體、TeA和TEN為目標(biāo)物,按《一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》[7]要求進(jìn)行均勻性和穩(wěn)定性檢驗(yàn),同位素稀釋-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè),多個(gè)實(shí)驗(yàn)室合作定值,依據(jù)《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》[8]進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UPLC超高效液相色譜儀、Xevo TQ質(zhì)譜儀、UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)、HLB固相萃取柱(200 mg/6 mL)(美國(guó)Waters公司), VORTEX Multi Reax高速旋渦混勻器(德國(guó)Heidolph公司), XS204電子天平(瑞士Mettler Toledo公司), GX-271固相萃取儀(美國(guó)Gilson公司), Legend Mach 1.6R高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher公司), Milli-Q超凈水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司), EFAA-DC24防腐型氮吹濃縮儀(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)。

TeA(C10H15NO3, CAS號(hào):610-88-8)、TEN(C22H30N4O4, CAS號(hào):28540-82-1)(英國(guó)政府化學(xué)家實(shí)驗(yàn)室(LGC)),13C2-TeA(13C2C8H15NO3,德國(guó)Sigma Aldrich公司), D3-TEN(C22H27D3N4O4,加拿大Toronto Research Chemicals公司),乙腈和甲醇(色譜純,德國(guó)Merck公司),碳酸氫銨(色譜純,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別取適量TeA標(biāo)準(zhǔn)溶液和TEN標(biāo)準(zhǔn)溶液至容量瓶中,用甲醇稀釋成TeA和TEN質(zhì)量濃度分別為2.0 μg/mL 和0.4 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。于-20 ℃避光保存。分別取適量13C2-TeA標(biāo)準(zhǔn)溶液和D3-TEN標(biāo)準(zhǔn)溶液至容量瓶中,用甲醇稀釋成13C2-TeA和D3-TEN質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL 和0.2 μg/mL 的混合同位素內(nèi)標(biāo)溶液,于-20 ℃避光保存。

1.3 樣品提取與凈化

準(zhǔn)確稱取5.0 g樣品,加入200 μL混合同位素內(nèi)標(biāo)溶液并浸泡過(guò)夜,加入25 mL提取溶液(乙腈-甲醇-0.05 mol/L 磷酸二氫鈉溶液(pH 3.0)(45∶10∶45, v/v/v)),高速旋渦混勻15 min,以 10 000 r/min 離心10 min,取5.0 mL上清液,加入15 mL 0.05 mol/L 磷酸二氫鈉溶液(pH 3.0),稀釋后全部通過(guò)HLB固相萃取柱凈化,凈化液于45 ℃水浴氮?dú)獯抵两?用2.0 mL 10%甲醇水溶液復(fù)溶,以 12 000 r/min 離心10 min,上清液供LC-MS/MS分析。

1.4 儀器條件

色譜條件:色譜柱為Waters HSS T3柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm),流動(dòng)相以(A)1.0 mmol/L 碳酸氫銨溶液為水相,甲醇為(B)有機(jī)相,流速為0.2 mL/min。線性梯度洗脫:0～2.0 min, 5%B; 2.0～3.0 min, 5%B～75%B; 3.0～4.0 min, 75%B～90%B; 4.0～6.0 min, 90%B; 6.0～7.0min, 90%B～5%B; 7.0～9.0 min, 5%B。進(jìn)樣量為10 μL。

質(zhì)譜條件:電噴霧電離(ESI)源,負(fù)離子模式,離子源溫度為150 ℃,毛細(xì)管電壓為-2.4 kV,脫溶劑溫度為500 ℃,脫溶劑氣流量為800 L/h,碰撞氣流量為0.15 mL/min,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式定量檢測(cè)。TeA、13C2-TeA、TEN和D3-TEN的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表 1 TeA、13C2-TeA、TEN和D3-TEN的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of the TeA,13C2-TeA,TEN and D3-TEN

* Quantitative ion.

圖 2 小麥粉中TeA和TEN標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的生產(chǎn)制備工藝流程圖Fig. 2 Flow chart for preparation and certification of TeA and TEN in wheat flour

1.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備

通過(guò)對(duì)全國(guó)小麥主產(chǎn)區(qū)代表性樣品的篩查,選取天然污染高濃度TeA及TEN的小麥籽粒樣品和天然污染低濃度TeA及TEN小麥籽粒樣品作為候選物,經(jīng)一定比例混合后,按小麥粉衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[6]中普通粉要求進(jìn)行磨粉和過(guò)篩(CQ 20號(hào)篩)加工,再在干粉混料機(jī)中混勻6 h,制備成高、低2個(gè)濃度水平的小麥粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物?；靹蚝蟮臉悠酚娩X箔袋分裝,抽真空熱封的方法封袋,每包裝袋約50 g。使用電子加速器輻照法對(duì)裝袋樣品進(jìn)行輻照滅菌,輻照劑量為10 kGy,滅菌后的樣品在室溫(25 ℃)條件下避光保存于的密封桶中,確保其穩(wěn)定性。

1.6 質(zhì)量控制

在對(duì)小麥粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物分析的同時(shí),以空白試驗(yàn)考察系統(tǒng)分析背景,以確保不存在本底干擾。各組分的空白樣品加標(biāo)回收率控制在100%±5%以內(nèi),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)控制在5%以內(nèi)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物制備工藝流程

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備工藝流程圖見(jiàn)圖2。根據(jù)《一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》[7]要求對(duì)全國(guó)各小麥主產(chǎn)區(qū)代表性樣品進(jìn)行篩查,選取山西省某縣的天然污染高濃度TeA及TEN的小麥籽粒樣品和安徽省某縣天然污染低濃度TeA及TEN的小麥籽粒樣品作為候選物,滿足小麥籽粒樣品在不同氣候條件下天然污染TeA和TEN的典型樣品要求。天然污染TeA及TEN的小麥籽粒經(jīng)粉碎、篩粉、混勻、分裝、滅菌等制備工序,研制成小麥粉中細(xì)交鏈孢菌酮酸和騰毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值方法的優(yōu)化

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值測(cè)量方法的準(zhǔn)確性決定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的準(zhǔn)確性,一般采用國(guó)際物質(zhì)量委員會(huì)(CCQM)認(rèn)定的基準(zhǔn)方法,針對(duì)食品中污染物類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),一般采用同位素稀釋質(zhì)譜法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值的測(cè)量[9]。同位素稀釋質(zhì)譜法采用穩(wěn)定性同位素標(biāo)記的目標(biāo)物為內(nèi)標(biāo),該標(biāo)記物與目標(biāo)物具有相同分子結(jié)構(gòu),理化性質(zhì)與目標(biāo)物基本一致,可以抵消檢測(cè)過(guò)程中各種基質(zhì)效應(yīng)和系統(tǒng)誤差,是公認(rèn)的一種測(cè)量微量污染物的基準(zhǔn)方法[10,11]。基于上述要求,本研究建立了測(cè)定小麥粉中細(xì)交鏈孢菌酮酸和騰毒素的同位素稀釋-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,并對(duì)提取溶劑、提取時(shí)間、固相萃取柱、液相色譜條件和質(zhì)譜條件、基質(zhì)效應(yīng)、定量線性范圍、檢出限和定量限、加標(biāo)回收等多方面進(jìn)行了方法學(xué)優(yōu)化和確認(rèn)[12-14]。

2.2.1 提取溶劑和提取時(shí)間

由于TeA和TEN的油水分配系數(shù)(logP)分別為0.65和1.46[15], TeA具有較強(qiáng)的水溶性,且易電離,而TEN兼具水溶性和脂溶性。經(jīng)過(guò)優(yōu)化,選擇酸性緩沖鹽和有機(jī)溶劑的混合提取液。酸性緩沖鹽溶液能抑制TeA的電離,不僅能提高TeA的提取效率,還能使TeA在HLB固相萃取柱上得到很好保留,有利于樣品的凈化?；旌咸崛∫褐幸欢ū壤囊译婧图状疾粌H能提高TEN的提取效率,還具有一定沉淀蛋白質(zhì)的作用,減少了樣品提取液中可溶性植物蛋白等雜質(zhì)的含量。

樣品提取時(shí)間直接影響TeA和TEN的提取效率,實(shí)驗(yàn)使用高含量樣品(TeA約200 μg/kg 和TEN約40 μg/kg)進(jìn)行提取時(shí)間篩選,測(cè)定了高速旋渦混勻(振幅3 mm,振度 2 000 r/min)提取5、10、15和20 min時(shí)的提取效率(見(jiàn)圖3)。當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到15 min及更長(zhǎng)時(shí),樣品中TeA和TEN的檢測(cè)值達(dá)到最大并相對(duì)穩(wěn)定。因此選用高速旋渦混勻提取15 min,以確保將樣品中TeA和TEN完全提取出來(lái)。

圖 3 提取時(shí)間對(duì)小麥粉中TeA和TEN含量的影響Fig. 3 Effect of extraction time on the contents of TeA and TEN in wheat flour

2.2.2 固相萃取柱凈化

HLB固相萃取柱含有親水親脂平衡反相吸附劑,是目前國(guó)內(nèi)外廣泛使用的樣品前處理固相萃取柱。本研究利用HLB固相萃取柱中親水性的N-乙烯吡咯烷酮保留TeA,親水性的N-乙烯基吡咯烷酮和親脂性的二乙烯基苯聚合物共同保留TEN,能實(shí)現(xiàn)完全保留TeA和TEN。實(shí)驗(yàn)選取HLB固相萃取柱規(guī)格分別為60 mg/3 mL、150 mg/6 mL、200 mg/6 mL和500 mg/6 mL進(jìn)行空白樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)(加標(biāo)量為TeA 250 μg/kg、TEN 50 μg/kg)。如圖4所示，當(dāng)HLB填料≥200 mg時(shí),空白樣品加標(biāo)回收率達(dá)到最大并趨于穩(wěn)定,因此選用HLB(200 mg/6 mL)對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化。

圖 4 HLB柱規(guī)格對(duì)小麥粉中TeA(250 μg/kg)和 TEN(50 μg/kg)回收率的影響 Fig. 4 Effect of HLB column specifications on the recoveries of TeA (250 μg/kg)and TEN (50 μg/kg) in wheat flour

樣品提取液凈化時(shí),需要考察樣品提取液中有機(jī)溶劑含量對(duì)HLB固相萃取柱凈化能力的影響(見(jiàn)圖5,樣品提取液中TeA和TEN分別為250 ng和50 ng)。結(jié)果表明,當(dāng)樣品提取液中有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)超過(guò)20%時(shí),則HLB固相萃取柱的流出液中能檢出TeA和TEN,顯示HLB固相萃取柱已無(wú)法保留樣品提取液中全部的TeA和TEN,因此需要將樣品提取液進(jìn)行適當(dāng)稀釋,使有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)降至20%以下才能使用HLB固相萃取柱凈化。

圖 5 樣品溶液中有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)HLB固相萃取柱凈化能力的影響Fig. 5 Effect of volume fractions of organic solvent in sample solution on the purification capacity of HLB SPE column

2.2.3 液相色譜條件

本研究采用ESI-模式分析TeA和TEN,當(dāng)流動(dòng)相的水相為堿性溶液時(shí),TeA和TEN的質(zhì)譜響應(yīng)值更高。色譜分析時(shí),水相溶液堿度會(huì)影響TeA出峰時(shí)間和峰形。實(shí)驗(yàn)顯示,當(dāng)碳酸氫銨溶液濃度為1.0 mmol/L 時(shí),TeA和TEN有較好的保留時(shí)間和較窄的色譜峰。有機(jī)相使用甲醇時(shí),TeA和TEN的靈敏度也顯著高于使用乙腈時(shí)。在MRM模式下,TeA和TEN及其同位素內(nèi)標(biāo)的色譜圖見(jiàn)圖6。

圖 6 MRM模式下TeA、13C2-TeA、TEN和D3-TEN的色譜圖Fig. 6 Chromatograms of TeA,13C2-TeA, TEN and D3-TEN in MRM mode

2.2.4 質(zhì)譜條件

對(duì)TeA和TEN及其同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行質(zhì)譜方法開(kāi)發(fā),優(yōu)化毛細(xì)管電壓、離子源溫度、脫溶劑氣溫度、脫溶劑氣流量、錐孔電壓和碰撞能量等參數(shù),得到TeA、TEN及同位素內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)信息(見(jiàn)表1)。TeA和TEN及其同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜裂解圖見(jiàn)圖7。

圖 7 TeA、13C2-TeA、TEN和D3-TEN的質(zhì)譜圖Fig. 7 Mass spectra of TeA,13C2-TeA, TEN and D3-TEN

2.2.5 樣品的基質(zhì)效應(yīng)

為了盡可能降低檢驗(yàn)方法的基質(zhì)效應(yīng),本研究著重對(duì)樣品提取溶液和固相萃取柱進(jìn)行考察。結(jié)果表明,采用酸性緩沖鹽和有機(jī)溶劑的混合提取液及HLB柱凈化,能去除小麥粉樣品中絕大部分的基質(zhì)干擾物,空白小麥粉基質(zhì)的TeA和TEN質(zhì)譜響應(yīng)和純?nèi)軇㏕eA和TEN的質(zhì)譜響應(yīng)差別不大。為完全消除小麥粉樣品基質(zhì)效應(yīng)的影響,在小麥粉樣品中加入13C2-TeA和D3-TEN混合同位素內(nèi)標(biāo)溶液并浸泡過(guò)夜,使得同位素內(nèi)標(biāo)參與小麥粉樣品前處理的全部過(guò)程,從而達(dá)到完全消除樣品基質(zhì)效應(yīng)的影響。通過(guò)空白基質(zhì)加標(biāo)回收試驗(yàn),基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法的加標(biāo)回收率和同位素內(nèi)標(biāo)稀釋法加標(biāo)回收率結(jié)果差別在±5.0%以內(nèi),且均在100%±5%控制范圍內(nèi)(見(jiàn)表2)。

表 2 采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法和同位素內(nèi)標(biāo)稀釋法時(shí)的檢測(cè)結(jié)果Table 2 Detected results when using matrix standard curve and isotope internal standard dilution methods

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性范圍

根據(jù)文獻(xiàn)[16]報(bào)道我國(guó)小麥粉中TeA(1.76～520 μg/kg)和TEN(2.72～129 μg/kg)的含量范圍,結(jié)合本研究小麥粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中TeA和TEN的含量水平,同時(shí)參考我國(guó)總膳食調(diào)查和水果中交鏈孢霉毒素的相關(guān)研究[16-20],制備了系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白小麥粉基質(zhì)加標(biāo)溶液,連續(xù)3 d重復(fù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,小麥粉中TeA含量在1.0～750 μg/kg 和TEN含量在0.2～150 μg/kg 時(shí)，TeA和TEN含量與其色譜峰面積呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.999,完全滿足我國(guó)小麥粉中TeA和TEN的定量分析要求和小麥粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中TeA和TEN的定值要求。

2.3.2 檢出限和定量

由于我國(guó)尚未制定小麥粉中TeA和TEN的限量標(biāo)準(zhǔn),考慮到所研制的小麥粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中TeA和TEN含量水平(TeA: 100 μg/kg 和200 μg/kg, TEN: 20 μg/kg 和40 μg/kg)和文獻(xiàn)[16]報(bào)道我國(guó)小麥粉中TeA和TEN的污染水平,需要建立一個(gè)準(zhǔn)確、靈敏、精密度高的檢測(cè)方法,用于小麥粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中TeA和TEN的定值和后續(xù)研究的暴露評(píng)估。參考相關(guān)研究[16-20]并結(jié)合本研究特性發(fā)現(xiàn),在ESI-模式下，TeA和TEN的靈敏度明顯高于ESI+模式,ESI-模式下脫氫活性更強(qiáng)的TEN離子化效率比TeA高,使得MRM模式下TEN的靈敏度高出TeA大約6～7倍。綜合考慮本研究?jī)x器檢測(cè)靈敏度和我國(guó)小麥粉中TeA和TEN的含量范圍,通過(guò)空白小麥粉基質(zhì)加標(biāo)方式,以定性離子通道中信噪比(S/N)為3時(shí)和10時(shí)樣品溶液中目標(biāo)化合物的濃度為檢出限和定量限,最終得到本研究檢測(cè)方法的檢出限為0.5 μg/kg(TeA)和0.1 μg/kg(TEN);定量限為1.5 μg/kg(TeA)和0.3 μg/kg(TEN)。

2.3.3 加標(biāo)回收試驗(yàn)

在陰性小麥粉樣品(不含TeA和TEN)中加入低、中、高3個(gè)水平的TeA和TEN,每個(gè)加標(biāo)樣品取6個(gè)平行樣。結(jié)果表明,TeA的加標(biāo)回收率為98.9% ～104.6% ,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5% ～3.8% ; TEN的加標(biāo)回收率為99.6% ～103.7% ,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4% ～3.1%(見(jiàn)表3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本方法準(zhǔn)確度和精密度良好。

表 3 陰性小麥粉樣品中TeA和TEN的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of the TeA and TEN in negative wheat flour samples (n=6)

2.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值方式和要求

本研究采用多個(gè)實(shí)驗(yàn)室合作定值的方式進(jìn)行小麥粉中TeA和TEN標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值工作。依據(jù)《一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》[7]要求,共制定了4條定值原則:(1)合作定值實(shí)驗(yàn)室均為國(guó)內(nèi)先進(jìn)水平的實(shí)驗(yàn)室,定值工作由技術(shù)熟練的專業(yè)人員操作,確保定值數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性;(2)使用統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、同位素內(nèi)標(biāo)溶液和固相萃取柱等關(guān)鍵耗材,確保定值結(jié)果的溯源性;(3)使用統(tǒng)一的定值方法,確保系統(tǒng)誤差的一致性;(4)各定值實(shí)驗(yàn)室的定值工作在不同的工作日內(nèi)進(jìn)行。

本次定值實(shí)驗(yàn)室選擇可代表我國(guó)食品檢測(cè)領(lǐng)域的權(quán)威實(shí)驗(yàn)室,且在各自領(lǐng)域內(nèi)具備國(guó)內(nèi)領(lǐng)先水平。其中,國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院擁有我國(guó)糧油質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和國(guó)家糧食局糧油質(zhì)量檢驗(yàn)測(cè)試中心,可代表我國(guó)糧油檢測(cè)領(lǐng)域的權(quán)威實(shí)驗(yàn)室;中國(guó)食品藥品檢定研究院是我國(guó)檢驗(yàn)食品藥品生物制品質(zhì)量的法定機(jī)構(gòu)和最高技術(shù)仲裁機(jī)構(gòu),可代表我國(guó)食品藥品檢測(cè)領(lǐng)域的權(quán)威檢測(cè)機(jī)構(gòu);北京出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心(現(xiàn)北京海關(guān)技術(shù)中心)可代表我國(guó)進(jìn)出口食品安全檢驗(yàn)檢疫方面的權(quán)威機(jī)構(gòu);山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院可代表我國(guó)省級(jí)食品藥品檢驗(yàn)領(lǐng)域的領(lǐng)先水平;上海市疾病預(yù)防控制中心、江蘇省疾病預(yù)防控制中心、浙江省疾病預(yù)防控制中心和山東省疾病預(yù)防控制中心是我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)的疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu),其實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力可代表我國(guó)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的領(lǐng)先水平。此外,定值實(shí)驗(yàn)室還需擁有國(guó)際主流品牌的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,為該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的必備條件,確保滿足定值方法規(guī)定的檢測(cè)靈敏度和精密度要求。由于無(wú)法獲得小麥粉中TeA和TEN的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),各定值實(shí)驗(yàn)在開(kāi)展定值工作前,需對(duì)本研究建立的定值方法的有效性進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證,包括對(duì)目標(biāo)物保留時(shí)間、定量定性離子豐度比和標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)因子的確認(rèn),以及對(duì)定量限、全程空白和回收率的控制等來(lái)確保定值方法的準(zhǔn)確、可靠。

在定值工作開(kāi)展前,為確保定值工作的規(guī)范性和可操作性,本研究組向各定值單位發(fā)放了定值邀請(qǐng)函、定值工作說(shuō)明和定值方法標(biāo)準(zhǔn)操作程序等材料,并明確了各定值單位加標(biāo)回收試驗(yàn)的加標(biāo)量、定值報(bào)告格式和定值結(jié)果報(bào)送時(shí)間(15個(gè)工作日內(nèi))等相關(guān)要求。在確認(rèn)各定值單位對(duì)定值工作無(wú)疑義后,向各定值單位發(fā)放小麥粉細(xì)交鏈孢菌酮酸和騰毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值樣品(高、低含量各2袋),每袋至少取樣6次,提供6個(gè)測(cè)定結(jié)果,4袋樣品至少提供24個(gè)定值數(shù)據(jù),同時(shí)提交空白小麥粉樣品的加標(biāo)回收試驗(yàn)數(shù)據(jù)。為確保定值的可溯源性與質(zhì)量控制,同時(shí)向各定值單位發(fā)放TeA和TEN標(biāo)準(zhǔn)溶液、同位素內(nèi)標(biāo)溶液、HLB固相萃取柱和空白小麥粉樣品等關(guān)鍵耗材。

表 4 小麥粉中TeA和TEN標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量定值及不確定度Table 4 Certified values and uncertainties of the TeA and TEN in wheat flour

uhb: homogeneity uncertainty;us: stability uncertainty;uchar: multi-laboratory characterizations uncertainty;ucal: standard curve measurement uncertainty;u: total uncertainty;k: coverage factor.

2.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值的溯源性

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)需要使用可溯源的基準(zhǔn)試劑進(jìn)行定值,以確保測(cè)量結(jié)果的溯源性[7]。實(shí)際工作中一般采用可溯源的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(CRM)進(jìn)行定值測(cè)量,當(dāng)可溯源的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)無(wú)法獲得時(shí),應(yīng)盡可能使用溯源性良好的純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(或標(biāo)準(zhǔn)溶液)。由于目前國(guó)內(nèi)外均無(wú)法獲得TeA和TEN的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),本定值工作所使用的TeA和TEN標(biāo)準(zhǔn)溶液均購(gòu)于英國(guó)政府化學(xué)家實(shí)驗(yàn)室,雖然該標(biāo)準(zhǔn)溶液不是有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),但該標(biāo)準(zhǔn)溶液證書具有完整的定值報(bào)告和明確的不確定度范圍,所使用的TeA純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度值為99.5%±0.5% , TEN純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度值為99.2%±0.8% ,其結(jié)構(gòu)和純度均通過(guò)核磁、高分辨質(zhì)譜等權(quán)威方法進(jìn)行確認(rèn),是目前國(guó)際上所能獲得的純度最高的TeA和TEN純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),具有良好的溯源性。另外,本研究所使用的13C2-TeA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購(gòu)于德國(guó)Sigma_Aldrich公司,D3-TEN標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購(gòu)于加拿大Toronto Research Chemicals公司,13C2-TeA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和D3-TEN標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也是目前所能獲得的唯一的同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),它們的結(jié)構(gòu)和純度也通過(guò)核磁、高分辨質(zhì)譜等權(quán)威方法進(jìn)行確認(rèn),同位素純度均大于99% ,化學(xué)純度大于98% ,使用前均通過(guò)高分辨質(zhì)譜確認(rèn)其雜質(zhì)不影響TeA和TEN的測(cè)定,完全滿足同位素內(nèi)標(biāo)稀釋法定值的相關(guān)要求。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度評(píng)定

依據(jù)《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》[8]的要求,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)總不確定度一般由3部分組成:(1)通過(guò)定值數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差、測(cè)量次數(shù)和確定的置信水平按統(tǒng)計(jì)方法得出;(2)對(duì)定值方法影響因素的分析,分項(xiàng)計(jì)算得出;(3)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性和有效期內(nèi)的變化所引起的誤差。應(yīng)用到本研究可細(xì)化成4個(gè)部分組成:(1)均勻性引入的不確定度(uhb),此項(xiàng)可分為袋間均勻性引入的不確定度和袋內(nèi)均勻性引入的不確定度;(2)穩(wěn)定性引入的不確定度(us),此項(xiàng)可分為短期穩(wěn)定性引入的不確定度和長(zhǎng)期穩(wěn)定性引入的不確定度;(3)多個(gè)實(shí)驗(yàn)室定值過(guò)程中引入的不確定度(uchar),此項(xiàng)可分為所有定值數(shù)據(jù)的不確定度和定值過(guò)程中的各種B類不確定度;(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的分析結(jié)果的不確定度(ucal)。小麥粉中細(xì)交鏈孢菌酮酸和騰毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量定值及不確定度見(jiàn)表4,各實(shí)驗(yàn)室定值數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在可接受范圍內(nèi),標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性和穩(wěn)定性良好。

3 結(jié)論

本研究采用天然污染TeA和TEN的小麥樣品基質(zhì),經(jīng)粉碎、篩粉、混勻、滅菌、分裝等制備工序,研制成均勻性和穩(wěn)定性良好的小麥粉中細(xì)交鏈孢菌酮酸和騰毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),采用固相萃取-同位素稀釋-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè),由國(guó)內(nèi)不同領(lǐng)域的10家權(quán)威實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值,是國(guó)內(nèi)外首例小麥粉中細(xì)交鏈孢菌酮酸和騰毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),具有目標(biāo)物濃度為自然條件下天然含量水平,均勻度好和定值不確定度小等優(yōu)點(diǎn)。本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)已獲批國(guó)家二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(標(biāo)準(zhǔn)號(hào):GBW(E)100547和GBW(E)100548),經(jīng)山東省農(nóng)科院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所和安徽省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心等單位試用,效果良好。本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的成功研制,為促進(jìn)國(guó)內(nèi)交鏈孢霉毒素檢測(cè)技術(shù)的提升提供技術(shù)支持,也為國(guó)內(nèi)食品中細(xì)交鏈孢菌酮酸和騰毒素的暴露監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性提供依據(jù)。