孟金柱，趙成剛，羅碧秀，趙園園

(1.銅仁學(xué)院，貴州 銅仁 554300； 2.遙山溝生態(tài)種養(yǎng)農(nóng)民專業(yè)合作社，貴州 銅仁 554300)

禽類的卵泡發(fā)育是一個(gè)連續(xù)性過程，且具有優(yōu)先性。根據(jù)卵泡直徑的大小及其功能，可以分為等級卵泡和等級前卵泡[1]。等級卵泡，也稱為排卵前卵泡，按照大小排列依次為F1、F2、F3、F4、F5…，最大直徑能達(dá)到40 mm[2]。等級前卵泡則又被分為小白卵泡(SWF,直徑為1～2 mm)、大白卵泡(LWF，直徑為3～5 mm)、小黃卵泡(SYF，直徑為6～8 mm)和大黃卵泡(LYF，直徑為9～12 mm)[3]。在這些等級前卵泡中，只有少部分卵泡可以被成功選擇進(jìn)入等級卵泡序列，而直徑范圍在6～8 mm的SYF又是卵泡在選擇過程中能否優(yōu)先進(jìn)入等級的轉(zhuǎn)折點(diǎn)[4]。

與哺乳動(dòng)物相比，禽類卵泡類固醇合成系統(tǒng)較為簡單，顆粒細(xì)胞的主要功能是分泌孕激素(P4)，而膜細(xì)胞則負(fù)責(zé)分泌雌激素和雄激素[5-6]。這與哺乳動(dòng)物卵泡顆粒細(xì)胞合成雌激素(E2)，膜細(xì)胞為顆粒細(xì)胞合成雌激素提供前體物質(zhì)(雄激素)有所不同[7]。顆粒細(xì)胞內(nèi)存在多種受體，在卵泡的生長發(fā)育過程中具有重要的作用。若生長、分化出現(xiàn)異常，會(huì)導(dǎo)致多囊卵巢綜合征、卵巢早衰等疾病[8]。

絲氨酸蛋白酶23(PRSS23)屬于絲氨酸蛋白酶(Serine protease)40個(gè)家族中的胰蛋白酶家族。通過MCF-7/BUS細(xì)胞轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn)，PRSS23mRNA的表達(dá)是通過雌激素誘導(dǎo)的[9]。DIAO等[10]研究表明，PRSS23對小鼠卵巢發(fā)育有負(fù)調(diào)控作用，可引起小鼠卵泡閉鎖。CHAN等[11]研究發(fā)現(xiàn)，PRSS23mRNA在小鼠卵泡的顆粒細(xì)胞和排卵前卵巢的間質(zhì)細(xì)胞、膜細(xì)胞以及閉鎖卵泡中表達(dá)量較高，進(jìn)一步肯定了PRSS23對小鼠卵泡的閉鎖起促進(jìn)作用。

目前，關(guān)于PRSS23在大型哺乳動(dòng)物及禽類卵泡中的功能及作用機(jī)制研究尚未見報(bào)道。筆者所在課題組前期擴(kuò)增了蛋雞卵泡PRSS23mRNA CDS全序列，分析了該序列的三級結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行信號肽預(yù)測[12]。為此，通過免疫組織化學(xué)技術(shù)對PRSS23在蛋雞卵泡中的表達(dá)進(jìn)行定位，采用熒光定量PCR技術(shù)對PRSS23mRNA在其卵泡顆粒細(xì)胞中的相對表達(dá)情況進(jìn)行分析，同時(shí)通過ELISA技術(shù)對卵泡液中的P4進(jìn)行測定，旨在探明PRSS23在蛋雞卵泡中的表達(dá)位置及其mRNA在不同大小卵泡中的表達(dá)與卵泡液P4含量的關(guān)系，為進(jìn)一步研究其在蛋雞卵泡中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

在遙山溝生態(tài)種養(yǎng)農(nóng)民專業(yè)合作社(貴州銅仁)，選取5只健康土母雞宰殺后，分別獲取卵巢并剪下直徑為3～5 mm的LWF和直徑為6～8 mm的SYF，用于免疫組織化學(xué)分析；分別剪下直徑為1～2、3～5、6～8、9～12 mm的卵泡，抽取卵泡液用于P4含量測定，剩余部分刮取顆粒細(xì)胞用于總RNA提取。

1.2 采用免疫組織化學(xué)技術(shù)對PRSS23進(jìn)行組織定位

剪下LWF和SYF，分別放入4%的多聚甲醛溶液中固定24 h后，用70%的乙醇溶液清洗。分別經(jīng)梯度乙醇(含量遞增)脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片(厚度為5 μm)、攤片、烤片后制成切片。將制成的切片放入60 ℃的恒溫箱中烘烤3 h，經(jīng)二甲苯透明、梯度乙醇(含量遞減)脫蠟后，滴加3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化酶，并滴加復(fù)合消化酶修復(fù)抗原；滴加5% 的牛血清白蛋白(BSA)常溫下靜置30 min后，試驗(yàn)組滴加兔抗PRSS23一抗(北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司，1∶1 000稀釋)，對照組滴加正常兔血清(北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司)，4 ℃過夜。經(jīng)37 ℃恒溫箱復(fù)溫30 min，PBS沖洗，滴加鼠抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司)，常溫孵育30 min，PBS沖洗，DAB(武漢博士德生物工程有限公司)顯色5 min，蒸餾水沖洗，蘇木精復(fù)染60 s，梯度乙醇(含量遞增)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，通過顯微鏡(Leica公司，德國)采集照片。

1.3 總RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

將1.1中剪下的SWF、LWF、SYF、LYF，用1 mL注射器抽取卵泡液后，分別在生理鹽水中沖洗直至卵黃被清洗干凈，使用細(xì)胞刮刀刮取位于卵泡內(nèi)膜上的顆粒細(xì)胞用于總RNA提取。

用Trizol試劑(Invitrogen公司，美國)分別提取5只雞不同大小卵泡顆粒細(xì)胞的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體反應(yīng)條件為：42 ℃孵育15 min，85 ℃加熱5 s。使用GAPDH作為內(nèi)參基因，在線NCBI設(shè)計(jì)引物(表1)，由上海生工生物有限公司合成。

表1 供試引物序列

根據(jù)北京全式金產(chǎn)品使用說明書構(gòu)建20 μL PCR反應(yīng)體系： 2×TransStart?Tip Green qPCR Super-Mix 10 μL， 上游引物0.4 μL ，下游引物0.4 μL，cDNA 4 μL(100 ng)，RNase-free H2O 5.2 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，45個(gè)循環(huán)。使用2-△△CT法計(jì)算PRSS23基因的相對表達(dá)量。

1.4 卵泡液中孕激素含量的測定

使用P4含量ELISA試劑盒(上海藍(lán)基生物科技有限公司)分別對雞SWF、LWF、SYF、LYF卵泡液中P4含量進(jìn)行測定，酶標(biāo)儀讀取波長450 nm處的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的含量所對應(yīng)的OD450建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRSS23在蛋雞卵泡內(nèi)的免疫組織化學(xué)分析

通過免疫組織化學(xué)技術(shù)對PRSS23在蛋雞卵泡中的表達(dá)進(jìn)行定位，結(jié)果表明，PRSS23在蛋雞卵泡顆粒細(xì)胞層、膜細(xì)胞層和卵丘細(xì)胞均有表達(dá)，且在SYF顆粒細(xì)胞層表達(dá)量最高(圖1)。

A:SYF陰性對照；B:SYF試驗(yàn)組；C:LWF陰性對照； D:LWF試驗(yàn)組；GC:顆粒細(xì)胞層；TC:膜細(xì)胞層；CC:卵丘細(xì)胞A:Negative control of SYF;B:Experiment group of SYF;C:Negative control of LWF;D:Experiment group of LWF;GC:Granulosa cells layer;TC:Theca cells layer;CC:Cumulus cells圖1 PRSS23在蛋雞卵泡中的表達(dá)(200×)

2.2 PRSS23基因mRNA在蛋雞不同大小卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)差異分析

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR對PRSS23基因在蛋雞不同大小卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果(圖2)表明，PRSS23基因mRNA在SYF中的含量顯著高于其他卵泡(P<0.05)，而在SWF、LWF、LYF顆粒細(xì)胞中的含量差異不顯著(P>0.05)。

2.3 蛋雞不同大小卵泡卵泡液中P4含量

通過標(biāo)準(zhǔn)品的含量對應(yīng)的OD450來建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=3.7x2+10.0x+6.8,R2為0.989 3(圖3)。從圖4可以看出，P4在SYF卵泡液中的含量顯著高于其他卵泡卵泡液(P<0.05)，而在SWF、LWF、LYF卵泡液中的含量差異則不顯著(P>0.05)。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

圖3 P4含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 結(jié)論與討論

蛋雞為了維持其產(chǎn)蛋序列等級卵泡中每天有1個(gè)卵泡可以排卵，超過99% 的卵泡在發(fā)育過程中的不同時(shí)期走向閉鎖，等級前卵泡被成功選擇進(jìn)入等級卵泡序列，是維持等級卵泡排卵規(guī)律的重要標(biāo)志[13]。在這個(gè)過程中，多種激素和細(xì)胞因子共同調(diào)控旁分泌和自分泌，從而促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖和分化及子宮內(nèi)膜細(xì)胞和卵母細(xì)胞的成熟,最終排卵[14]。直徑在6～8 mm的SYF是卵泡在選擇過程中優(yōu)先進(jìn)入等級還是走向閉鎖的轉(zhuǎn)折點(diǎn)[4]。本研究選用LWF和SYF 2種卵泡，發(fā)現(xiàn)PRSS23在蛋雞卵泡顆粒細(xì)胞層、膜細(xì)胞層和卵丘細(xì)胞均有表達(dá)，在SYF顆粒細(xì)胞層表達(dá)量最高，同時(shí)在SYF中的表達(dá)量也要高于LWF，這表明PRSS23可能在蛋雞卵泡發(fā)育過程中起了重要的作用。

在動(dòng)物體內(nèi)，PRSS是一種通過對蛋白酶原的激活或抑制來參與蛋白質(zhì)的降解和合成的重要蛋白水解酶類[15]。它主要的生物學(xué)功能是通過絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serine protease inhibitor)調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、組織重建、血管形成、胚胎發(fā)育和病原侵入等過程[16]，因此，可以看出PRSS是生物體維持正常生命活動(dòng)過程中重要的蛋白質(zhì)。WAHLBERG等[17]通過基因芯片技術(shù)對處于排卵期的小鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，PRSS23基因表達(dá)量相對較高，且通過促性腺激素下調(diào)基因表達(dá)。進(jìn)一步研究PRSS23基因的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)，PRSS23基因在閉鎖卵泡中表達(dá)水平最高，而在排卵卵泡中則定位到卵泡膜細(xì)胞層和卵巢基質(zhì)[18]。WAHLBERG等[17]認(rèn)為，PRSS23可能會(huì)抑制卵泡顆粒細(xì)胞的增殖，從而導(dǎo)致卵泡閉鎖。關(guān)于PRSS23在家禽中的研究尚未見報(bào)道。本研究表明，PRSS23基因在蛋雞卵泡顆粒細(xì)胞中有表達(dá)，且在SYF中表達(dá)量顯著高于其他等級前卵泡。提示PRSS23在卵泡進(jìn)入等級還是走向閉鎖這個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)中發(fā)揮著重要作用。

在蛋雞卵泡液中的激素含量會(huì)隨著卵泡的發(fā)育處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。在8 mm以下的卵泡中顆粒細(xì)胞還處于未分化狀態(tài)，P4的含量較少，到卵泡發(fā)育到8 mm左右，已經(jīng)分化的顆粒細(xì)胞開始迅速合成P4，直至排卵[19]。卵泡選擇會(huì)引起顆粒細(xì)胞的分化以及卵泡發(fā)育，而在調(diào)控卵泡發(fā)育的過程中，顆粒細(xì)胞中的信號通路又會(huì)占主導(dǎo)作用[20]。本研究通過ELISA法對不同大小等級前卵泡卵泡液中的P4進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)P4在SYF卵泡液中的含量顯著高于其他卵泡卵泡液，推測PRSS23在SYF中可能會(huì)促進(jìn)顆粒細(xì)胞合成P4，從而影響卵泡的選擇。

綜上，PRSS23在蛋雞卵泡顆粒細(xì)胞層、膜細(xì)胞層和卵丘細(xì)胞均有表達(dá)，在SYF顆粒細(xì)胞層表達(dá)量最高；PRSS23mRNA在SYF中的含量顯著高于其他卵泡；P4在SYF卵泡液中的含量顯著高于其他卵泡卵泡液。