王 雨，王兆廣，劉澤軍，夏中曦，范玉頂，鐘其旺

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院/江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實驗室，江西 南昌 330045； 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 長江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223)

黃鱔(Monopterusalbus)屬硬骨魚綱、合鰓目、合鰓科、黃鱔屬，其肉質(zhì)鮮美，具有一定的藥用價值以及較高的營養(yǎng)價值，是我國名優(yōu)經(jīng)濟(jì)魚類之一[1]。目前，黃鱔主要是網(wǎng)箱養(yǎng)殖[2]，飼養(yǎng)環(huán)境過度擁擠，進(jìn)食受限，活動空間過小，使得部分黃鱔生長狀況不佳，肌肉的質(zhì)量下降[3]。不僅如此，冬季低溫以及疾病也會使黃鱔體質(zhì)量下降。魚類肌肉的生長過程受多種轉(zhuǎn)錄因子以及環(huán)境因素影響，其中atrogin-1作為E3泛素連接酶參與蛋白質(zhì)泛素化降解[4]，通過調(diào)節(jié)肌肉生長相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子來控制肌肉的質(zhì)量，是參與肌肉萎縮的關(guān)鍵酶之一[5-6]。目前，國內(nèi)對于黃鱔肌肉生長的生理機(jī)制研究甚少，因此對黃鱔肌萎縮基因atrogin-1的深入研究尤為重要。

atrogin-1(又稱MAFBX,Fbxo32)是F-box家族的成員之一，該家族的蛋白質(zhì)均包含1個約40個氨基酸的基序，即F-box。F-box是泛素蛋白連接酶復(fù)合物SCF(SKP1-cullin-F-box)的4個亞基之一，具有磷酸化依賴性泛素化作用[7-8]。在正常情況下，atrogin-1主要受生長因子IGF-1和胰島素抑制，這2種生長因子通過AKT/FoxO以及AKT/mTOR通路發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[9]。在饑餓、炎癥情況下，機(jī)體內(nèi)IGF-1和胰島素含量下降[10]，糖皮質(zhì)激素含量升高，atrogin-1被激活，發(fā)揮泛素連接酶的作用，識別目的蛋白，使其發(fā)生泛素化降解[11]。目前，對atrogin-1基因的研究主要集中在骨骼肌和心肌中[12]。有研究表明，atrogin-1基因在斑馬魚及大西洋鮭其他組織中也有表達(dá)[13]。

為研究黃鱔atrogin-1蛋白的功能及細(xì)胞內(nèi)定位，分別構(gòu)建了atrogin-1的原核以及真核表達(dá)載體。重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)分為可溶性表達(dá)和非可溶性表達(dá)，真核生物的基因在原核表達(dá)過程中很容易形成包涵體，這種包涵體就是非可溶性表達(dá)[14]。由于包涵體無生物活性，因此分離純化之后要對其進(jìn)行復(fù)性處理，過程繁瑣，且復(fù)性后的蛋白質(zhì)折疊可能發(fā)生改變[15]。為了避免包涵體的形成，使用冷休克表達(dá)載體,以有效促進(jìn)蛋白質(zhì)的可溶性，并優(yōu)化重組菌株的表達(dá)條件，旨在為atrogin-1蛋白的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

研究所用健康黃鱔購自江西瑞洪養(yǎng)殖場，置于實驗室水族箱中養(yǎng)殖數(shù)周，使黃鱔穩(wěn)定，每日喂食，水溫(25±1)℃，每天用曝氣自來水換水一次。

大腸桿菌DH5α購自生工生物工程(上海)股份有限公司，Transetta(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。293T細(xì)胞、pEGFP-N1質(zhì)粒、pET28a (+) 質(zhì)粒、pGEX6P-1質(zhì)粒和pCold-TF質(zhì)粒由本實驗室保藏。

1.2 主要試劑

SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒、無水乙醇、DEPC、氨芐青霉素鈉等均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；DNaseⅠ、Prime STAR Max高保真酶、T4 DNA連接酶均購自寶生物工程(大連)有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ均購自Promega公司；動物組織總RNA提取試劑盒、RNA純化試劑盒等購自天根生化科技(北京)有限公司；LipoD293TMDNA體外轉(zhuǎn)染試劑盒購自SignaGen公司；Hoechst 33342購自Sigma公司。

1.3 RNA提取及 cDNA合成

利用動物組織總RNA提取試劑盒提取黃鱔肌肉總RNA，DNaseⅠ去除基因組DNA，并用RNA純化試劑盒純化,1%瓊脂糖電泳檢測，NanoDrop 2000測定RNA濃度及純度。取純化后的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。反轉(zhuǎn)錄步驟：取1 μg左右的RNA、2 μL 60 μmol/L oligo dT,加無核酸酶水至10 μL?；靹蚝笥?0 ℃處理5 min，立即冰浴5 min，10 000×g離心1 min。加入5×M-MLV Buffer 5 μL、dNTP(2.5 mmol/L)2.5 μL、RNA酶抑制劑(40 U/μL)0.7 μL、M-MLV(200 U/μL)1 μL,加無核酸酶水至25 μL。42 ℃ 反應(yīng)60 min,95 ℃ 變性5 min，-20 ℃保存。

1.4 atrogin-1基因的克隆

在GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索黃鱔atrogin-1基因(登錄號：XM_020596809.1)。根據(jù)基因序列設(shè)計引物，上游引物引入BamHⅠ酶切位點及保護(hù)堿基，下游引物引入HindⅢ酶切位點及保護(hù)堿基(表1)。PCR 25 μL反應(yīng)體系：cDNA 1 μL、上下游引物各0.5 μL(終濃度0.2 μmol/L)、Prime STAR Max(2×) 12.5 μL、滅菌去離子水10.5 μL。PCR反應(yīng)程序：98 ℃變性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 atrogin-1表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

將含有pCold-TF質(zhì)粒的大腸桿菌，于37 ℃過夜搖培，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，電泳檢測。用BamHⅠ和HindⅢ 37 ℃過夜雙酶切pCold-TF質(zhì)粒及atrogin-1基因的PCR產(chǎn)物。對酶切產(chǎn)物切膠回收并進(jìn)行電泳檢測。連接反應(yīng)體系：1 μL pCold-TF質(zhì)粒、2.5 μL PCR酶切產(chǎn)物、1 μL T4連接酶Buffer、1 μL T4連接酶、4.5 μL滅菌去離子水。16 ℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，對長出的克隆進(jìn)行PCR檢測，檢測正確后送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。將測序正確的菌株提取質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到Transetta(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequences

注：引物序列中下劃線為相應(yīng)酶切位點。

Note：The underlines are restriction enzyme cutting sites.

1.6 atrogin-1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)參考文獻(xiàn)[16]中的方法。將含有atrogin-1重組質(zhì)粒的Transetta(DE3) 菌接種到LB液體培養(yǎng)基中(氨芐青霉素和氯霉素的終質(zhì)量濃度均為50 μg/mL)，37 ℃條件下230 r/min培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)菌生長達(dá)到OD600=0.4～0.6時，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，于16 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后取出，離心棄上清，沉淀用平衡液(20 mmol/L Tris-HCl， pH值為7.5，10%甘油，0.5 mol/L NaCl)重懸，超聲破碎。12 000 r/min離心取上清，同體積平衡液重懸沉淀，將菌體裂解液、上清、沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，檢測蛋白質(zhì)表達(dá)情況。

1.7 誘導(dǎo)條件對atrogin-1蛋白表達(dá)的影響

1.7.1 atrogin-1蛋白可溶性表達(dá)載體的篩選 分別構(gòu)建含有atrogin-1的pET28a(+)以及pGEX6P-1重組菌株，挑出陽性克隆，將測序正確的菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將過夜培養(yǎng)的重組菌按照1%的比例接種到含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6，加入IPTG，使終濃度為0.5 mmol/L，16 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，SDS-PAGE凝膠電泳檢測蛋白質(zhì)表達(dá)情況。

1.7.2 誘導(dǎo)劑濃度對atrogin-1蛋白表達(dá)的影響 將過夜培養(yǎng)的重組菌pCold-TF-atrogin-1/Transetta(DE3)按照1%的比例接種到LB液體培養(yǎng)基中(氨芐青霉素和氯霉素的終質(zhì)量濃度均為50 μg/mL)，于37 ℃搖床培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6，分為7份，分別加入IPTG，使其終濃度分別為0、0.05、0.10、0.30、0.50、1.00、1.20 mmol/L，16 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，SDS-PAGE凝膠電泳檢測蛋白質(zhì)表達(dá)情況。

1.7.3 誘導(dǎo)時間對atrogin-1蛋白表達(dá)的影響 將過夜培養(yǎng)的重組菌pCold-TF-atrogin-1/Transetta(DE3)按照1%的比例接種到LB液體培養(yǎng)基中(氨芐和氯霉素的終質(zhì)量濃度均為50 μg/mL)，于37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6，加入IPTG，使終濃度為0.5 mmol/L，16 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，分別在0、3、6、9、20、24 h時間點取樣，SDS-PAGE凝膠電泳檢測蛋白質(zhì)表達(dá)情況。

1.8 atrogin-1蛋白的分離純化

將誘導(dǎo)表達(dá)的大量重組菌超聲破碎后，4 ℃條件下12 000 r/min離心1 h，取上清，用0.45 μm的濾膜過濾后，濾液過Ni-NTA親和柱，然后用不同濃度的咪唑(20～1 000 mmol/L)對Ni-NTA親和柱進(jìn)行洗脫，收集不同濃度下的洗脫液，用10%的SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行檢測。蛋白質(zhì)濃度用Bradford法測定[17]。

1.9 atrogin-1基因的轉(zhuǎn)染及在細(xì)胞中的定位

將pEGFP-N1質(zhì)粒以及atrogin-1基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切，用T4連接酶過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，對長出的克隆進(jìn)行PCR檢測，檢測結(jié)果正確后，提取質(zhì)粒進(jìn)行EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切，將切出正確條帶的質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。用無內(nèi)毒素提取試劑盒提取質(zhì)粒，測定質(zhì)量濃度，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。在已長至單層的293T細(xì)胞中加入1 μg重組質(zhì)粒pEGFP-N1-atrogin-1，按照LipoD293TMDNA體外轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作，以pEGFP-N1質(zhì)粒作為空白對照。36 h后用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況。經(jīng)熒光顯微鏡觀察，若融合蛋白已表達(dá)，PBS緩沖液漂洗3次，每次5 min。加入終質(zhì)量濃度為10 μg/mL的Hoechst 33342避光孵育15 min，PBS緩沖液漂洗3次，每次5 min。熒光顯微鏡下觀察、拍照。藍(lán)色熒光信號指示細(xì)胞核的位置，綠色熒光信號指示EGFP融合蛋白細(xì)胞定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 atrogin-1基因的克隆結(jié)果

從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得黃鱔atrogin-1(Fbxo32)的mRNA序列(登錄號：XM_020596809.1),確定黃鱔atrogin-1基因ORF為1 074 bp，編碼357個氨基酸。利用設(shè)計的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增條帶大小與目的基因大小一致(圖1)。

2.2 pCold-TF-atrogin-1重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果

挑取陽性克隆進(jìn)行菌落PCR，條帶大小正確(圖2泳道3、4)。將含有目的基因的重組菌過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切，電泳檢測條帶大小正確，證明pCold-TF-atrogin-1載體構(gòu)建成功(圖2泳道1、2)。

M:DL2000 DNA Marker；1:atrogin-1基因

M:DL10000 DNA Marker；1:pCold-TF-atrogin-1質(zhì)粒；2:限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切pCold-TF-atrogin-1質(zhì)粒；M1：DL2000 DNA Marker；3、4：pCold-TF-atrogin-1的PCR驗證

2.3 pCold-TF-atrogin-1重組質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物分析

將含pCold-TF菌株和含有pCold-TF-atrogin-1的重組菌Transetta(DE3),在16 ℃用0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)24 h。含pCold-TF菌株表達(dá)的蛋白質(zhì)大小為54 ku，atrogin-1蛋白預(yù)測分子質(zhì)量大小為41.8 ku，重組蛋白分子質(zhì)量為95.8 ku，通過凝膠電泳檢測條帶大小與預(yù)測一致(圖3)。

2.4 誘導(dǎo)條件對atrogin-1蛋白表達(dá)的影響

2.4.1 atrogin-1蛋白可溶表達(dá)載體的篩選 圖4為16 ℃條件下用0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)24 h后蛋白質(zhì)表達(dá)情況。結(jié)果顯示，3種表達(dá)載體均可表達(dá)黃鱔atrogin-1蛋白，但是僅pCold-TF載體能夠表達(dá)可溶性的atrogin-1融合蛋白，而以pET28a(+)和pGEX6P-1構(gòu)建的重組載體，誘導(dǎo)表達(dá)時上清幾乎沒有融合蛋白，大部分的表達(dá)產(chǎn)物以包涵體的形式存在，不利于后續(xù)純化和功能研究。因此，本研究選取pCold-TF作為atrogin-1的表達(dá)載體。

M:蛋白質(zhì)Marker;1、2、3：pCold-TF菌體裂解液、上清、沉淀；4、5、6：重組質(zhì)粒pCold-TF-atrogin-1的菌體裂解液、上清、沉淀

M:蛋白質(zhì)Marker;1、 2：pCold-TF-atrogin-1菌體裂解液、上清；3、 4：pET28a(+)-atrogin-1菌體裂解液、上清；5、 6：pGEX6P-1-atrogin-1菌體裂解液、上清

2.4.2 誘導(dǎo)劑濃度對atrogin-1蛋白表達(dá)的影響 將含有pCold-TF-atrogin-1的重組菌Transetta(DE3)在16 ℃用不同濃度(0、0.05、0.10、 0.30、0.50、1.00、1.20 mmol/L)的IPTG誘導(dǎo)24 h，結(jié)果表明，0.05～1.20 mmol/L IPTG誘導(dǎo)條件下,蛋白質(zhì)表達(dá)無明顯差異(圖5)。

M:蛋白質(zhì)Marker；1、3、5、7、9、11、13：pCold-TF-atrogin-1/Transetta(DE3)菌株分別用0、0.05、0.10、0.30、0.50、1.00、1.20 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體裂解液;2、4、6、8、10、12、14:pCold-TF-atrogin-1/Transetta(DE3)菌株分別用0、0.05、0.10、 0.30、0.50、1.00、1.20 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后菌體裂解液上清

2.4.3 誘導(dǎo)時間對atrogin-1蛋白表達(dá)的影響 圖6為含有pCold-TF-atrogin-1的重組菌Transetta(DE3)在16 ℃用0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)不同時間(0、3、6、9、20、24 h)的蛋白質(zhì)表達(dá)情況。從圖6可以看出，誘導(dǎo)3 h后，上清中有部分目的蛋白；20 h時，蛋白質(zhì)量基本達(dá)到最大值；24 h之后，蛋白質(zhì)表達(dá)無明顯變化，且上清中可溶性蛋白量略有減少?？梢?，atrogin-1蛋白誘導(dǎo)20 h即可，誘導(dǎo)時間過長，反而使得部分蛋白質(zhì)可溶性降低。

2.5 atrogin-1蛋白的分離純化與濃度測定

將超聲破碎后的菌液上清用Ni-NTA柱純化，用不同濃度(20、40、60、80、100、200、500、1 000 mmol/L)的咪唑進(jìn)行洗脫(圖7)。結(jié)果表明，100 mmol/L和200 mmol/L的咪唑可以將大部分的雜蛋白洗脫；更高濃度的咪唑，如500 mmol/L、1 000 mmol/L的咪唑能夠洗脫較為純凈的目的蛋白。收集500、1 000 mmol/L的咪唑洗脫液，濃縮脫鹽后，于-80 ℃儲存。

M:蛋白質(zhì)Marker;1、3、5、7、9、11：pCold-TF-atrogin-1/Transetta(DE3)菌株誘導(dǎo)表達(dá)0、3、 6、9、20、24 h后的菌體裂解液；2、4、6、8、10、12：pCold-TF-atrogin-1/Transetta(DE3)菌株誘導(dǎo)表達(dá)0、3、 6、9、20、24 h后的菌體裂解液上清

M:蛋白質(zhì)Marker; 1：菌體裂解液； 2：濾膜濾過液； 3：流穿液； 4—10:0、20、40、60、80、100、200 mmol/L咪唑洗脫液； 11、12：500、1 000 mmol/L咪唑洗脫液

根據(jù)測得的OD值，制作蛋白質(zhì)含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=0.850 3x-0.009 1(R2=0.999)，將測得的相應(yīng)OD值帶入計算，得到菌體裂解液、流穿液、蛋白洗脫液的蛋白質(zhì)含量(表2)。純化后收集得到的蛋白質(zhì)含量約占總蛋白的43.35%。

表2 atrogin-1蛋白得率分析

2.6 atrogin-1蛋白在293T細(xì)胞中的定位分析

轉(zhuǎn)染后36 h在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，經(jīng)Hoechst 33342 染料染色后，在紫外光下可以看到被染成藍(lán)色的細(xì)胞核，EGPF蛋白和atrogin-1融合蛋白在293T細(xì)胞的細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)均有表達(dá)(圖8)。

融合蛋白呈綠色 (EGFP)，細(xì)胞核呈藍(lán)色 (Hoechst 33342)

3 結(jié)論與討論

本研究通過構(gòu)建原核表達(dá)載體獲取atrogin-1重組蛋白，并且對重組菌的表達(dá)進(jìn)行條件優(yōu)化，以期獲得高純度、高質(zhì)量蛋白質(zhì)。pCold-TF載體使用CspA啟動子，誘導(dǎo)溫度介于15～37 ℃，最適溫度在15 ℃左右[14]。本研究發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)劑的濃度對atrogin-1蛋白表達(dá)基本沒有影響，這與曾發(fā)姣等[14]的研究結(jié)果一致，但與前人的研究結(jié)果不同。彭丹等[18]在Bn COP1蛋白(pCold-TF載體)表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn)，最適IPTG濃度為0.8 mmol/L；而周波等[19]在烏桕SsSAD蛋白(pCold-TF載體)的表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn)，最適IPTG濃度為0.6 mmol/L。本研究中，目的蛋白的表達(dá)量隨著誘導(dǎo)時間的增加而增加，在誘導(dǎo)20 h后，蛋白質(zhì)表達(dá)量達(dá)到最大值，20 h之后，可溶性蛋白的量略有減少。因此，pCold-TF-atrogin-1/Transetta(DE3)菌株誘導(dǎo)最適條件應(yīng)為:16 ℃培養(yǎng)20 h左右；誘導(dǎo)劑濃度在0.05～1.00 mmol/L均可?？梢?，載體的選擇對于蛋白質(zhì)表達(dá)極為重要[20]，在pET28a(+)以及pGEX6P-1的重組載體中，atrogin-1蛋白均能大量表達(dá)，但是都處于包涵體狀態(tài)，對后續(xù)試驗造成不必要的麻煩，而冷休克載體pCold-TF-atrogin-1能在低溫條件下使其他蛋白質(zhì)合成受到抑制，在IPTG誘導(dǎo)下，目的基因優(yōu)先表達(dá)。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果表明，atrogin-1蛋白在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中均有表達(dá)，提示不同的蛋白質(zhì)定位可能與其功能靶標(biāo)相關(guān)。對黃鱔atrogin-1基因的研究不僅有助于了解黃鱔骨骼肌萎縮的機(jī)制，也對后續(xù)研究有著重要作用。治療骨骼肌萎縮是目前世界難題之一，研究發(fā)現(xiàn)，泛素連接酶是骨骼肌萎縮的關(guān)鍵酶，作為泛素連接酶之一的atrogin-1有著較為廣闊的研究前景。隨著研究人員的不懈努力，發(fā)現(xiàn)了atrogin-1越來越多的功能。SKURK等[21]發(fā)現(xiàn)，atrogin-1在抑制心肌肥大方面有著重要作用；肌細(xì)胞生成素MyoG是骨骼肌分化的必需因子，JOGO等[22]發(fā)現(xiàn)，該因子與atrogin-1有著密切關(guān)系；真核翻譯起始因子eIF3作為一個重要的調(diào)節(jié)因子，與atrogin-1存在著直接的相互作用[23]；MyoD基因家族是參與調(diào)節(jié)肌肉發(fā)育以及分化的重要轉(zhuǎn)錄因子，MyoD能夠被atrogin-1識別，從而被降解[11]。

本研究純化后的蛋白質(zhì)可用于后續(xù)atrogin-1抗體的制備和蛋白質(zhì)表達(dá)模式研究，為atrogin-1的功能研究奠定基礎(chǔ)。