劉 歡 羅振國** 陳向鋒 王麗強(qiáng) 單鏡源

1. 佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿男科（黑龍江佳木斯 154000）2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院（上海 200001）

前列腺癌是中老年男性泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，在中國，近年來前列腺癌的發(fā)病率一直在不斷增加， 它是導(dǎo)致男性因癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。 盡管我們在前列腺癌的診斷和輔助治療方面取得了相當(dāng)大的進(jìn)步， 但是迄今為止僅有低級別和局灶性前列腺癌治愈率達(dá)60%左右， 中晚期患者5 年生存率仍低于30%[2-3]，患者的總體生存率并未顯著提高。 因此對前列腺癌發(fā)生發(fā)展以及治療和預(yù)后的研究具有重要意義。 1992 年，Kanai Y，Tanuma S[4]等在小鼠及人細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種EF 手型鈣結(jié)合蛋白，并將其命名為核組蛋白（nucleobindin-2，NUCB2）。 目前發(fā)現(xiàn)NUCB2 具有特殊的結(jié)構(gòu)功能，并且是一種癌癥相關(guān)基因，該基因在胃癌、乳腺癌、前列腺癌、腎透明細(xì)胞癌等組織中被相繼報道。 Bcl-2 即B 細(xì)胞淋巴瘤-2 基因，是目前研究的與凋亡關(guān)系十分密切的原癌基因之一， 可抑制細(xì)胞凋亡，延長其生長，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[4]。

材料與方法

一、標(biāo)本來源及分組

收集佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科2010 年1月至2019 年1 月存檔前列腺石蠟標(biāo)本，將病理組織分為三組，分別為前列腺癌組、前列腺上皮內(nèi)瘤變組，以及前列腺良性增生組。 其中前列腺癌51 例、前列腺上皮內(nèi)瘤變共39 例[低級別上皮內(nèi)瘤變（LGPIN）18 例、高級別上皮內(nèi)瘤變（HGPIN）21 例]、良性前列腺增生20例。兩位資深病理醫(yī)師嚴(yán)格復(fù)審所有標(biāo)本。前列腺癌病例組患者年齡57～82歲，平均年齡72歲，大于、等于72歲者30 例，小于72 者21 例。 通過查閱病例，搜集患者術(shù)前血清前列腺特異性抗原(PSA)水平。 所有患者術(shù)前均未行放療、化療。前列腺癌組進(jìn)行Gleason 評分，對同一腫瘤的主要結(jié)構(gòu)和次要結(jié)構(gòu)分別評分， 兩項評分相加總積分≤5 分者列為高分化組（10 例）、6～7 分者列為中分化組（19 例）、8～10 分者列為低分化組（22 例）。 對前列腺癌病例組進(jìn)行隨訪， 共40 例患者滿足條件，其中5 年內(nèi)死亡25 例，5 年以上存活15 例。

二、試劑

兔抗人NUCB2（nucleobindin2）多克隆抗體購自武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司， 兔抗人Bcl-2 單克隆抗體，SP免疫組化染色試劑盒、DAB 顯色試劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

三、主要方法

標(biāo)本按理想實驗要求切片；60℃烤箱烘烤1 小時；二甲苯分梯度脫蠟；再用梯度酒精脫去二甲苯；PBS 和蒸餾水沖洗； 置于EDTA 抗原修復(fù)液PH9.0 高溫高壓抗原修復(fù)；切片至Tween 20,浸泡震蕩沖洗去污；切片至于3%的H2O2中滅活內(nèi)源性酶及封閉內(nèi)源性生物素，山羊血清抗原封閉；滴加配置好濃度的NUCB2 一抗、滴加即用型Bcl-2 一抗，常規(guī)孵育；滴加與一抗相匹配的二抗，再次孵育；每一步之間用PBS 沖洗3 次，每次3 分鐘；滴加顯色劑，顯微鏡下控制顯色時間,用蒸餾水充分沖洗；蘇木精復(fù)染細(xì)胞核；封片，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。 陽性結(jié)果判定由本院兩位病理科資深醫(yī)師在高倍鏡視野下，進(jìn)行陽性結(jié)果判定；最終結(jié)果分為：陽性表達(dá)、高表達(dá)和低表達(dá)。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS26.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。NUCB2和Bcl-2 在前列腺癌、前列腺上皮內(nèi)瘤變及良性前列腺增生組織中的表達(dá)采用χ2檢驗，以a=0.05 為顯著性檢驗水準(zhǔn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。NUCB2 和Bcl-2的相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)分析， 以P＜0.05 為有統(tǒng)計學(xué)意義，并采用Spss 制作五年生存曲線。

結(jié) 果

一、NUCB2、Bcl-2 在前列腺癌、前列腺上皮內(nèi)瘤變及良性前列腺增生組織中的表達(dá)

NUCB2 主要表達(dá)于腺上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)， 呈棕黃色至棕褐色（如圖1）。 NUCB2 在BPH、LGPIN、HGPIN 及PCa 組陽性率分別為10%，11.11%，14.29%及70.59%。NUCB2 在PCa 組中的陽性率明顯高于BPH 組、LGPIN組和HGPIN 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 見表1）。

Bcl-2 主要表達(dá)于正常前列腺的腺上皮細(xì)胞以及前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)（如圖2），在BPH、LGPIN、HGPIN 及PCa 組陽性率分別為15%，27.78%，52.29%及76.74%。 在PCa 組中的陽性率明顯高于BPH 組、LGPIN 組和HGPIN 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 見表1）。

圖2 Bcl-2 在前列腺癌中的陽性表達(dá)（SP，×200）

圖3 NUCB2 在前列腺增生中的陰性表達(dá)（SP，×200）

圖4 Bcl-2 在前列腺增生中的陰性表達(dá)（SP，×200）

二、NUCB2 和Bcl-2 的表達(dá)與前列腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

在前列腺癌組織中，NUCB2 表達(dá)與患者年齡無關(guān)（P＞0.05）；與Gleason 評分和術(shù)前血清PSA 值有關(guān)，隨著Gleason 評分的增高，NUCB2 的表達(dá)率也增高，同樣隨著術(shù)前血清PSA 值的增加，NUCB2 的表達(dá)率也增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。生存期小于5 年病例的NUCB2 表達(dá)陽性率高于生存期大于、等于5 年病例，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 見表2）。

Bcl-2 表達(dá)與患者年齡、5 年生存率均無關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）； 與Gleason 評分和術(shù)前血清PSA 值有關(guān)，隨著Gleason 評分的增高，Bcl-2 的表達(dá)率也增高， 同樣隨著術(shù)前血清PSA 值的增加，Bcl-2 表達(dá)率也增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 見表2）。

表2 NUCB2 和Bcl-2 表達(dá)與前列腺癌臨床病理因素的關(guān)系

三、NUCB2 與Bcl-2 在高級別上皮內(nèi)瘤變組和高分化前列腺癌組中的表達(dá)

NUCB2 在高分化PCa 組中陽性表達(dá)率高于HGPIN 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而Bcl-2 在高分化PCa 組中陽性表達(dá)率也高于HGPIN 組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05 見表3）。

表3 NUCB-2 和Bcl-2 在HGPIN 組和高分化PCa 組中的表達(dá)

四、NUCB2 表達(dá)與PCa 預(yù)后的關(guān)系

預(yù)后分析得知， 前列腺癌組中， 共有40 人滿足5年生存率調(diào)查。 NUCB2 組中， 小于5 年生存的25 人中，23 人陽性表達(dá)，2 人陰性表達(dá)；大于、等于5 年生存的15 人中，9 人陽性表達(dá)，6 人陰性表達(dá)， 陽性和陰性患者間術(shù)后生存差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，如圖5）。

Bcl-2 組中，小于5 年生存的25 人中，18 人陽性表達(dá)，7 人陰性表達(dá)；大于、等于5 年生存的15 人中，9 人陽性表達(dá)，6 人陰性表達(dá)， 陽性和陰性患者間術(shù)后生存差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05 見表2，如圖6）。

圖5 NUCB2 表達(dá)與PCa 術(shù)后生存曲線

圖6 Bcl-2 表達(dá)與PCa 術(shù)后生存曲線

五、前列腺癌中NUCB2 與Bcl-2 表達(dá)的相關(guān)性

NUCB2、Bcl-2 在前列腺癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)性（P＜0.05，見表4）。

表4 前列腺癌組織中NUCB2 和Bcl-2 表達(dá)的相關(guān)性分析結(jié)果

討 論

前列腺癌患者主要為老年男性， 近年來發(fā)病率呈現(xiàn)明顯上升趨勢， 目前前列腺癌位居我國男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)病率的第三位[6]因此，對前列腺癌的發(fā)生機(jī)制、演變過程的研究已成為亟待解決的問題。在前列腺癌方面的治療上， 基因治療會成為下一步研究的熱點，尤其是對中、晚期局部及全身轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者，具有很大的潛在優(yōu)勢。

NUCB2 也稱為NEFA 蛋白， 是一種新的腫瘤相關(guān)基因，最近研究發(fā)現(xiàn)與乳腺癌的復(fù)發(fā)和不良預(yù)后密切相關(guān)[7]，而且體外細(xì)胞實驗結(jié)果顯示能夠有效的增加乳腺癌細(xì)胞系的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力。 所有的結(jié)果都顯示和乳腺癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而且可以作為預(yù)測乳癌預(yù)后的一個重要指標(biāo)[7]。 在正常胃組織中NUCB2 表達(dá)水平較高，主要陽性分布于胃粘膜泌酸腺內(nèi)分泌細(xì)胞。 應(yīng)用RT-PCR 檢測方法， 分析比較胃癌組織和癌旁組織內(nèi)NUCB2 mRNA 的變化，發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中NUCB2 m RNA 水平下調(diào)50%，在胃癌組織中NUCB2 呈現(xiàn)出一種腫瘤抑制基因的特點[8-9]。 也有研究采用免疫組織化學(xué)、免疫印跡以及qRT-PCR 進(jìn)行檢測，腎透明細(xì)胞癌組織中NUCB2 表達(dá)水平明顯高于相鄰的非癌變組織[10]。

本實驗顯示NUCB2 在前列腺癌組中的表達(dá)明顯高于良性前列腺增生組和前列腺上皮內(nèi)瘤變組， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）， 本實驗顯示， 在PCa 組中NUCB2 表達(dá)與年齡無關(guān)（P＞0.05），與腫瘤的Gleason分級、術(shù)前血清PSA 相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），血清PSA—直被認(rèn)為是前列腺癌的理想分子標(biāo)志物，被廣泛應(yīng)用于前列腺癌的發(fā)生、 進(jìn)展及前列腺癌復(fù)發(fā)后的隨訪等過程中。 隨著術(shù)前血清PSA 值的升高，NUCB2 蛋白的表達(dá)率也增高。 前列腺癌Gleason 評分與前列腺癌的生物學(xué)行為和臨床預(yù)后之間具有很好的關(guān)聯(lián)性，隨著Gleason 分級的增加，評分越高，前列腺癌分化越差，NUCB2 表達(dá)率越高，提示NUCB2 表達(dá)可能與癌癥的進(jìn)展和分化有關(guān)。 NUCB2 在小于5 年與大于、等于5 年生存期病例中的表達(dá)存在差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示NUCB2 的異常表達(dá)可能與前列腺癌的預(yù)后有關(guān)。 HGPIN 目前認(rèn)為是一種癌前病變， 其組織學(xué)形態(tài)與生物學(xué)行為與PCa 尤其是高分化前列腺癌相似并有關(guān)聯(lián)。 本組實驗顯示在高分化PCa組中NUCB2 陽性表達(dá)高于HGPIN 組， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示其可能有助于二者的鑒別診斷。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用， 凋亡失衡是引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生和增殖的重要影響因素， 也是導(dǎo)致惡性腫瘤治療失敗的主要原因之一。 Bcl-2 作為調(diào)控凋亡的重要基因產(chǎn)物受到廣泛關(guān)注，其可以抑制多種組織的細(xì)胞凋亡，在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮著原癌基因的作用[12]。

本實驗中顯示Bcl-2 在前列腺癌組中的表達(dá)明顯高于良性前列腺增生組和前列腺上皮內(nèi)瘤變組， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示Bcl-2 可能參與了前列腺癌的發(fā)生。 在PCa 組中Bcl-2 表達(dá)與年齡無關(guān)（P＞0.05），與腫瘤的Gleason 分級、術(shù)前血清PSA 相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），隨著Gleason 分級的增加，Bcl-2 表達(dá)率越高，提示Bcl-2 達(dá)可能與癌癥的進(jìn)展和分化有關(guān)。Bcl-2在小于5 年與大于、 等于5 年生存期病例中的表達(dá)有差異，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），在高分化PCa 組和HGPIN 組中表達(dá)存在差異，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

NUCB2 是一種新近發(fā)現(xiàn)的與惡性腫瘤相關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)，該基因的表達(dá)與細(xì)胞抵抗力密切相關(guān)，通過抑制組織細(xì)胞凋亡實現(xiàn)延長細(xì)胞壽命的現(xiàn)象[13]，并且具有其獨特的結(jié)構(gòu)域及相應(yīng)的功能，陳美霓[14]等發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織Bcl-2 表達(dá)增強(qiáng)，并通過抑制細(xì)胞的凋亡而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，Bcl-2 作為重要的凋亡因子在人體細(xì)胞凋亡中起著至關(guān)重要的作用。 通過Spearman 相關(guān)性分析得知NUCB2、Bcl-2 在前列腺癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)性（P＜0.05）。 NUCB2 和Bcl-2 隨著前列腺癌的發(fā)生，表達(dá)逐漸增強(qiáng)，兩者的正相關(guān)性提示它們之間可能存在一種相互作用機(jī)制。 是否能提示在前列腺癌組織中NUCB2 的高表達(dá)引起B(yǎng)cl-2 增加，影響細(xì)胞凋亡過程,破壞細(xì)胞凋亡平衡，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

NUCB2 和Bcl-2 與前列腺癌的發(fā)生、 發(fā)展密切相關(guān)， 檢查其表達(dá)水平對疾病鑒別診斷和預(yù)后評估都有一定幫助, 對鑒別高分化PCa 和HGPIN 提供一種新思路。 目前NUCB2 與Bcl-2 之間的相互關(guān)系以及生物學(xué)功能方面的研究還比較少， 尤其是在腫瘤中的相互作用機(jī)制，需要進(jìn)行更詳細(xì)的研究。