寇大慶 孫文平 綦霞

肝癌是全球范圍內(nèi)常見惡性腫瘤之一，其病死率居于所有腫瘤的第3位［1］。探索肝癌相關(guān)侵襲、轉(zhuǎn)移的潛在分子標志物，可為肝癌的治療提供新的指導。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度約為21～25 個核苷酸的小分子RNA，參與轉(zhuǎn)錄后基因的調(diào)控。miRNA與肝癌的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移及預后密切相關(guān)。已有研究證實，miR-124在肝癌細胞系和肝細胞癌組織中表達量低［2］，且過表達miR-124可抑制肝癌細胞的增殖［3］。caveolin-1是細胞膜內(nèi)陷小窩的結(jié)構(gòu)蛋白，在腫瘤細胞惡性增殖、分化、預后等方面發(fā)揮重要作用［4-5］。因此，闡明由miRNA調(diào)控caveolin-1的水平繼而影響肝癌細胞惡性行為的分子生物學機制對肝癌臨床診療尤為重要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗對象 1）組織標本：收集2012年8月至2014年7月收治于大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院的臨床肝癌患者標本32例，術(shù)后半年進行隨訪用于臨床5年預后分析。所用樣本在取樣前均與患者簽署了知情同意書。所取肝癌組織經(jīng)病理醫(yī)生證實為肝細胞肝癌，癌旁組織取自距離腫瘤邊緣3 cm以上處；2）細胞株：肝癌細胞高轉(zhuǎn)移細胞株MHCC97H、肝癌細胞低轉(zhuǎn)移細胞株MHCC97L 及人胚腎細胞株HEK 293T購自南京凱基生物有限公司。

1.1.2 主要試劑和儀器 胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）、胰蛋白酶-EDTA 消化液（0.25%）、Trizol 試劑及LipofectamineTM2000 試劑盒（美國Invitrogen 公司）；caveolin-1 pEGFP-N2 vector、miR-124 mimic/inhibitor、sicaveolin-1（廣州銳博公司）；雙熒光素酶報告質(zhì)粒pmirGLO（吉瑪公司）；CCK8 試劑（南京凱基公司）；PVDF 膜（美國Pall 公司）；多克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；ECL發(fā)光試劑盒及QuantiTect Reverse Transcription Kit（美國Thermal Fisher Scientific公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將肝癌細胞株置于含有10%體積的熱滅活胎牛血清、1%體積的青霉素（100μg/mL）、鏈霉素（100μg/mL），90%體積的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

取對數(shù)生長期的肝癌細胞，用胰酶消化后，將2 mL、密度為1×105個/mL 細胞懸液接種到6 孔板，培養(yǎng)24 h后，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書介紹的方法進行miR-124 inhibitor、miR-124 mimic、caveolin-1、sicaveolin-1等轉(zhuǎn)染，48 h后置于熒光顯微鏡下觀察細胞的轉(zhuǎn)染效果。

1.2.2 RNA 提取和Real-time PCR 用Trizol 法提取人肝癌組織及肝癌細胞株中總RNA，紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，反應體系為20 μL，在25℃反應5 min，在42℃反應60 min，在70℃反應5 min，將所提取RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照SYBR Premix Ex TaqⅡ加樣體系，再對所得的DNA 進行實時定量PCR 擴增，反應體系總體積為25μL，分別在95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火，72℃延伸30 s，共40 個擴增循環(huán)。采用2-△△CT計算miR-124和caveolin-1的相對表達量。

1.2.3 免疫印跡分析 提取總蛋白并測定濃度。煮沸變性的蛋白以每孔30μg的含量點樣，經(jīng)濃縮膠為6%、分離膠為12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDSPAGE）電泳分離。通過電轉(zhuǎn)儀將凝膠上的蛋白樣品移至PVDF 膜上，新鮮配制封閉液（5%脫脂奶粉）在37℃封閉2 h。分別加一抗caveolin-1（1：1 000）、內(nèi)參GAPDH（1：2 500）4℃孵育過夜。以PBS洗膜3次，每次8 min。然后加二抗37℃孵育90 min，PBS 洗膜3次。避光配制發(fā)光液，將PVDF膜放置于LabWork 凝膠成像曝光室內(nèi)，吸去膜表面多余水分，均勻?qū)l(fā)光液淋于膜上后發(fā)光即可，記錄實驗結(jié)果。

1.2.4 雙熒光素酶報告實驗 為檢測miR-124與caveolin-1的靶向結(jié)合關(guān)系，設(shè)計與miR-124 相結(jié)合的caveolin-1的3'-UTR序列以及突變序列，并分別將其構(gòu)建到雙熒光素酶報告基因載體pmirGLO上（此過程由上海吉瑪公司合成）。取對數(shù)生長期的密度為5×104個HEK 293T 細胞接種于24 孔板，培養(yǎng)24 h 達到80%融合度后，向24 孔板中共同轉(zhuǎn)染caveolin-1、miR-124及對照miR-NC 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，進行共轉(zhuǎn)染。使用雙熒光素酶檢測試劑盒（Promega）分別檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。

1.2.5 CCK8 細胞增殖實驗 為檢測不同肝癌細胞的體外增殖能力，取對數(shù)生長期的肝癌細胞（1×103個/孔）接種于96 孔板，每孔添加100 μL 培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2的濕潤環(huán)境下，分別培養(yǎng)0、24、48、72、96 h 后，向各孔內(nèi)加入11μL CCK8 反應液。4 h 后，用酶標儀在450 nm處檢測各實驗孔吸光度。

1.2.6 平板克隆實驗 收集肝癌細胞，并制備成單細胞懸液；將1×103個細胞接種于6孔板中，充分吹打成單細胞懸液。置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 d，每隔3天更換一次培養(yǎng)基；取出后經(jīng)10%甲醛固定40 min后，滴加0.1%結(jié)晶紫染液室溫染色20 min，PBS清洗數(shù)次并拍照。

1.2.7 細胞侵襲實驗 將肝癌細胞加入到有8 μm ECMatrix 凝膠涂層的transwell 小室的上層中。在transwell小室的下層中，加入含有血清的細胞培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞。培養(yǎng)24 h 后，取出transwell小室，用棉簽輕輕擦去上層未轉(zhuǎn)移細胞。以甲醇固定transwell小室下層的細胞，瑞氏-吉姆薩染色，在顯微鏡下觀察侵襲的肝癌細胞，并計算百分比。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。每組數(shù)據(jù)來自至少3個獨立實驗，數(shù)據(jù)用表示。采用t檢驗分析樣本之間的差異。配對t檢驗用于肝癌和癌旁組織間數(shù)據(jù)的比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-124 和caveolin-1 在肝癌組織及細胞系中的表達

qRT-PCR分析顯示，miR-124在癌組織中的相對表達量（7.72±1.05）明顯低于癌旁組織（14.03±1.39，t=4.546，P<0.00 1）；miR-124在MHCC97H細胞中的相對表達量（1.00）低于MHCC97L細胞的相對表達量（3.11±0.72，t=8.713，P=0.013）。而caveolin-1的表達呈相反的趨勢，qRT-PCR結(jié)果顯示，肝癌組織中caveolin-1水平（12.21±1.21）明顯高于癌旁組織（8.06±1.29，t=3.345，P<0.001）；MHCC97H細胞中caveolin-1水平（1.00）明顯高于MHCC97L細胞（0.38±0.09，t=16.46，P=0.004）。miR-124和caveolin-1的表達與32例肝癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性見表1。

2.2 caveolin-1與miR-124的關(guān)系

通過生物信息學分析，caveolin-1 可能是miR-124 的潛在靶標。為了證實miR-124 能夠與caveolin-1的3'-UTR結(jié)合，本研究進行雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?。結(jié)果顯示，caveolin-1 與miR-124 存在靶向調(diào)控關(guān)系（t=18.62，P<0.001，圖1A）。特異性上調(diào)MHCC97H 細 胞 中miR-124 的 表 達，caveolin-1 的mRNA 和蛋白水平均表達下調(diào)（t=9.031，P=0.012，圖1B）；特異性下調(diào)MHCC97L細胞中miR-124水平，caveolin-1 在mRNA 和蛋白水平較對照組顯著上調(diào)（t=4.468，P=0.047，圖1C）。

表1 肝癌患者miR-124、caveolin-1表達水平與臨床病理特征的關(guān)系

圖1 caveolin-1與miR-124的關(guān)系

2.3 miR-124 通過靶向調(diào)控caveolin-1 介導肝癌細胞的增殖及侵襲

CCK8 分析顯示，MHCC97H 細胞轉(zhuǎn)染miR-124 mimic，96 h后，與對照組（OD=1.54±0.12）相比該細胞的增殖能力被抑制（OD=1.0±0.09，NC mimicvs.miR-124 mimic，t=3.279，P=0.035）；MHCC97H細胞共轉(zhuǎn)染miR-124 mimic 和caveolin-1，96 h 后，與miR-124 mimic 組相比，該細胞的增殖能力增強（OD=1.44±0.08，miR-124 mimicvs. miR-124 mimic+caveolin-1，t=3.436，P=0.040）。平板克隆實驗也顯示出相同的趨勢（NC mimic 組克隆數(shù)：672±61；miR-124 mimic組克隆數(shù)：209±32；miR-124 mimic+caveolin-1 組克隆數(shù)：475±56）。Transwell 結(jié)果顯示，MHCC97H 細胞轉(zhuǎn)染miR-124 mimic 后，與對照組（侵襲細胞數(shù)：41±8）相比，該細胞的侵襲能力下降（侵襲細胞數(shù)：17±3），共轉(zhuǎn)染miR-124 mimic和caveolin-1后，MHCC97H細胞的侵襲能力增強（侵襲細胞數(shù)：29±5）。

MHCC97L 細胞被轉(zhuǎn)入miR-124 inhibitor，96 h后，與對照組（OD=1.16±0.17）相比該細胞的增殖能力增強（OD=1.63±0.18，NC inhibitorvs. miR-124 inhibitor，t=3.469，P=0.026）；MHCC97L細胞中共轉(zhuǎn)染miR-124 inhibitor和siCaveolin-1，96 h后，該細胞的增殖及侵襲能力受到抑制（OD=1.23±0.16，miR-124 inhibitorvs. miR-124 inhibitor+sicaveolin-1，t=2.896，P=0.044）。平板克隆實驗也顯示了相同的趨勢（NC inhibitor 組克隆數(shù)：249±33；miR-124 inhibitor 組克隆數(shù)：954±98；miR-124 inhibitor+sicaveolin-1 組克隆數(shù)：260±42）。Transwell 結(jié)果顯示，MHCC97L 細胞轉(zhuǎn)染miR-124 inhibitor后，與對照組（侵襲細胞數(shù)：35±6）相比，該細胞的侵襲能力增強（侵襲細胞數(shù)：54±8），共轉(zhuǎn)染miR-124 inhibitor和sicaveolin-1后，MHCC97L細胞的侵襲能力下降（侵襲細胞數(shù)：33±5）。

2.4 miR-124 和caveolin-1 與臨床肝癌患者預后的相關(guān)性

采用Kaplan-Meier 法分析miR-124、caveolin-1表達與臨床肝癌患者5年生存率的關(guān)系。結(jié)果顯示，肝癌患者中miR-124 低水平組的總生存期低于高水平組（χ2=11.85，P<0.001），miR-124 低水平組5年生存率為20%，高水平組5年生存率為81.81%。高水平caveolin-1肝癌患者5年生存率低于低水平caveolin-1肝癌患者（χ2=8.79，P=0.013），高水平caveolin-1組5年生存率為42.11%，低水平組5年生存率為76.92%。

3 討論

miRNA 是一類非編碼單鏈的RNA，通常在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達。異常miR-7 通過靶向調(diào)控PI3K/Akt 通路，可抑制肝癌細胞的生長及轉(zhuǎn)移過程［6］。miR-26a 能夠通過抑制血管生成而延緩肝癌惡性進展［7］。上述研究均證實，調(diào)控性miRNA 在肝癌進展中可能發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)與癌旁組織和低轉(zhuǎn)移肝癌細胞中相比，miR-124在肝癌組織及高轉(zhuǎn)移肝癌細胞中呈低表達，提示miR-124為一類可抑制肝癌惡性進展的重要分子。caveolin-1是一種細胞表面的穴樣內(nèi)陷（caveolae）中的主要膜內(nèi)在蛋白，參與調(diào)控膽固醇轉(zhuǎn)運、細胞內(nèi)吞以及腫瘤轉(zhuǎn)移等重要生物學過程［8］。本研究檢測了caveolin-1 水平，發(fā)現(xiàn)其相比于癌旁組織和低轉(zhuǎn)移肝癌細胞，在肝癌組織及高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞中呈較高水平。這個結(jié)果提示異常的miR-124 和caveolin-1 水平可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

miRNA 常常結(jié)合到靶基因的3'-UTR 區(qū)而抑制靶基因功能的發(fā)揮［2］。已有文獻證實miR-124 能夠通過調(diào)控BIRC3 表達介導肝癌進展［9］。通過雙熒光素酶報告實驗，證實了生物信息學預測結(jié)果，miR-124通過靶向調(diào)控caveolin-1介導肝癌細胞惡性行為的發(fā)生。特異性改變肝癌細胞中的miR-124水平，能夠顯著影響細胞中caveolin-1表達。miR-124參與到肝癌及乳腺癌的惡性生物學行為［9-10］。在本研究中，調(diào)控肝癌細胞中miR-124的水平，可顯著影響肝癌細胞惡性行為。當共調(diào)控細胞中的miR-124 和caveolin-1 后，該細胞的增殖及侵襲能力同樣被調(diào)控。此外，又進一步分析miR-124 及caveolin-1 是否可作為肝癌預后的獨立預測分子。根據(jù)對臨床患者生存跟蹤分析，發(fā)現(xiàn)miR-124 和caveolin-1 均可作為潛在的判斷肝癌預后的分子標志物。

綜上所述，miR-124可能通過靶向調(diào)控caveolin-1介導肝癌細胞的惡性行為，本研究旨在為肝癌的診斷及治療監(jiān)測尋找潛在的靶標。