劉功良 朱寶生，2 高蘇娟 劉 銳 白衛(wèi)東 費(fèi)永濤 艾連中 俞劍燊 郭 波

（1 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院 廣州510225 2 廣西輕工業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院有限公司 南寧530031 3 上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院 上海200093 4 上海金楓酒業(yè)股份有限公司 上海200120 5 廣東石灣酒廠集團(tuán)有限公司 廣東佛山528031）

隨著工業(yè)水平的發(fā)展，工業(yè)乙醇的生產(chǎn)越來(lái)越偏向于濃醪發(fā)酵。與傳統(tǒng)發(fā)酵相比，濃醪發(fā)酵能提高設(shè)備利用率，降低能耗，節(jié)約成本，提高產(chǎn)物生成率[1-4]。鑒于這些優(yōu)點(diǎn)，濃醪發(fā)酵的研究備受關(guān)注。近年來(lái)，為使底物更加有效地轉(zhuǎn)化成目標(biāo)產(chǎn)物，細(xì)胞內(nèi)部的代謝流分布成為研究的重點(diǎn)[5-6]。代謝流分析是代謝網(wǎng)絡(luò)分析的重要組成，是代謝工程中用以指導(dǎo)遺傳操作的重要手段[7-8]。作者從蜂蜜中篩選獲得1 株可耐受700 g/L 葡萄糖質(zhì)量濃度的蜂蜜接合酵母（Zygosacharomyces mellis，Z.mellis）LGL-1，鑒定其種屬與抗逆性能，同時(shí)對(duì)蜂蜜接合酵母LGL-1 的發(fā)酵性能進(jìn)行初步探討[9]。本文以蜂蜜接合酵母LGL-1 為研究對(duì)象，考察其在高糖脅迫下的代謝流，旨在為深入研究酵母菌高糖脅迫應(yīng)激機(jī)制，耐高糖酵母的代謝調(diào)控和菌種工業(yè)化改造提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 菌種

蜂蜜接合酵母LGL-1，保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基

1）高糖培養(yǎng)基[7]稱取13 g 麥芽汁，78 g 葡萄糖，溶于100 mL 去離子水中，可得到400 g/L 的高糖培養(yǎng)基，于70 ℃水浴搖勻，溶解后115 ℃滅菌20 min。

2）常規(guī)培養(yǎng)基 稱取13 g 麥芽汁，27 g 葡萄糖，溶于100 mL 去離子水中，可得到100 g/L 的常規(guī)培養(yǎng)基，于70 ℃水浴搖勻，溶解后115 ℃滅菌20 min。

1.3 主要試劑

蒽酮、海藻糖、甘油、乳酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、α-酮戊二酸，阿拉丁生化科技股份有限公司；硫酸，天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.4 主要設(shè)備與儀器

SHZ-82 水浴恒溫?fù)u床，常州市國(guó)立試驗(yàn)設(shè)備研究所；G716-3 小型臺(tái)式離心機(jī)，廣州市正一有限公司；722G 可見(jiàn)光分光光度計(jì)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；JJ600 精密電子天平，常熟雙杰測(cè)試儀器廠；LC-20A 液相色譜儀，島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 蜂蜜接合酵母代謝產(chǎn)物的測(cè)定

取活化后的蜂蜜接合酵母LGL-1，以10%接種量接入高糖濃度培養(yǎng)基中，初始pH6.0，30 ℃發(fā)酵96 h 后，用比重法測(cè)發(fā)酵液的酒精濃度[10]，用HPLC 檢測(cè)酵母細(xì)胞中有機(jī)酸（蘋(píng)果酸、α-酮戊二酸、乳酸、檸檬酸）的濃度[11]，采用高碘酸鈉-乙酰丙酮法測(cè)定酵母細(xì)胞中甘油的濃度[12-13]，采用硫酸蒽酮法測(cè)定酵母細(xì)胞內(nèi)海藻糖的濃度[14-15]。重復(fù)檢測(cè)3 次，利用SPSS 軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。

HPLC 的操作條件和參數(shù)：選用（NH4）2HPO4為無(wú)機(jī)鹽緩沖液，經(jīng)磷酸調(diào)解節(jié)后超聲波脫氣30 min，調(diào)緩沖液pH 值至3.0。甲醇為有機(jī)相，設(shè)定V0.01mol/L（NH4）2HPO4∶V甲醇=95%∶5%為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)213 nm，柱溫30 ℃，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣體積10 μL。稱量400 mg 蘋(píng)果酸、200 mg α-酮戊二酸、320 mg 乳酸、200 mg 檸檬酸，用超純水定容100 mL。取混合標(biāo)準(zhǔn)樣品各2，4，6，8，10 μL，分別平行進(jìn)樣3 次。以含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸線方程。取蜂蜜接合酵母LGL-1 在不同糖度條件下的發(fā)酵液，4 ℃、8 000 r/min 離心10 min，取上清，用0.22 μm 濾膜過(guò)濾，4℃保存，上機(jī)檢測(cè)。

2.2 代謝通量的計(jì)算方法

假設(shè)細(xì)胞中的代謝產(chǎn)物處于擬穩(wěn)態(tài)，其濃度變化速率為0，以細(xì)胞內(nèi)代謝流通量平衡為基礎(chǔ)，按照物料守恒原理，核算中間代謝產(chǎn)物的積累速率，單位為mmol/（L·h），通過(guò)代謝產(chǎn)物的約束條件構(gòu)建方程，結(jié)合實(shí)驗(yàn)測(cè)出F 個(gè)不相關(guān)速率即可確定胞內(nèi)整體流量分布，定量描述生理行為[16-17]。

2.3 代謝網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

蜂蜜接合酵母LGL-1 在穩(wěn)定期的物質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)[1]，見(jiàn)圖5。

2.4 代謝矩陣方程組的構(gòu)建

圖5含有13 個(gè)變量(V1-V13)，qGlu（葡萄糖代謝通量）、qTre（海藻糖代謝通量）、qGly（甘油代謝通量）、qLA（乳酸代謝通量）、qCIA（檸檬酸代謝通量）、qα-KG（α-酮戊二酸代謝通量）、qMAL（蘋(píng)果酸代謝通量）根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)方法的測(cè)定結(jié)果計(jì)算得出[2]。假設(shè)細(xì)胞內(nèi)中間代謝產(chǎn)物處于擬穩(wěn)態(tài)，構(gòu)成13 個(gè)方程，建立矩陣方程組（表1），應(yīng)用軟件MATLAB 7.0 求解各反應(yīng)途徑的代謝通量。

3 結(jié)果與分析

3.1 高糖脅迫下蜂蜜接合酵母LGL-1 的代謝特性

采用對(duì)數(shù)期的酵母菌接入高糖培養(yǎng)基和常規(guī)培養(yǎng)基中，菌體質(zhì)量變化、葡萄糖消耗、代謝產(chǎn)物的生成情況如圖1所示。

圖1 高糖培養(yǎng)和常規(guī)培養(yǎng)下酵母菌的細(xì)胞生長(zhǎng)、底物消耗和產(chǎn)物合成（n=3）Fig.2 Grow-up of cell，consumption of substrate and synthesis of products under sugar stress condition and normal condition（n=3）

由圖1可知，酵母細(xì)胞在高糖培養(yǎng)基和常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)0～12 h，菌體質(zhì)量濃度幾乎相同。培養(yǎng)12～60 h 時(shí)，常規(guī)培養(yǎng)基中的酵母菌體質(zhì)量濃度比高糖培養(yǎng)基稍高。蜂蜜接合酵母LGL-1 在常規(guī)培養(yǎng)和高糖培養(yǎng)60 h 后趨于穩(wěn)定，進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體質(zhì)量濃度幾乎相同。培養(yǎng)84 h 時(shí)，常規(guī)培養(yǎng)和高糖培養(yǎng)時(shí)的菌體質(zhì)量濃度都達(dá)到最高值，分別為5.74 g/L 和5.71 g/L。

蜂蜜接合酵母LGL-1 培養(yǎng)0～96 h，高糖培養(yǎng)基和常規(guī)培養(yǎng)基中的葡萄糖質(zhì)量濃度不斷降低，葡萄糖不斷被消耗。與常規(guī)培養(yǎng)相比，高糖培養(yǎng)基中蜂蜜接合酵母LGL-1 的葡萄糖消耗速率減慢。常規(guī)培養(yǎng)基中細(xì)胞在72 h 時(shí)葡萄糖質(zhì)量濃度為6.13 g/L，而在高糖培養(yǎng)基中糖耗延遲至96 h 尚未耗盡，葡萄糖質(zhì)量濃度為198.40 g/L。

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，蜂蜜接合酵母LGL-1所產(chǎn)的酒精質(zhì)量濃度逐漸增加。培養(yǎng)0～24 h 時(shí)，常規(guī)培養(yǎng)比高糖培養(yǎng)時(shí)酒精生成速率要高。培養(yǎng)24 h 后，常規(guī)培養(yǎng)的酒精生成速率放緩，高糖培養(yǎng)產(chǎn)酒精速率沒(méi)有變化。培養(yǎng)96 h 后，常規(guī)培養(yǎng)產(chǎn)酒精含量達(dá)到47.9 g/L，隨后基本趨于穩(wěn)定。而同一培養(yǎng)時(shí)間，高糖培養(yǎng)產(chǎn)酒精含量達(dá)到最高值58.4 g/L，所產(chǎn)酒精質(zhì)量濃度是常規(guī)培養(yǎng)的1.22倍。

蜂蜜接合酵母 LGL-1 高糖培養(yǎng)0～18 h 時(shí)，幾乎沒(méi)有乳酸生成，高糖培養(yǎng)18～72 h，乳酸含量逐漸增加，以適應(yīng)高糖環(huán)境。高糖培養(yǎng)72 h 后乳酸含量逐漸降低。常規(guī)培養(yǎng)0～44 h 時(shí)，乳酸含量快速增加，44 h 后快速減少。發(fā)酵60 h 后，高糖培養(yǎng)條件下，乳酸濃度高于常規(guī)。在高糖培養(yǎng)條件下乳酸的合成明顯受到抑制，最大值由常規(guī)培養(yǎng)的11.4 g/L 降為高糖時(shí)的6.9 g/L。

綜上所述，高糖培養(yǎng)基和常規(guī)培養(yǎng)基中的細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞能較好地抵御高糖脅迫，與彭酈等[18]的試驗(yàn)結(jié)果一致。

3.2 蜂蜜接合酵母LGL-1 中海藻糖的合成

海藻糖在高糖脅迫環(huán)境下對(duì)細(xì)胞的生物膜、蛋白質(zhì)和核酸等大分子具有良好的保護(hù)作用，是一種典型的應(yīng)激性代謝物[19-20]。由圖2可知，高糖培養(yǎng)0～60 h 時(shí)，蜂蜜接合酵母LGL-1 產(chǎn)海藻糖含量低于在常規(guī)培養(yǎng)基中的海藻糖含量，而在高糖培養(yǎng)60 h 后蜂蜜接合酵母LGL-1 產(chǎn)海藻糖含量一直維持在較高的水平。同一時(shí)間常規(guī)培養(yǎng)中蜂蜜接合酵母LGL-1 產(chǎn)海藻糖含量逐漸減少。常規(guī)培養(yǎng)時(shí)海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高達(dá)到細(xì)胞干重的0.37%，而高糖培養(yǎng)時(shí)達(dá)到0.83%。

3.3 蜂蜜接合酵母LGL-1 中甘油的合成

甘油含有羥基，親水性能好，能有效地維持細(xì)胞內(nèi)水活度，保護(hù)細(xì)胞免受脫水的侵害，是一種良好的生物相容性溶質(zhì)[21-23]。由圖3可知，培養(yǎng)0～72 h，常規(guī)培養(yǎng)基和高糖培養(yǎng)基生長(zhǎng)的蜂蜜接合酵母LGL-1 中甘油的合成量逐漸增加，培養(yǎng)72 h 后逐漸減少。高糖培養(yǎng)基中甘油的合成量明顯高于常規(guī)培養(yǎng)。常規(guī)培養(yǎng)條件下甘油最高達(dá)1.1 g/L，而高糖培養(yǎng)時(shí)甘油產(chǎn)量最高達(dá)2.6 g/L。

圖2 高糖培養(yǎng)和常規(guī)培養(yǎng)下蜂蜜接合酵母LGL-1積累的海藻糖（n=3）Fig.2 Trehalose accumulation in Z.mellis LGL-1 under high sugar cultivation and normal cultivation（n=3）

圖3 高糖培養(yǎng)和常規(guī)培養(yǎng)下蜂蜜接合酵母LGL-1積累的甘油（n=3）Fig.3 Glycerol accumulation in Z.mellis LGL-1 under high sugar cultivation and normal cultivation（n=3）

3.4 蜂蜜接合酵母LGL-1 中有機(jī)酸的合成

圖4是有機(jī)酸的合成圖。高糖培養(yǎng)0～6 h 時(shí)，蘋(píng)果酸、檸檬酸含量開(kāi)始增加；高糖培養(yǎng)6 h 后，蘋(píng)果酸和檸檬酸含量逐漸降低。高糖培養(yǎng)0～60 h時(shí)，α-酮戊二酸含量逐漸增加；高糖培養(yǎng)60 h 后，α-酮戊二酸含量逐漸減少。常規(guī)培養(yǎng)0～60 h，蘋(píng)果酸和α-酮戊二酸含量逐漸增加；常規(guī)培養(yǎng)60 h 后趨于穩(wěn)定。常規(guī)培養(yǎng)0～6 h，檸檬酸含量增加；常規(guī)培養(yǎng)6～84 h，檸檬酸含量趨于穩(wěn)定；常規(guī)培養(yǎng)84 h后逐漸減少；常規(guī)培養(yǎng)96 h 時(shí)檸檬酸幾乎分解殆盡。

圖4 高糖培養(yǎng)和常規(guī)培養(yǎng)下蜂蜜接合酵母LGL-1積累的有機(jī)酸（n=3）Fig.4 Organic acid accumulation in Z.mellis LGL-1 underhigh sugar cultivation and normal cultivation（n=3）

有機(jī)酸合成在高糖培養(yǎng)中明顯高于常規(guī)培養(yǎng)。高糖培養(yǎng)條件下蘋(píng)果酸、檸檬酸、α-酮戊二酸含量最高分別達(dá)452.83，73.16，23.31 mg/L，而常規(guī)培養(yǎng)蘋(píng)果酸、檸檬酸、α-酮戊二酸含量最高達(dá)160.35，26.19，17.23 mg/L。

3.5 碳代謝網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

由圖1、圖2、圖3和圖4可知，蜂蜜接合酵母LGL-1 在高糖培養(yǎng)條件下，甘油、海藻糖、乳酸和有機(jī)酸等的合成均較常規(guī)培養(yǎng)有顯著提高。蜂蜜接合酵母LGL-1 穩(wěn)定期（60～72 h）細(xì)胞生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定，來(lái)自底物葡萄糖的碳流量主要用于產(chǎn)物合成。細(xì)胞攝入葡萄糖，使其進(jìn)入中心代謝途徑[24]，一些中間代謝產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化合成與分解重組等形成細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)單體，從而構(gòu)成了細(xì)胞，其中一些反應(yīng)還涉及如FAD/FADH 和NAD（P）/NAD（P）H 等輔助因子以及ATP/ADP/AMP 的周轉(zhuǎn)[25]。此過(guò)程的碳代謝網(wǎng)絡(luò)如圖5所示，其中葡萄糖消耗速率和胞外代謝產(chǎn)物生成速率經(jīng)測(cè)定并換算為代謝通量q。Vi（i=1～13）表示未知流量。圖5中的代謝節(jié)點(diǎn)平衡式和代謝方程式見(jiàn)表1和表2[1，25]。

圖5 蜂蜜接合酵母LGL-1 在穩(wěn)定期的碳代謝網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Carbon metabolism network of Z.mellis LGL-1 at stable stage

根據(jù)所建立的代謝網(wǎng)絡(luò)和代謝流分析方法，采用Matlab 軟件對(duì)蜂蜜接合酵母LGL-1 在穩(wěn)定期（60～72 h）的代謝流分布進(jìn)行求解，如表1所示。

表1 蜂蜜接合酵母LGL-1 碳代謝節(jié)點(diǎn)的平衡方程Table1 Equilibrium equations of carbon metabolism node in Z.mellis LGL-1

表2 碳代謝網(wǎng)絡(luò)中不同代謝產(chǎn)物的化學(xué)計(jì)量關(guān)系和代謝反應(yīng)式Table2 Stoichiometric relationships and metabolic reactions of different metabolites in carbon metabolism network

表3 高糖培養(yǎng)和常規(guī)培養(yǎng)下蜂蜜接合酵母LGL-1 的代謝流分布Table3 Metabolic flux distribution of Z.mellis LGL-1 under high sugar cultivation and normal cultivation

3.6 節(jié)點(diǎn)代謝流分布

由表3可知，高糖環(huán)境下蜂蜜接合酵母LGL-1 的代謝流分布發(fā)生明顯改變。影響生成物產(chǎn)出的6 個(gè)重要代謝節(jié)點(diǎn)，即糖酵解途徑（EMP）中六磷酸葡萄糖（G6P）節(jié)點(diǎn)、丙酮酸（PYR）節(jié)點(diǎn)及由磷酸二羥丙酮（DHAP）和3-磷酸甘油醛（GAP）組成的分流節(jié)點(diǎn)，三羧酸循環(huán)（TCA）途徑中檸檬酸（CIA）節(jié)點(diǎn)、α-酮戊二酸（α-KG）節(jié)點(diǎn)和蘋(píng)果酸（MAL）節(jié)點(diǎn)。本文采用歸一法[26-28]分析代謝流分布情況，如圖6所示。

由圖6可知，與常規(guī)培養(yǎng)相比，高糖培養(yǎng)條件下蜂蜜接合酵母LGL-1 代謝網(wǎng)絡(luò)中各通量發(fā)生一定變化。代謝產(chǎn)物的節(jié)點(diǎn)分析是影響產(chǎn)物生成的關(guān)鍵。在常規(guī)培養(yǎng)（100 g/L 葡萄糖）的穩(wěn)定期，蜂蜜接合酵母LGL-1 處于擬穩(wěn)態(tài)，其碳代謝物質(zhì)的形成與消耗基本維持恒定，來(lái)自葡萄糖的碳流量有99.94%流向了DHAP＆GAP 節(jié)點(diǎn)，而有0.06%的碳流量進(jìn)入合成海藻糖的代謝途徑；在DHAP ＆ GAP 節(jié)點(diǎn)處的碳流量有97.18%進(jìn)入TCA 循環(huán)途徑，有2.82%流向了合成甘油的代謝途徑；而在PYR 節(jié)點(diǎn)處有44.36%的碳流量用于乙醇的形成，有0.02%的代謝碳流量用于乳酸的轉(zhuǎn)化，最終流向乙酰輔酶A 代謝碳流量占有55.62%；在TCA 循環(huán)途徑的各代謝節(jié)點(diǎn)中的碳流量有0.02 %用于檸檬酸的形成，0.02 %的代謝碳流量用于產(chǎn)出α-酮戊二酸，0.09%的代謝碳流量用于產(chǎn)出蘋(píng)果酸。與常規(guī)培養(yǎng)比較，高糖（400 g/L）培養(yǎng)時(shí)來(lái)自G6P 節(jié)點(diǎn)的碳流量有0.09%流向海藻糖，是常規(guī)培養(yǎng)的1.5 倍；從DHAP＆GAP 節(jié)點(diǎn)進(jìn)入三磷酸甘油形成途徑的流量為3.32%，是常規(guī)培養(yǎng)的1.18 倍。從PYR 節(jié)點(diǎn)進(jìn)入乙醇形成途徑的流量為39.58%，是常規(guī)培養(yǎng)的89.22%，流向乳酸的流量為0.01%，與常規(guī)培養(yǎng)幾乎相近，并且從該節(jié)點(diǎn)進(jìn)TCA 循環(huán)途徑的流量為60.41%，較常規(guī)培養(yǎng)增加了4.79%；在TCA 循環(huán)途徑的各代謝節(jié)點(diǎn)中，檸檬酸、α-酮戊二酸、蘋(píng)果酸處的碳流量分別為0.03%，0.02%，0.06%，與常規(guī)培養(yǎng)的碳流量相近。酵母發(fā)酵過(guò)程中存在一些可逆的反應(yīng)，代謝流作用于糖異生途徑，三羧酸途徑的有機(jī)酸積累與丙酮酸的分解動(dòng)態(tài)有關(guān)[26]。

4 結(jié)論

圖6 蜂蜜接合酵母LGL-1 在高糖培養(yǎng)（a）和常規(guī)培養(yǎng)（b）下不同節(jié)點(diǎn)處的代謝流分布Fig.6 Metabolic flux distribution of Z.mellis LGL-1 at different metabolic nodes under high sugar cultivation（a）and normal cultivation（b）

蜂蜜接合酵母LGL-1 在高糖脅迫條件下，其中心代謝途徑中各節(jié)點(diǎn)的代謝通量發(fā)生一定的變化。高糖脅迫時(shí)蜂蜜接合酵母LGL-1 碳流量偏向流入海藻糖、甘油、乙醇等形成途徑和TCA 循環(huán)的代謝支路，與常規(guī)培養(yǎng)相比，海藻糖、甘油和TCA 循環(huán)的通量分別增加了50.00%，17.73%和4.79%，乙醇的代謝通量接近。在高糖條件下蜂蜜接合酵母LGL-1 細(xì)胞中甘油、海藻糖產(chǎn)出通量的變化和進(jìn)入TCA 循環(huán)的碳流量變化也反映了其對(duì)酵母細(xì)胞的重要保護(hù)功能。通過(guò)對(duì)蜂蜜接合酵母LGL-1 在高糖脅迫下中心代謝途徑中各節(jié)點(diǎn)的代謝通量的分析，可為釀酒酵母在高糖脅迫條件下的理化特性和應(yīng)激代謝機(jī)制研究提供理論依據(jù)。