張婷婷 蒲云峰 侯福榮 劉 懿 葉興乾 劉東紅，2*

（1 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院 杭州310058 2 浙江大學(xué)馥莉食品研究院 杭州310058）

現(xiàn)階段，中國的蘋果加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，蘋果產(chǎn)能、規(guī)模居世界首位，這與其資源及成本優(yōu)勢(shì)密不可分[1-2]。中國蘋果加工主要產(chǎn)品為果汁飲料以及濃縮果汁[3]，其中，蘋果汁的產(chǎn)品有蘋果清汁、蘋果濁汁以及蘋果濃縮汁三大類[4-5]。由于果膠、蛋白質(zhì)以及纖維素等含量較高，濁汁的營養(yǎng)價(jià)值高于清汁[6]，所以受到越來越多消費(fèi)者的歡迎。

多酚氧化酶（PPO）參與引起的酶促褐變是蘋果汁加工和貯藏過程中面臨的主要難題之一[7]。在預(yù)防蘋果汁褐變方面，研究人員采用物理[8-11]、化學(xué)[12-13]、生物[14-17]方法對(duì)鮮榨蘋果汁進(jìn)行處理，均產(chǎn)生一定效果。然而，趙光遠(yuǎn)等[4]研究發(fā)現(xiàn)，約85%蘋果汁褐變發(fā)生在打漿過程，在氧氣存在下，多酚氧化酶快速將多酚化合物催化為醌，由于其不穩(wěn)定性，無色的醌類物質(zhì)進(jìn)一步聚合轉(zhuǎn)化為黑色素[18]，因此，在蘋果破碎前進(jìn)行滅酶處理極為重要。

微波是一種頻率范圍在300 MHz 到300 GHz的電磁波，頻率越低，穿透力越強(qiáng)，因其能顯著縮短烹調(diào)時(shí)間以及節(jié)約能耗而被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中[19]。張少穎等[20]發(fā)現(xiàn)微波處理蘋果塊能降低多酚氧化酶活性，從而提高果汁的色值。劉素貞等[21]報(bào)道用微波對(duì)香椿進(jìn)行滅酶。關(guān)于微波預(yù)處理蘋果整果對(duì)果汁色值等品質(zhì)的影響鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)中采用微波預(yù)處理蘋果整果，研究微波預(yù)處理對(duì)蘋果汁褐變及品質(zhì)的影響，考察整果經(jīng)微波預(yù)處理后蘋果汁的褐變指數(shù)、PPO 活性、酚含量等變化，為果汁加工提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選擇成熟度相同，外觀無損傷及明顯病蟲害，大小均勻，質(zhì)量范圍在200～250 g 的中等大小新鮮富士蘋果，洗凈待用。

交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮（PVPP，USP 級(jí)）、2,6-二氯靛酚鈉鹽水合物（＞95.0%）、Triton X-100（生化級(jí)）、聚乙二醇6000，阿拉丁公司；福林酚試劑（生化試劑）、三水合乙酸鈉（分析純）、二水合草酸（優(yōu)級(jí)純）、鄰苯二酚（化學(xué)純）、無水碳酸鈉（分析純）、醋酸（優(yōu)級(jí)純）、濃鹽酸（優(yōu)級(jí)純）、氯化鐵（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水溶性維生素E（Trolox）、2, 2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、2, 4, 6-三（ 2-吡啶基）三嗪（TPTZ），美國Sigma 公司。

1.2 設(shè)備與儀器

JYL-D022 型多功能全自動(dòng)果汁機(jī)，九陽股份有限公司；微波爐（w25800k-01AG），寧波方太廚具有限公司；PHS-550 型pH 計(jì)，陸恒生物；1510型全波長酶標(biāo)儀，Thermo Fisher；超聲波清洗裝置（50Hz，功率240 W），深圳市吉利特超聲洗凈設(shè)備有限公司；TA.XT2i 質(zhì)構(gòu)儀，北京微訊超技儀器技術(shù)有限公司；H7650 型透射電子顯微鏡，日本Hitachi公司；SU-8010掃描電子顯微鏡，日本Hitachi 公司；UV-2550 紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；ColorFlex EZ 色差儀，鼎韻中國公司；HAAKE RheoSterss 6000流變儀，Thermo Fisher Scientific。

1.3 方法

1）微波滅酶處理 將新鮮蘋果洗凈，置于微波爐中，微波處理后迅速置4 ℃冰箱冷卻30 min。加入與蘋果等質(zhì)量的水，切塊、去核、打漿，4 層紗布擠壓過濾，得蘋果濁汁。

2）傳統(tǒng)熱滅酶處理 參考胡秦佳寶[22]的方法，新鮮蘋果洗凈、切塊、去核、打漿，蘋果∶水質(zhì)量比1∶1，85 ℃熱水浴滅酶15 min，4 層紗布過濾，得蘋果濁汁。

經(jīng)過大量預(yù)試驗(yàn)，選定微波條件800 W，140 s【該條件處理后蘋果中心溫度為（96.2±2.0）℃，冷卻30 min 后中心溫度（52.3±3.2）℃）】，與傳統(tǒng)熱滅酶組進(jìn)行對(duì)比，未處理的樣品作為空白組（記為CK）。

1.3.1 色澤的測(cè)定[23]采用色差儀測(cè)定30 mL 果汁的L*、a*、b*值。褐變指數(shù)BI 計(jì)算公式為：

式中：X=（a*+1.75L*）/（5.645L*+a*-3.012b*）。

1.3.2 多酚氧化酶的測(cè)定 參考曹建康[24]的方法。取5 mL 提取緩沖液（含1 mm PEG、4% PVPP和1% Triton X-100）于10 mL 果汁中，搖勻，在4℃下離心10 min，取上清液100 L 加入3 mL 0.2 mol/L 鄰苯二酚緩沖液，于波長420 nm 處測(cè)定吸光度的變化。以每升樣品每分鐘吸光度變化值增加1 為1 個(gè)活性單位。

1.3.3 總酚含量的測(cè)定[25]稱取10 mL 果汁與20 mL 甲醇勻漿，定容50 mL，然后超聲30 min，離心備用。在10 mL 試管中，先加0.6 mL 提取液，然后加1 mL 福林酚試劑，混勻靜置5 min，加3 mL 0.1 mol/L 碳酸鈉，最后用蒸餾水定容，充分混勻后避光反應(yīng)2 h，于波長760 nm 處測(cè)定吸光值。

1.3.4 可溶性醌含量的測(cè)定[26]取1.3.3 節(jié)離心后的上清液于437 nm 處測(cè)其吸光度。

1.3.5 抗氧化能力的測(cè)定

1.3.5.1 FRAP 法 準(zhǔn)確移取20 L 樣液于96 孔板中，加入配好的150 L TPTZ 工作液，37 ℃震蕩反應(yīng)10 min，測(cè)定波長593 nm 處的吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的總抗氧化能力，結(jié)果用等價(jià)抗氧化能力TEAC（Trolox Equialent Antioxidant Capacity）表示（TEAC，mg/L）。

1.3.5.2 ABTS 法 準(zhǔn)確移取20 L 樣液于96 孔板中，加入配好的170 L ABTS 工作液，37 ℃震蕩反應(yīng)10 min，測(cè)定波長734 nm 處的吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的總抗氧化能力，結(jié)果用等價(jià)抗氧化能力TEAC（Trolox Equialent Antioxidant Capacity）表示（TEAC，mg/L）。

1.3.6 抗壞血酸（VC）含量的測(cè)定 采用2，6-二氯靛酚鈉法[27]。

1.3.7 可溶性固形物（TSS）含量的測(cè)定 參考曹建康[24]的方法。

1.3.8 可滴定酸（TA）含量的測(cè)定 參考曹建康[24]的方法，結(jié)果以蘋果酸（Malic）計(jì)，單位g MA/L。

1.3.9 高效液相法測(cè)定果汁中酚類化合物含量樣品儲(chǔ)備液的制備：上述總酚測(cè)定粗提取液經(jīng)0.22 μm 的濾膜過濾得樣品儲(chǔ)備液。

色譜條件：色譜柱：Spursil C18（250 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相：V甲酸∶V甲醇=20 ∶80；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；流速：0.7 mL/L；流動(dòng)相梯度洗脫條件見表1[28]。

1.3.10 黏度的測(cè)定 用流變儀測(cè)定果汁的黏度。幾何測(cè)量：P60 Ti L；間隙：1.000 mm；剪切速率：0.1～500/s；溫度：25 ℃。

1.3.11 微觀結(jié)構(gòu)觀察 通過掃描電鏡及透射電鏡觀察打漿后蘋果果肉的微觀結(jié)構(gòu)，與空白組和傳統(tǒng)對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，觀察細(xì)胞形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。掃描電鏡：采用濺射鍍膜法對(duì)樣品表面鍍金，放大5 000 倍觀察。透射電鏡：參考李桂峰[29]的方法，放大20 000 倍觀察。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)各處理均重復(fù)3 次，求其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，結(jié)果用x±s 表示。用SPSS 軟件進(jìn)行方差分析及顯著性分析。

表1 梯度洗脫程序Table1 Gradient elution steps

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅酶處理對(duì)蘋果汁褐變及品質(zhì)的影響

由表2可知，在TSS、TA、pH 方面，微波與傳統(tǒng)熱滅酶組無顯著差異（P＞0.05）。微波與傳統(tǒng)組VC 含量差異不顯著（P＞0.05）。在PPO 活性方面，經(jīng)微波預(yù)處理的蘋果汁，PPO 活性顯著低于傳統(tǒng)組（P＜0.01）。作為酶促褐變的氧化產(chǎn)物，果汁中醌的產(chǎn)生在一定程度上意味著其內(nèi)部黑色素的形成，而微波處理樣品可溶性醌的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其它兩組處理（P＜0.01）。在總酚含量方面，微波組總酚含量約為傳統(tǒng)組的1.5 倍，這可能由于微波預(yù)處理可鈍化PPO 酶活性，從而減少酚類底物被氧化。此外，微波處理可能破壞細(xì)胞壁，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)大量溶出，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)酚類物質(zhì)的釋放，從而增加果汁中酚類物質(zhì)含量。B Naderi 等[30]比較微波與傳統(tǒng)熱滅酶處理對(duì)山茱萸汁的影響，發(fā)現(xiàn)微波組總酚含量顯著高于傳統(tǒng)組。Xu 等[31]比較微波處理與傳統(tǒng)烹調(diào)煎炸處理對(duì)紫甘藍(lán)的影響，發(fā)現(xiàn)微波處理能夠保留更高的VC 及總酚含量。這可能與微波縮短烹調(diào)時(shí)間密切相關(guān)。本試驗(yàn)采用FRAP法和ABTS 法評(píng)價(jià)果汁的抗氧化性。由表2可知，傳統(tǒng)組和微波組采用FRAP 法測(cè)得的果汁抗氧化能力值分別是（112.45 ± 9.12）TEAC，mg/L 和（413.96±10.54）TEAC，mg/L；采用ABTS 法測(cè)得的抗氧化能力值分別是（482.02 ± 11.43）TEAC，mg/L 和（660.61 ± 18.00）TEAC，mg/L，可見微波處理能夠顯著提高果汁的抗氧化能力（P＜0.05）。在微波加熱過程中，色素降解、抗壞血酸氧化、酶促褐變以及非酶褐變等均影響加工過程中食物的顏色[32]。通過對(duì)圖1的觀察及對(duì)表2中褐變指數(shù)BI的分析可知，微波預(yù)處理能顯著改善蘋果汁色澤，抑制蘋果汁的褐變。這與微波預(yù)處理蘋果整果，減少了蘋果內(nèi)部酚類物質(zhì)與外界空氣接觸，且微波引起的快速升溫能迅速滅活多酚氧化酶有關(guān)。

表2 不同滅酶處理對(duì)蘋果汁品質(zhì)的影響Table2 Effect of different enzyme inactivation treatment on quality of apple juice

2.2 不同滅酶處理對(duì)蘋果汁黏度的影響

根據(jù)Stock 理論，果汁黏度越大，越不利于果汁顆粒的聚集沉降[4]。果汁的黏度與其果膠含量密切相關(guān)，而熱處理能夠增加果膠溶出，提高果汁穩(wěn)定性。由圖2可知，微波組黏度顯著高于傳統(tǒng)組（P＜0.05）。這可能是因?yàn)槲⒉A(yù)處理引起溫度升高，從而導(dǎo)致果膠溶出[33]。

圖1 不同滅酶處理對(duì)蘋果汁色澤的影響Fig.1 Effect of different enzyme inactivation treatment on color of apple juice

圖2 不同滅酶處理對(duì)蘋果汁黏度的影響Fig.2 Effect of different enzyme inactivation treatment on viscosity of apple juice

2.3 不同滅酶處理對(duì)蘋果汁主要酚類化合物含量的影響

蘋果中主要的酚類化合物可以分為黃酮苷（類黃酮、槲皮素及槲皮素化合物）、兒茶素和表型兒茶素、花青素、二氫查耳酮（根皮素和根皮苷）、酚酸（沒食子酸和綠原酸）以及原花青素六大類[31]。圖3a 顯示經(jīng)過傳統(tǒng)熱滅酶以及微波處理的樣品的峰形與空白對(duì)照組接近，峰高大小排序?yàn)槲⒉ǎ緜鹘y(tǒng)熱滅酶＞空白對(duì)照。此外，從表3可知，微波組中大多數(shù)酚類物質(zhì)含量顯著高于傳統(tǒng)組及CK 組，這可能由于微波破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，加速液泡內(nèi)酚類物質(zhì)的溶出，從而極大地提高了酚類物質(zhì)含量[33]。

圖3 280nm（a）、360nm（b）條件下HPLC 分析圖Fig.3 The graph of HPLC analysis at the condition of 280 nm（a）and 360 nm（b）

表3 不同滅酶處理對(duì)蘋果汁主要酚類物質(zhì)含量的影響Table3 Effect of different enzyme inactivation treatment on main single phenolic composition of apple juice

2.4 果肉細(xì)胞表面微觀結(jié)構(gòu)

采用掃描電鏡對(duì)CK 組、傳統(tǒng)組及微波組樣品進(jìn)行檢測(cè)，放大倍數(shù)為5 000 倍，如圖4所示。比較三者間的差別。圖4中，微波預(yù)處理組與CK組相比其細(xì)胞表面產(chǎn)生大量的細(xì)小裂塊，而傳統(tǒng)熱滅酶組表面無明顯變化。由此可知，微波預(yù)處理能夠破壞果肉細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)。

圖4 空白對(duì)照（a）、傳統(tǒng)熱滅酶工藝（b）、微波800w，140s（c）的掃描電鏡檢測(cè)Fig.4 Surface appearance of control（a），traditional heat preprocessed（b）and microwave processed 800 W 140 s（c）apple flesh

2.5 果肉細(xì)胞內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)

圖5 空白對(duì)照（a）、傳統(tǒng)熱滅酶工藝（b）、800W,140s（c）的透射電鏡檢測(cè)Fig.5 Microstructure of Control（a）, traditional heat preprocessed（b）and Microwave processed 800 W 140 s（c）apple flesh

采用透射電鏡，在放大倍數(shù)20 000 倍條件下對(duì)CK 組、傳統(tǒng)組及微波組進(jìn)行透射電鏡檢測(cè)，如圖5所示。由圖5a 可以看到細(xì)胞質(zhì)緊貼細(xì)胞壁，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰，原生質(zhì)包在液泡的外圍且緊貼細(xì)胞壁。由圖5b 可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞雖出現(xiàn)質(zhì)壁分離現(xiàn)象，但形狀排列無明顯變化；從圖5c 可以看到明顯的質(zhì)壁分離現(xiàn)象，原生質(zhì)進(jìn)入液泡，細(xì)胞器完全解體。由此得出，與傳統(tǒng)熱滅酶工藝處理相比，微波預(yù)處理能夠破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)物質(zhì)的溶出，這可能由于微波較高的電場(chǎng)強(qiáng)度以及高溫導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，從而使細(xì)胞內(nèi)容物質(zhì)泄漏[19]。

3 結(jié)論

采用微波800 W，140 s 處理蘋果整果，在隔絕氧氣的條件下，降低或鈍化蘋果中多酚氧化酶酶活，抑制蘋果汁褐變，保護(hù)果汁色澤[34]。微波功率800 W，處理時(shí)間140 s 的樣品，褐變指數(shù)約為傳統(tǒng)熱滅酶的50%。該方法與傳統(tǒng)熱滅酶相比，果汁中的酚類物質(zhì)含量更高，果汁抗氧化能力更強(qiáng)，這可能由于酚類化合物主要以結(jié)合態(tài)形式存在且與果蔬的細(xì)胞壁相連，而微波預(yù)處理可快速破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)結(jié)合態(tài)酚類化合物的釋放[35]。此外，微波預(yù)處理組蘋果汁黏度更高、穩(wěn)定性更好。由此可見，微波處理蘋果整果是一種有潛力的加工方式。然而，微波處理的非均一性是今后微波技術(shù)的缺陷，且不同微波條件預(yù)處理對(duì)蘋果汁色澤等品質(zhì)的影響以及不同酚類物質(zhì)含量的變化機(jī)理還有待深入研究。