江麗春, 李群, 呂頌輝

海洋生物學

廣西潿洲島底棲甲藻前溝藻屬()種類的形態(tài)學和系統(tǒng)發(fā)育學研究

江麗春, 李群, 呂頌輝

暨南大學生命科學技術(shù)學院, 水體富營養(yǎng)化與赤潮防治廣東普通高校重點實驗室, 廣東 廣州 510632

本文對采集自我國廣西潿洲島海域潮下帶大型海藻及死珊瑚上的附著底棲甲藻樣品進行了分析。利用毛細管單細胞分離方法成功分離并培養(yǎng)了多株前溝藻屬種類, 運用光學顯微鏡、掃描電鏡和分子生物學等技術(shù), 對所獲得的前溝藻株系進行形態(tài)學和系統(tǒng)發(fā)育分析, 鑒定出前溝藻屬3個種, 分別為具蓋前溝藻()、瑪氏前溝藻()和強壯前溝藻(), 其中具蓋前溝藻和瑪氏前溝藻為我國新紀錄種。分析比較了不同種類間形態(tài)和系統(tǒng)發(fā)育的差異, 發(fā)現(xiàn)3種前溝藻的形態(tài)特征大體與相應模式種報道的一致。本研究豐富了我國前溝藻種類多樣性和系統(tǒng)發(fā)育進化信息, 同時將兩個新記錄種具蓋前溝藻和瑪氏前溝藻的已知分布范圍拓展到了我國南部沿海水域。

潿洲島; 前溝藻; 形態(tài)學; 系統(tǒng)發(fā)育

前溝藻屬()隸屬于甲藻綱(Dinophyceae), 裸甲藻目(Gymnodiniales) (Fensome et al, 1993)。該屬形態(tài)特征為無甲板, 細胞小型到大型, 細胞形狀有球形、陀螺形或雙錐形; 細胞背腹或左右略扁, 腹面觀中上錐部呈月牙形或三角形偏向左側(cè), 下錐部橢圓形或錐形; 橫溝在前部, 具或不具位移, 縱溝開始于縱向鞭毛孔往細胞底部走向, 橫縱溝間有腹側(cè)脊。

前溝藻分布廣泛, 大多分布于熱帶和亞熱帶海域, 為兼性底棲和浮游的甲藻類群(Murray et al, 2002; J?rgensen et al, 2004a)。前溝藻附生在大型海藻、海草和珊瑚等底棲生境, 是海洋有害底棲甲藻類群之一, 常伴隨有毒的岡比亞藻()(Rhodes et al, 2010)。某些前溝藻種類會產(chǎn)生有害的環(huán)脂類細胞毒素或溶血性毒素(Yasumoto et al, 1987; Maranda et al, 1996), 如強壯前溝藻產(chǎn)生的環(huán)脂類細胞毒素會加劇西加魚中毒, 導致魚類死亡, 該種藻細胞裂解物還會抑制海膽發(fā)育(Baig et al, 2006)。部分前溝藻屬種類也會產(chǎn)生一些有益的物質(zhì), 如具蓋前溝藻會產(chǎn)生兩性霉素(amphidinols)、兩性霉素內(nèi)酯(amphidinolides)和卡比內(nèi)酯(caribenolide)等物質(zhì)(Kobayashi et al, 1991; Satake et al, 1991; Bauer et al, 1995a), 兩性霉素內(nèi)酯顯示出潛在的抗腫瘤活性, 且已用于抗白血病藥物的研發(fā)(Bauer et al, 1994, 1995b)。

前溝藻屬分類的早期研究是通過對野外采集的樣品進行固定, 再用光學顯微鏡觀察, 由于很多形態(tài)結(jié)構(gòu)特征模糊不清(Daugbjerg et al, 2000), 研究者經(jīng)常通過橫溝截距與縱溝偏距、上下錐部的相對大小等形態(tài)特征進行種類區(qū)分(Claparède, 1858; Kofoid et al, 1921)。隨著研究的深入, 人們認識到有些種類形態(tài)特征重疊, 不易區(qū)分, 因此基于形態(tài)學特征并結(jié)合分子系統(tǒng)發(fā)育分析對前溝藻屬進行分類是近年常用的新方法。在最初的系統(tǒng)分類中, 前溝藻屬種類被分在裸甲藻屬(), 隨著分子系統(tǒng)發(fā)育學分析方法的發(fā)展與應用, 系統(tǒng)發(fā)育研究不支持裸甲藻科(Gymnodiniaceae)的單一性(Daugbjerg et al, 2000), 也不支持前溝藻屬與裸甲藻科其他屬的近緣關(guān)系(Murray et al, 2004)。目前前溝藻屬種類繁多, 形態(tài)多樣性和物種多樣性豐富, 生活方式多樣, 包括異養(yǎng)、光合自養(yǎng)和混合營養(yǎng)等物種(Daugbjerg et al, 2000)。該屬許多種類形態(tài)特征相似, 同種變形也較多, 導致很多種類在形態(tài)上分類模糊, 如瑪氏前溝藻(Biecheler, 1952)和強壯前溝藻(Hulburt, 1957)的細胞大小及形狀基本一致, 且都擁有位于細胞中間偏左前部位的蛋白核, 使得兩者有時被誤認為是同一個種。大小、代謝運動和囊泡形成等特征(Kofoid et al, 1921; Murray et al, 2004), 但代謝運動和囊泡形成在后來報道的()。由于該屬許多種形態(tài)特征相似, 導致分類困難, 因此有必要利用不同的細胞形態(tài)特征進行分類(J?rgensen et al, 2004a, b)。

前溝藻分布廣, 生存能力強, 在世界各地被頻繁報道, 而在我國目前僅于海南島和膠州灣水域發(fā)現(xiàn)了強壯前溝藻(韓笑天等, 2004)。我國研究者對前溝藻的相關(guān)研究主要集中在該屬代表性種類強壯前溝藻的生理生化及代謝產(chǎn)物方面的研究(張珍妮等, 2016; Kong et al, 2016), 而對于該屬的分類學和系統(tǒng)學研究還未見報道。本研究采集了我國廣西北部灣潿洲島的底棲藻類樣品, 分離篩選疑似前溝藻藻株, 通過顯微和超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學觀察, 同時基于rDNA分子序列分析, 對前溝藻種類進行分類鑒定, 并通過構(gòu)建分子進化樹, 闡明種類之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與藻株分離培養(yǎng)

于2017年4月在廣西潿洲島(21°N, 109°E)選擇三個采樣點(圖1), 檢測并記錄這三個采樣點的光照強度、水溫和海水鹽度等信息。于潮間帶或潛水至潮下帶采集大型藻、海草和死珊瑚等底棲甲藻附著基質(zhì), 放入1L的塑料瓶中, 搖晃塑料瓶使藻細胞與附著基質(zhì)脫離, 用直徑2mm的篩網(wǎng)(10目, 大連晉豐篩網(wǎng)有限公司, 中國大連)粗過濾, 取過濾后的樣品于倒置顯微鏡下用毛細管挑取單個藻細胞于96孔培養(yǎng)板(Corning, New York USA)中培養(yǎng), 培養(yǎng)條件: 溫度25±1℃, 鹽度30‰, L1培養(yǎng)基, 光照周期為12L : 12D, 光強為150μmol·m2·s–1。單細胞藻株建立后轉(zhuǎn)移到同等條件的三角瓶中培養(yǎng)。

1.2 實驗方法

1.2.1 藻類形態(tài)學觀察

1.2.1.1 光學顯微鏡觀察

取對數(shù)生長期藻細胞于正置顯微鏡(Olympus BX 61, Tokyo, Japan)下觀察, 使用QImaging Retiga 4000R數(shù)碼相機(QImaging, Surrey, British Columbia, Canada)進行藻細胞形態(tài)采集, 使用Image-Pro Plus 6.0圖像采集測量新保存樣品的細胞大小, 統(tǒng)計細胞的長度、寬度等形態(tài)學數(shù)據(jù)。

圖1 廣西潿洲島底棲甲藻采樣站位圖

W1為滴水丹屏、W2為鱷魚灣、W3為五彩灘; 地圖來自Surfer軟件底圖

Fig. 1 The sampling stations of benthic dinoflagellate in Weizhou Island, Guangxi

1.2.1.2 熒光顯微鏡觀察

取對數(shù)生長期活體細胞于熒光顯微鏡(Olympus BX 61, Tokyo, Japan)下利用細胞的自發(fā)熒光觀察細胞色素體形態(tài)、數(shù)量和分布, 同時取對數(shù)生長期活體細胞于離心管中, 加入戊二醛固定(終濃度為1%)后, 通過4', 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色, 避光2h之后在熒光顯微鏡下觀察細胞核的形狀、大小及位置。

1.2.1.3 掃描電子顯微鏡觀察

取對數(shù)生長期活體細胞于離心管, 用鋨酸(終濃度為2%)固定一小時, 再用注射器將固定的藻液過濾至3μm的PC濾膜(Whatman, Little Chalfont, UK)上, 并依次用梯度為100%、80%、60%、40%、20%的海水和純水緩慢沖洗以除去鹽與固定劑, 再用10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%的丙酮脫水, 每個梯度洗滌和脫水用液體積為4ml, 時間為4min。將脫水后的細胞進行CO2臨界點干燥(Leica Microsystems, Mannheim, Germany), 取出干燥后帶細胞的PC濾膜將其貼在帶導電膠的銅臺上, 經(jīng)離子濺射儀(SCD 005, Bal-Tec, or Leica EM SCD 500, Leica, Wetzlar, Germany)噴金, 最后在掃描電子顯微鏡下(Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Germany)觀察細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)并拍照。

1.2.2 DNA提取, PCR擴增和測序

離心收集對數(shù)生長期細胞藻液, 使用DNA 提取試劑盒(Takara MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit), 按照使用說明對前溝藻核糖體DNA進行提取。于0.2mLPCR管中, 添加如下反應體系: 0.2μL DNA、25μL TaqPCR MasterMix (Zoman Biotechnology, Beijing, China)、正向引物與反向引物各1μL、超純水22.81μL。反應過程按照試劑盒說明進行D1-D3(800~1000bp)序列擴增。最后將擴增獲得的序列產(chǎn)物送至生工生物工程股份有限公司進行測序。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

將測序所得DNA正反向序列用ContigCExpress軟件拼接查看并進行編輯。將編輯好的序列放入基因庫(GenBank)進行比對并選擇下載構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹所需的序列。使用BioEdit v7.0.5 (Hall, 1999)軟件將目標藻株提取的序列與從GenBank中下載的序列進行對比及整理切除首位多余的堿基, 利用軟件構(gòu)建Bayses樹及利用生物信息學網(wǎng)站(https://www. phylo.org/portal2/login!input.action%3bjsessionid=54E5409E35A57687C1CF8AB75AEFBBFF)構(gòu)建ML樹。Bayses樹構(gòu)建時將處理好的序列進行格式轉(zhuǎn)換及保存, 將轉(zhuǎn)換好的NEX格式文件用PAUP v4b10讀取并運行Mrmodel, 再運行Mrmodel命令選擇最佳模型, 結(jié)合最優(yōu)模型運行MrBayes v3.1.2 (Ronquist et al, 2003)進行系統(tǒng)發(fā)育分析構(gòu)建發(fā)育樹, 最后用MEGA v5.0 (Tamura et al, 2011)選擇樹形及TreeView (Page, 1996)查看并添加置信值。ML樹構(gòu)建時, 將BioEdit整理好的序列保存為phy格式, 在CIPRES網(wǎng)站創(chuàng)建新文件夾并上傳phy文件, 然后進行任務創(chuàng)建, 選擇“RAXML-HPC2 ON XSEDE”運行工具, 參數(shù)設置時先在“Maximum Hours to Run”處選擇2h, 填寫輸出數(shù)據(jù)的名字, 在數(shù)據(jù)類型中選擇“nucleotide”, 將“estimate proportion of invariable sites”選為“yes”, 打開“advancade parameters”并選擇“GTRGAMMA”, 然后選中“conduct Multiparametric Bootstrapping”,選擇“print brance lengths”, 在“Bootstrap iterations”中輸入1000, 最后保存參數(shù)。程序運行時會自動挑選出似然率最大的拓撲結(jié)構(gòu)作為最優(yōu)樹, 最后下載選好的樹形放入TreeView查看并添加置信值。

2 結(jié)果

本研究共分離鑒定出廣西潿洲島海域前溝藻屬3個種, 分別為具蓋前溝藻()瑪氏前溝藻()和強壯前溝藻(), 其中具蓋前溝藻和瑪氏前溝藻為我國新記錄種。

2.1 3種前溝藻的形態(tài)特征

2.1.1 具蓋前溝藻()形態(tài)特征

細胞呈長卵圓形, 中后部最寬, 細胞長33~48μm (40±8.0μm,=30), 寬22~37μm (29±6.2μm,=30)。長寬比為1.23~1.61 (圖2)。上錐部較小, 腹面觀中上錐部類似直角三角形。橫溝起源處到細胞上錐部頂端距離占0.1個細胞的長度, 上錐部右頂端角度接近90°, 左邊形成30°的角(圖2a、e)。下錐部左側(cè)底部往外稍凸, 右側(cè)沿著底部呈弧形, 總體呈卵圓形(圖2)。橫鞭毛從橫溝左側(cè)鞭毛孔伸出, 沿著橫溝往背側(cè)纏繞到橫溝右側(cè)(圖2a)?？v溝位于細胞下錐部偏底端1/3處(圖2a)。兩個鞭毛孔處有一條腹脊(圖2a)。葉綠體呈紅色長條形, 從中間向四周輻射排列(圖2g、h), 細胞中未見蛋白核。細胞核位于細胞下錐后部, 呈圓形或卵圓形, 直徑為10~16μm (圖2g)。橙黃色的眼點位于核上方(圖2e), 直徑為5~7μm。橫鞭毛與縱鞭毛孔處各有一個泡(圖2e), 直徑2μm左右。

圖2 具蓋前溝藻掃描電鏡圖(a—d)與光鏡圖(e—l)

a. 腹面觀, 箭頭指向橫鞭毛孔; b. 背面觀; c. 底面觀; d. 二分裂細胞; e. 腹面觀, 黑色箭頭指向囊泡, 白色箭頭指向眼點; f. 黑色箭頭指向眼點; g. 細胞核; h. 葉綠體形狀分布; i—k. 不同形狀的具蓋前溝藻; l. 二分裂細胞。各圖比例尺為10μm

Fig. 2 Scanning electron micrographs (a-d) and light micrographs (e-l) of. a) Ventral view; b) dorsal view; c) antapical view; d) binary division cell; e) ventral view, with black arrow pointing to the pusule and white arrow pointing to the eyespot; f) black arrow pointing to the eyespot; g) nucleus; h. distribution and shape of chloroplast; (i-k)with different shapes; l) binary division cell. Scale bars in a–l: 10 μm

2.1.2 瑪氏前溝藻()形態(tài)特征

細胞呈卵圓形, 背腹扁平。細胞長10~16μm (13±3.0μm,=30), 寬7~12μm (9±2.5μm,=30), 長寬比為1.28~1.88 (圖3)。腹面觀中上錐部呈月牙形, 頂部彎向左側(cè)(圖3e、f)。橫溝起源處到細胞上錐部頂端距離占0.2個細胞的長度。下錐部呈卵圓形(圖3e、f)。細胞表面由多邊形體鱗組成(圖3d)。橫溝從左側(cè)開始往背面環(huán)繞到右側(cè)往下延伸(圖3b、c、e、f、g)。橫鞭毛產(chǎn)生于橫溝左側(cè)鞭毛孔(圖3c)?？v溝起源于細胞腹面中部, 也是縱鞭毛伸出的部位, 縱溝往細胞底部延伸(圖3c, e)。兩個鞭毛孔之間有一條腹脊(圖3c)。細胞核直徑5~6μm, 位于下錐部底部(圖3i、j)。蛋白核直徑2~4μm, 位于細胞左前部(圖3f、g)。不同生長階段葉綠體形狀不一樣, 生長指數(shù)期呈帶小孔的網(wǎng)狀, 分散于整個細胞, 隨著細胞培育時間增長逐漸成密度低的稀疏網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖3k—m)。細胞分裂是在運動的細胞中以二分裂的形式進行的(圖3h)。

圖3 瑪氏前溝藻掃描電鏡圖(a—d)和光鏡圖(e—m)

a. 背面觀; b. 側(cè)面觀; c. 腹面觀, 箭頭指向橫鞭毛孔; d. 細胞表面; e、f. 腹面觀, 箭頭指向蛋白核; g. 背面觀, 箭頭指向蛋白核; h. 二分裂細胞; i、j. 細胞核; k—m. 葉綠體形態(tài)分布; a—c、e—m比例尺為5μm, d為2μm

Fig. 3 Scanning electron micrographs (a-d) and light micrographs (e-m) of. a) Dorsal view; b) side view; c) ventral view, with arrow pointing to the pore of transverse flagellum; d) surface of cell; (e-f) ventral view, with arrow pointing to the pyrenoid; g) dorsal view, with arrow pointing to the pyrenoid; h) binary division cell; (i-j) nucleus; (k-m) distribution and shape of chloroplast. Scale bars in a-c and e-m: 5 μm; d: 2 μm

2.1.3 強壯前溝藻()形態(tài)特征

細胞呈卵圓形, 背側(cè)扁平, 腹側(cè)卵圓形且底部左偏(圖4a、b、e、f)。細胞長12~19μm (15±3.0μm,=30), 寬9~14μm (11±2.8μm,=30), 長寬比1.18~1.67。腹面觀察中上錐部呈月牙形, 頂部向左側(cè)彎曲(圖4a、e)。橫溝起源處到細胞上錐部頂端距離占0.2個細胞的長度(圖4a)。腹面觀察下錐部左側(cè)呈直線形, 右側(cè)底部呈弧線形(圖4a、e)?？v溝起始于細胞腹面中間位置。腹側(cè)脊粗短連接兩個鞭毛孔。細胞核圓形或卵圓形, 位于細胞下錐部后部(圖4g)。環(huán)狀淀粉鞘蛋白核位于細胞中間或稍偏前部位(圖4e、f), 直徑約3μm。葉綠體呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu), 遍布整個細胞, 密度較高(圖4h)。3個前溝藻種的形態(tài)特征比較見表1。

表1 3個前溝藻種形態(tài)特征比較

圖4 強壯前溝藻掃面電鏡圖(a—d)和光鏡圖(e—h)

a. 腹面觀, 箭頭指向鞭毛孔; b. 背面觀; c. 上錐部背面觀; d. 細胞表面; e. 腹面觀, 箭頭指向蛋白核; f. 背面觀, 箭頭指向蛋白核; g. 細胞核; h. 葉綠體形態(tài)分布

Fig. 4 Scanning electron micrographs (a-d) and light micrographs (e-h) of. a) Ventral view, with arrow pointing to the pore of flagellum; b) dorsal view; c) the dorsal view of epicone; d) surface of cell; e) ventral view, with arrow pointing to the pyrenoid; f) dorsal view, with arrow pointing to the pyrenoid; g) nucleus; h) the distribution and shape of chloroplast

2.2 大亞基核糖體序列分析和系統(tǒng)發(fā)育

對采集的前溝藻藻株進行LSU rDNA D1-D3序列測序分析, 與基因庫前溝藻屬中的46個已發(fā)表序列進行比對, 選取血紅哈卡藻()作為外類參考, 利用Mega和MrBayes建立系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)。本研究獲得的具蓋前溝藻WZD225株、瑪氏前溝藻3WZD7株和強壯前溝藻3WZD8株系在NCBI上對應的序列號分別為MN622810、MN622808和MN622809。在ML和Bayes系統(tǒng)發(fā)育樹中個別節(jié)點難以確定, 但主干拓撲結(jié)構(gòu)基本一致。本研究中3個株系的前溝藻序列與其他46個發(fā)表的藻株序列形成4個大的進化分支, 分支節(jié)點處的數(shù)字分別代表Bayes/ML樹中此節(jié)點的置信值。進化枝A與B、C、D分支間的置信值為1.00/-, 且在進化枝A的8個藻株序列間具有強的置信值(＞1.00/85); 進化枝B是具蓋前溝藻種, 由已報道的四個株AY455674、AY460590、AY460591、AY460592和本研究的WZD225株系組成, 置信值高達100/1.00, MN622810與序列AY460591、AY460592中度置信值為0.80/54, 且均相差19個堿基對, 相似度為98%, 與AY460590的置信值僅為0.78/-; 進化枝C由不同的前溝藻種組成, 并被分為兩個亞類, 第一個亞類由、和三個種組成, 且此三個種具有高的置信值(1.00/75), 第二個亞類進一步分成兩個譜系, 3WZD7在第二個譜系上屬于瑪氏前溝藻, 其與JQ394808相差2個堿基對, 相似度為99%, 置信值為1.00/100, 但其與另外兩株美國瑪氏前溝藻株在不同的姐妹進化枝上; 進化枝D具有高強度的置信值(1.00/99), 分成三個亞類, 其中一個亞類包含強壯前溝藻株系AY460586和株系KY697957, 本研究中3WZD8在第二個亞類中形成獨立的姐妹分支, 但其與另外5個強壯前溝藻株系AY460578、AY460583、AY460580、AY460584和AY460579支持度為1.00/100, 相似度均達到99%。

3 討論

前溝藻種之間的形態(tài)學特征相似, 易引起分類學混淆(J?rgensen et al, 2004a, b; Murray et al, 2004)。研究表明, 在實驗室觀察有限數(shù)量的細胞時, 不同種難以通過一些重要的形態(tài)學特征(如細胞形狀、大小、葉綠體結(jié)構(gòu)和泡等)區(qū)分開(Fukuyo, 1981)。具蓋前溝藻最初因形態(tài)特征不確定及與相似物種難以區(qū)分而被命名為具蓋前溝藻復合體(Murray et al, 2004)。具蓋前溝藻潿洲島株WZD225的形態(tài)特征與具蓋前溝藻模式種基本相似, 兩個鞭毛插入位置各有一個泡, 無環(huán)狀淀粉鞘蛋白核, 略微的差異是WZD225株橫溝到上錐部頂端距離與細胞長度的比率為0.1, 與Murray等 (2004)報道的模式種為0.3有所不同。而本屬其他種如、、和瑪氏前溝藻都具有環(huán)狀淀粉鞘蛋白核, 另外具蓋前溝藻與的不同除了細胞形狀外, 具蓋前溝藻細胞分裂不在囊泡中進行; 具蓋前溝藻與的細胞形狀也不同,細胞右側(cè)凸起下部尖端, 呈駝背形狀(Murray et al, 2004)。

圖5 前溝藻屬LSU rDNA(D1-D3)的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹

節(jié)點數(shù)字代表貝葉斯分析法的后驗概率(左)和最大似然法分析的置信值(右), 50%以下的置信值已省略

Fig. 5 Bayesian inference (BI) tree of the LSU rDNA (D1-D3 regions) ofspecies. The number on the branch is the Posterior probabilities for BI analysis (left) and bootstrap values for maximum likelihood analysis (right). Support values below 50% have been omitted

瑪氏前溝藻潿洲島株3WZD7與模式種形態(tài)相似(Murray et al, 2004, 2012)?，斒锨皽?WZD7株葉綠體不同生長階段形狀會稍有不同, Murray等 (2012)和Lee等(2013)均證實了這一點, 指數(shù)生長期葉綠體多數(shù)呈帶小孔的網(wǎng)狀, 分散于整個細胞, 隨著細胞培養(yǎng)時間增長其逐漸成密度低的稀疏網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)?，斒锨皽?WZD7株系細胞表面及鞭毛區(qū)均有體鱗存在, 而有研究報道sp. HG114、HG115、瑪氏前溝CS-259、、spp.和表面也有體鱗, 但其鞭毛處體鱗尚未報道(Morrill et al, 1981; Watanabe et al, 1990; Sekida et al, 2003; Tamura et al,2009; Murray et al, 2012)。在韓國濟州島報道的瑪氏前溝細胞表面也存在體鱗(Lee et al, 2013), 所以藻株細胞表面及鞭毛體鱗的發(fā)現(xiàn)也可能是一個重要的分類特征。

強壯前溝藻首次發(fā)現(xiàn)時被誤認為是(Carter, 1937), 后來對其細胞大小和葉綠體形狀進行研究后, 將其分為新的種強壯前溝藻 (Hulburt, 1957)。Dodge等 (1968)對強壯前溝藻進行了詳細的超微結(jié)構(gòu)研究, 發(fā)現(xiàn)其與和的大小范圍略有重疊, 并與瑪氏前溝藻基本一致。強壯前溝藻與區(qū)別在于形狀和分裂方式, 強壯前溝藻不通過分裂囊泡進行分裂。強壯前溝藻與區(qū)別是強壯前溝藻上錐部相對較長(Murray et al, 2004)。本研究分離的強壯前溝藻株與瑪氏前溝藻株細胞大小和形狀上基本一致, 區(qū)分這兩個種的形態(tài)特征依據(jù)是葉綠體的形狀, 在瑪氏前溝藻中不同生長階段葉綠體形狀會稍有不同, 而在強壯前溝藻中葉綠體分布于細胞內(nèi)呈稀疏網(wǎng)狀, 這種結(jié)構(gòu)在強壯前溝藻的所有基因型和生長階段均一致。另外在瑪氏前溝藻細胞表面和鞭毛上存在體鱗, 且這一特征在Murray等 (2012)和Lee等(2013)的文獻中均有描述, 而強壯前溝藻暫未發(fā)現(xiàn)文獻報道其體表與鞭毛區(qū)有體鱗存在。

前溝藻的分類雖結(jié)合了形態(tài)學、分子系統(tǒng)發(fā)育和進化等信息來開展(Vila et al, 2001; Garcés et al, 2006), 但仍存在一些問題, 像個別種如在不同的生命階段細胞形態(tài)變化較大, 可從心形到駝峰形不等(Murray et al, 2004), 這一形態(tài)特征變化導致該種鑒定的困難, 而本研究的三個種, 具蓋前溝藻、強壯前溝藻和瑪氏前溝藻, 在不同生命階段細胞表面形態(tài)特征基本穩(wěn)定(Murray et al, 2004, 2012), 故在種類鑒定時均選擇生長狀態(tài)良好的細胞作為研究對象。另外由于前溝藻屬為無甲板類的裸甲藻, 在其囊泡中缺乏厚纖維素板(Truby, 1997), 故在掃描電子顯微鏡拍攝的前處理如樣品固定、脫水等過程中細胞極易產(chǎn)生形變, 從而導致某些細胞特征難以觀察或丟失(Re?é et al, 2015)。為解決形態(tài)鑒定時樣品處理對前溝藻形態(tài)觀察帶來的困難, 本研究對Botes等人的方法進行了修改, 相比Botes等人將固定的樣品用聚-L-賴氨酸粘附到玻璃片上, 本研究是將鋨酸固定的樣品直接過濾到PC濾膜上, 并發(fā)現(xiàn)在PC濾膜上的細胞表面更干凈, 粘附的雜質(zhì)更少(Botes et al, 2002)。另外在樣品脫水處理過程中, 本研究對比了梯度丙酮與梯度乙醇的脫水效果, 發(fā)現(xiàn)乙醇脫水后的樣品皺縮較嚴重, 而丙酮脫水后的樣品皺縮不明顯, 特別是在瑪氏前溝藻的鑒定時, 丙酮脫水后的樣品能更清楚的顯示細胞體鱗結(jié)構(gòu)。

具蓋前溝藻因形態(tài)特征變異性導致其在命名上一直存有爭議, 分子遺傳數(shù)據(jù)的使用有助于解決這種形態(tài)特征上難以進行種類鑒定的問題(J?rgensen et al, 2004a)。本研究中具蓋前溝藻在系統(tǒng)發(fā)育樹上相比其他前溝藻種, 能形成明顯的具有高置信值的系統(tǒng)進化枝, 與Murray等 (2004)關(guān)于該種在系統(tǒng)進化樹位置的研究結(jié)果一致。另外本研究獲得的具蓋前溝藻種WZD225株具有獨特的rDNA序列, 其在系統(tǒng)進化樹上形成獨立的分支。沒有已知的前溝藻物種或藻株具有與WZD225株完全相同的rDNA序列, 其與親緣關(guān)系近的藻株序列AY460591、AY460592均相差19個堿基對, 相似度為98%, 與AY460590相差12個堿基對。序列間的差異也是導致WZD225株系與模式種存在形態(tài)差異的原因。強壯前溝藻和瑪氏前溝藻形態(tài)特征相似, 除了依靠細胞表面超微結(jié)構(gòu)區(qū)分外(Murray et al, 2004), 還有一個重要的手段是系統(tǒng)發(fā)育分析, 強壯前溝藻和瑪氏前溝藻在LSU rDNA D1-D3系統(tǒng)發(fā)育樹上均表現(xiàn)出高遺傳多樣性, 且兩個種明顯在不同的進化枝上。強壯前溝藻種內(nèi)形成4個進化亞枝與Lee等 (2013)和Murray等 (2004, 2012)關(guān)于該種系統(tǒng)進化研究結(jié)果一致。強壯前溝藻進化枝上的序列包含本研究獲得的3WZD8藻株序列和來自澳大利亞、墨西哥、新西蘭、加拿大和意大利已發(fā)表的序列(Murray et al, 2004), 形態(tài)比較并未發(fā)現(xiàn)該進化枝上強壯前溝藻種內(nèi)形態(tài)特征的明顯差異, 而系統(tǒng)進化樹上4個進化亞枝的形成表明該種可能存在基因型差異。Karafas等(2017)關(guān)于瑪氏前溝藻系統(tǒng)發(fā)育研究結(jié)果表明, 瑪氏前溝藻物種遺傳多樣性高于強壯前溝藻, 而本研究鑒定出的瑪氏前溝藻藻株序列與已發(fā)表的相關(guān)序列間遺傳進化的差異與Karafas的研究結(jié)果相一致。

前溝藻屬為世界性廣布種(Murray et al, 2004, 2012)。在本研究之前, 世界多個國家的不同海域已報道了具蓋前溝藻、瑪氏前溝藻和強壯前溝藻的存在(Murray et al, 2004, 2012; Lee et al, 2013)。本研究對我國亞熱帶廣西潿洲島海域強壯前溝藻和兩個新記錄種具蓋前溝藻、瑪氏前溝藻的報道擴增了該屬的全球分布范圍, 填補了我國前溝藻屬分布的空缺, 為后續(xù)進一步豐富我國前溝藻屬種類多樣性和分子生物學信息奠定了基礎。

韓笑天, 顏天, 鄒景忠, 等, 2004. 強壯前溝藻(Hulburt)形態(tài)特征及其生長特性研究[J]. 海洋與湖沼, 35(3): 279–283. HAN XIAOTIAN, YAN TIAN, ZOU JINGZHONG, et al, 2004. Morphological features and growth characteristics of the dinoflagellateHulburt[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 35(3): 279–283 (in Chinese with English abstract).

張珍妮, 姜玥璐, 李曼璐, 等, 2016. 強壯前溝藻(Hulbert)在多重逆境條件下的生長和生理響應[J]. 海洋與湖沼, 47(5): 982–989. ZHANG ZHENNI, JIANG YUELU, LI MANLU, et al, 2016. The growth and physiological changes ofHulbert under environmental stresses[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 47(5): 982–989 (in Chinese with English abstract).

BAIG H S, SAIFULLAH S M, DAR A, 2006. Occurrence and toxicity ofHulburt in the North Arabian Sea[J]. Harmful Algae, 5(2): 133–140.

BAUER I, MARANDA L, SHIMIZU Y, et al, 1994. The structures of amphidinolide B isomers: strongly cytotoxic macrolides produced by a free-swimming dinoflagellate,sp[J]. Journal of the American Chemical Society, 116(6): 2657–2658.

BAUER I, MARANDA L, YOUNG K A, et al, 1995a. Isolation and structure of Caribenolide I, a highly potent antitumor macrolide from a cultured free-swimming Caribbean dinoflagellate,sp. S1-36-5[J]. The Journal of Organic Chemistry, 60(4): 1084–1086.

BAUER I, MARANDA L, YOUNG K A, et al, 1995b. The isolation and structures of unusual 1, 4-polyketides from the dinoflagellate,sp.[J]. Tetrahedron Letters, 36(7): 991–994.

BIECHELER B, 1952. Recherches sur les Peridiniens[J]. Bulletin Biologique de la France et de la Belgique, 36 (Suppl.): 1–149.

BOTES L, PRICE B, WALDRON M, et al, 2002. A simple and rapid scanning electron microscope preparative technique for delicate “Gymnodinioid” dinoflagellates[J]. Microscopy Research and Technique, 59(2): 128–130.

CARTER N, 1937. New or interesting algae from brackish water[J]. Archives für Protistenkunde, 90: 1–68.

CLAPARèDE R é, LACHMANN J, 1859. études sur les infusoires et les rhizopodes[J]. Mémoires de l'Institut National Genevois, 6: 261–482.

DAUGBJERG N, HANSEN G, LARSEN J, et al, 2000. Phylogeny of some of the major genera of dinoflagellates based on ultrastructure and partial LSU rDNA sequence data, including the erection of three new genera of unarmoured dinoflagellates[J]. Phycologia, 39(4): 302–317.

DODGE J D, CRAWFORD R M, 1968. Fine structure of the dinoflagellateHulbert[J]. Protistologica, 4: 231–242.

DOLAPSAKIS N P, ECONOMOU-AMILLI A, 2009. A new marine species of(Dinophyceae) from Thermaikos Gulf, Greece[J]. Acta Protozoologica, 48(2): 153–170.

FENSOME R A, TAYLOR F J R, NORRIS G, et al, 1993. A classification of living and fossil dinoflagellates[J]. Micropaleontology, Special Publication, 7: 1–351.

FUKUYO Y, 1981. Taxonomical study on benthic dinoflagellates collected in coral reefs[J]. Nippon Suisan Gakkaishi, 47(8): 967–978.

GARCéS E, FERNANDEZ M, PENNA A, et al, 2006. Characterization of NW Mediterraneanspp. (Dinophyceae) strains using morphological, molecular, chemical, and physiological methodologies[J]. Journal of Phycology, 42(5): 1096–1112.

HALL T A, 1999. BioEdit: A user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT[J]. Nucleic Acids Symposium Series, 41(41): 95–98.

HULBURT E M, 1957. The taxonomy of unarmored Dinophyceae of shallow embayments on Cape Cod, Massachusetts[J]. The Biological Bulletin, 112(2): 196–219.

J?RGENSEN M F, MURRAY S, DAUGBJERG N, 2004a.revisited. I. redefinition of(Dinophyceae) based on cladistic and molecular phylogenetic analyses[J]. Journal of Phycology, 40(2): 351–365.

J?RGENSEN M F, MURRAY S, DAUGBJERG N, 2004b. A new genus of athecate interstitial dinoflagellates,gen. nov., previously encompassed withinlato: inferred from light and electron microscopy and phylogenetic analyses of partial large subunit ribosomal DNA sequences[J]. Phycological Research, 52(3): 284–299.

KARAFAS S, TENG S T, LEAW C P, et al, 2017. An evaluation of the genus(Dinophyceae) combining evidence from morphology, phylogenetics, and toxin production, with the introduction of six novel species[J]. Harmful Algae, 68: 128–151.

KOBAYASHI J, SHIGEMORI H, ISHIBASHI M, et al, 1991. Amphidinolides G and H: new potent cytotoxic macrolides from the cultured symbiotic dinoflagellatesp[J]. The Journal of OrganicChemistry, 56(17): 5221–5224.

KOFOID C A, SWEZY O, 1921. The free-living unarmored dinoflagellata[M]. California: University of California Press.

KONG XIANYU, HAN XIURONG, GAO MIN, et al, 2016. Antialgal and antilarval activities of bioactive compounds extracted from the marine dinoflagellate[J]. Journal of Ocean University of China, 15(6): 1014–1020.

LEE K H, JEONG H J, PARK K, et al, 2013. Morphology and molecular characterization of the epiphytic dinoflagellate, isolated from the temperate waters off Jeju Island, Korea[J]. Algae, 28(3): 213–231.

MARANDA L, SHIMIZU Y, 1996.var. nov.(Dinophyceae), a free-swimming marine species producing cytotoxic metabolites[J]. Journal of Phycology, 32(5): 873–879.

MORRILL L C, LOEBLICH III A R, 1981. A survey for body scales in dinoflagellates and a revision ofand(Pyrrhophyta)[J]. Journal of Plankton Research, 3(1): 53–65.

MURRAY S A, GARBY T, HOPPENRATH M, et al, 2012. Genetic diversity, morphological uniformity and polyketide production in dinoflagellates (, Dinoflagellata)[J]. PLoS One, 7(6): e38253.

MURRAY S, J?RGENSEN M F, DAUGBJERG N, et al, 2004.revisited. II. Resolving species boundaries in thespecies complex (Dinophyceae), including the descriptions ofsp. nov. and. comb. nov.[J]. Journal of Phycology, 40(2): 366–382.

MURRAY S, PATTERSON D J, 2002. The benthic dinoflagellate genusin south-eastern Australian waters, including three new species[J]. European Journal of Phycology, 37(2): 279–298.

PAGE R D M. 1996. TreeView: an application to display phylogenetic trees on personal computers[J]. Computer Applications in the Biosciences, 12(4): 357–358.

RE?é A, CAMP J, GARCéS E, 2015. Diversity and phylogeny of(Dinophyceae) from the NW Mediterranean Sea revealed by a morphological and molecular approach[J]. Protist, 166(2): 234–263.

RHODES L L, SMITH K F, MUNDAY R, et al, 2010. Toxic dinoflagellates (Dinophyceae) from Rarotonga, Cook Islands[J]. Toxicon, 56(5): 751–758.

RONQUIST F, HUELSENBECK J P, 2003. MrBayes 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models[J]. Bioinformatics, 19(12): 1572–1574.

SATAKE M, MURATA M, YASUMOTO T, et al, 1991. Amphidinol, a polyhydroxy-polyene antifungal agent with an unprecedented structure, from a marine dinoflagellate,[J]. Journal of the American Chemical Society, 113(26): 9859–9861.

SEKIDA S, OKUDA K, KATSUMATA K, et al, 2003. A novel type of body scale found in two strains ofspecies (Dinopbyceae)[J]. Phycologia, 42(6): 661–666.

TAMURA K, PETERSON D, PETERSON N, et al, 2011. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution, 28(10): 2731–2739.

TAMURA M, TAKANO Y, HORIGUCHI T, 2009. Discovery of a novel type of body scale in the marine dinoflagellate,sp. nov. (Dinophyceae)[J]. Phycological Research, 57(4): 304–312.

TRUBY E W, 1997. Preparation of single-celled marine dinoflagellates for electron microscopy[J]. Microscopy Research and Technique, 36(4): 337–340.

VILA M, CAMP J, GARCéS E, et al, 2001. High resolution spatio-temporal detection of potentially harmful dinoflagellates in confined waters of the NW Mediterranean[J]. Journal of Plankton Research, 23(5): 497–514.

WATANABE M M, SUDA S, INOUYA I, et al, 1990.gen. et sp. nov. (Gymnodinaiales, Dinophyta), a green dinoflagellate with a chlorophyll-containing and-containing endosymbiont[J]. Journal of Phycology, 26(4): 741–751.

YASUMOTO T, SEINO N, MURAKAMI Y, et al, 1987. Toxins produced by benthic dinoflagellates[J]. The Biological Bulletin, 172(1): 128–131.

Morphology and Phylogenetics study on the species of(Gymnodinials, Dinophyceae) from Weizhou Island, Guangxi

JIANG Lichun, LI Qun, Lü Songhui

College of Life Science and Technology, Jinan University, Key Laboratory of Aquatic Eutrophication and Control of Harmful Algae Blooms of Guangdong Higher Education Institutes, Guangzhou 510632, China

In this study, strains offrom seaweeds and dead corals around Weizhou Island, Guangxi, China were isolated by single cell capillary pipette and cultured. The morphological features and phylogenetic analysis were determined based on light microscopy, scanning electron microscopy and molecular biology techiniques. Threespecies were identified, namely,,and, among whichandwere new records in China. The differences in morphology and phylogeny between different species were analyzed and compared. It was found that the morphological characteristics of the threespecies were significantly consistent with model species. This study adds information to the diversity and phylogenetic evolution ofspecies in China, and extented the distribution of two newspecies to the coastal waters of southern China.

Weizhou Island;; morphology; phylogeny

Q949.24;

A

1009-5470(2020)03-0106-10

10.11978/2019077

http://www.jto.ac.cn

2019-08-24;

2019-11-26。

林強編輯

國家自然科學基金(41576162、41876173)

江麗春(1992—), 女, 江西省九江市人, 碩士研究生, 從事海洋底棲甲藻分類學

呂頌輝。E-mail: lusonghui1963@163.com

2019-08-24;

2019-11-26.

Editor: LIN Qiang

National Nature Science Foundation of China (41576162, 41876173)

Lü Songhui. E-mail: lusonghui1963@163.com