黃麗芬, 李群, 呂頌輝, 張亮, 謝學(xué)東

海洋生物學(xué)

中國(guó)西沙群島底棲甲藻熱帶庫(kù)里亞藻()的形態(tài)學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育及毒性研究

黃麗芬1, 李群1, 呂頌輝1, 張亮2, 謝學(xué)東2

1. 暨南大學(xué)赤潮與海洋生物學(xué)研究中心, 廣東 廣州 510632; 2. 廣東省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心, 廣東 廣州 510632

庫(kù)里亞藻()是一類廣泛分布且具有生物毒性的海洋底棲甲藻。本研究對(duì)近年來在中國(guó)南海西沙群島海域采集分離的4株庫(kù)里亞藻, 通過光鏡及電鏡下的形態(tài)學(xué)觀察, 并結(jié)合基于核糖體大亞基(large subunit, LSU)rDNA(D1-D3)和內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer, ITS)的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析, 鑒定該4個(gè)株系為熱帶庫(kù)里亞藻()。在鹵蟲()生物毒性試驗(yàn)中, 熱帶庫(kù)里亞藻不同株系毒素提取液對(duì)鹵蟲幼蟲表現(xiàn)出了毒性差異, XS554株系的48h半致死濃度(LC50)為1.42mg·mL–1(約相當(dāng)于1.1×105cells·mL–1), 5XS15株系的LC50為1.92mg·mL–1(約相當(dāng)于1×105cells·mL–1)。

熱帶庫(kù)里亞藻; 形態(tài)學(xué); 系統(tǒng)發(fā)育; 毒性; 鹵蟲

海洋底棲甲藻是一類在全球廣泛分布的重要的甲藻生態(tài)類群, 具有多個(gè)潛在的有害物種, 藻細(xì)胞產(chǎn)生的有毒化合物通過食物鏈傳遞, 最終會(huì)對(duì)人體及動(dòng)物的健康產(chǎn)生極大的負(fù)面影響。近幾十年來, 由于在熱帶、亞熱帶地區(qū)到溫帶地區(qū)的明顯擴(kuò)張, 海洋底棲甲藻引起了科學(xué)界的廣泛關(guān)注(Berdalet et al, 2017)。

庫(kù)里亞藻屬()屬于海洋底棲甲藻, 具有重要的生態(tài)意義, 廣泛分布在全世界熱帶至溫帶的近海海域(Faust, 1995; Rhodes et al, 2000; Aligizaki et al, 2006; Fraga et al, 2008; Armi et al, 2010)。在我國(guó)海南三亞海域, 劉寧寧等(1999)首次報(bào)道了, 該物種在香港海域也已發(fā)現(xiàn)(Leung et al, 2017)。庫(kù)里亞藻可產(chǎn)生豐富的粘液, 通過粘液附著在多種多樣的基質(zhì)表面生存(Besada et al, 1982), 如沙石、大型藻類、珊瑚及紅樹林等。

庫(kù)里亞藻最早是Meunier在比利時(shí)尼烏波特的牡蠣床上發(fā)現(xiàn)(Meunier, 1919), 并命名為。目前,a屬共鑒定出8個(gè)種:Meunier (Meunier, 1919)、熱帶庫(kù)里亞藻(Faust, 1995)、Ten-Hage, Turquet, Quod et Coute (Ten-Hage et al, 2000)、S. Fraga (Fraga et al, 2008)、Leaw, Lim & Usup (Leaw et al, 2010)、Karafas, Tomas&York、Karafas, Tomas&York (Karafas et al, 2015)和sp. nov.David, Laza-Martínez, Rodríguez (David et al, 2020)。在庫(kù)里亞藻的物種鑒別中, 相關(guān)特征特別是部分甲板的形態(tài)被用于種間比較。種間差異主要是第一頂板(1′)和第七溝前板(7′′)的形狀、頂孔的長(zhǎng)及甲板表面的裝飾物等(Faust, 1995; Ten-Hage et al, 2000; Fraga et al, 2008; Leaw et al, 2010; Karafas et al, 2015)。但僅僅以形態(tài)上的微小差異鑒別不同物種還存在難度, 使用核糖體大亞基(large subunit, LSU) rDNA(Fraga et al, 2008)、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer, ITS)包括ITS1和ITS2(Penna et al, 2005)及其二級(jí)結(jié)構(gòu)(Leaw et al, 2010)的分子信息方法也已用于支持物種鑒定。

已有報(bào)道稱庫(kù)里亞藻部分藻株會(huì)產(chǎn)生生物毒素和其他生物活性化合物, 并通過對(duì)人類細(xì)胞、小鼠、海洋無脊椎動(dòng)物等進(jìn)行細(xì)胞毒性生物測(cè)定及溶血活性測(cè)定得到了證實(shí)(Rhodes et al, 2010, 2014; Karafas et al, 2015;Leung et al, 2017; De Queiroz Mendes et al, 2019)。Cooliatoxin是一種扇貝毒素(yessotoxins, YTXs)的類似物, 是從熱帶庫(kù)里亞藻澳大利亞株系中首次鑒定出的(Holmes et al, 1995)。隨后, Wakeman等(2015)從藻株中鑒定出了另外5種扇貝毒素的類似物, 且不同于Holmes等人先前描述的Cooliatoxin。庫(kù)里亞藻的細(xì)胞毒性具有物種特異性(Laza-Martinez et al, 2011; Rhodes et al, 2014; Karafas et al, 2015; Leung et al, 2017), 且熱帶庫(kù)里亞藻細(xì)胞的生物毒性在不同報(bào)道中也存在差異。

目前國(guó)際上對(duì)庫(kù)里亞藻的分類學(xué)已有許多研究, 但國(guó)內(nèi)的相關(guān)研究報(bào)道還較少。本文通過結(jié)合形態(tài)學(xué)及系統(tǒng)發(fā)育分析, 對(duì)采集自中國(guó)西沙群島的4個(gè)藻株進(jìn)行了分類鑒定, 豐富了我國(guó)庫(kù)里亞藻屬種類的分類學(xué)信息, 并運(yùn)用鹵蟲()生物毒性測(cè)定法對(duì)其細(xì)胞毒性的影響展開研究, 以期為有害藻華的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 藻種采集與培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用庫(kù)里亞藻株采集自中國(guó)西沙群島(表1、圖1), 于死珊瑚及礁巖底質(zhì)上分離而得, 活體藻株保存于暨南大學(xué)赤潮與海洋生物學(xué)研究中心藻種庫(kù)。

圖1 采樣位點(diǎn)示意圖

地圖來源于Surfer軟件自帶底圖

Fig. 1 Map of sampling sites

表1 藻株采樣信息

藻株使用L1培養(yǎng)基(Guillard et al, 1993)培養(yǎng), 培養(yǎng)溫度為25℃(±0.5℃), 鹽度為30‰(±1‰), 光暗周期比為12L︰12D, 光照強(qiáng)度為160~180μmol photons·m–2·s–1。

1.2 形態(tài)學(xué)觀察

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合光學(xué)顯微鏡及掃描電子顯微鏡的觀察對(duì)藻株進(jìn)行形態(tài)鑒定。

在光學(xué)顯微鏡Olympus BX41 microscope (Olympus, Tokyo, Japan)下對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行初步觀察, 對(duì)關(guān)鍵的分類學(xué)特征進(jìn)行圖片采集, 選取30個(gè)以上細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量細(xì)胞的長(zhǎng)度、寬度等數(shù)據(jù)。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞色素的形態(tài)及分布, 并分別使用SYBR Safe DNA (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA)及Calcofluor White (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色, 在360~370nm激發(fā)和420~460nm的激發(fā)光下分別觀察細(xì)胞核及初步觀察細(xì)胞表面甲板的組成, 拍攝圖像進(jìn)行分析。

對(duì)于掃描電子顯微鏡, 取適量細(xì)胞并用戊二醛固定(終濃度=2.5%), 置于4℃下過夜。然后將固定的細(xì)胞過濾至核孔濾膜上(孔徑=8μm, Whatman, Little Chalfont, UK), 用一系列梯度海水沖洗除鹽, 隨后用蒸餾水沖洗10分鐘以除去剩余的鹽和固定劑, 再依次用體積分?jǐn)?shù)為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%的乙醇梯度脫水, 使用CO2超臨界干燥儀 Leica EM CPD300(Leica Microsystems, Mannheim, Germany)進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥, 并在真空濺射儀(Leica EM SCD500, Leica, Wetzlar, Germany)中噴金后在掃描電子顯微鏡(Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Germany)下觀察細(xì)胞表面細(xì)微結(jié)構(gòu)并拍照。

1.3 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

取足量的藻液離心收集成藻團(tuán), 并用蒸餾水沖洗三次以除鹽后儲(chǔ)存于80℃下30min。按照試劑盒MiniBEST Universal DNA Extraction Kit(TaKaRa Bio, Inc., Kusatsu, Shiga, Japan)中的方法提取DNA。大亞基(LSU)rDNA(D1—D3)使用引物D1R-F(5′-ACCC GCTGAATTTAAGCATA-3′) (Scholin et al, 1994)和D3B-R(5′-TCGGAGGGAACCAGCTACTA-3′) (Nunn et al, 1996)進(jìn)行擴(kuò)增及測(cè)序, 內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)使用通用引物ITS1F(5′-ACCCGCTGAATTTAAGC ATA-3′)和ITS1R(5′-ATATGCTTAAGCTCAGCGGG- 3′) (Pin et al, 2001)進(jìn)行擴(kuò)增及測(cè)序。PCR擴(kuò)增在50μL體系中進(jìn)行, 反應(yīng)物包含: 25μL TaqPCR MasterMix (Zoman Biotechnology, Beijing, China), 22μL滅菌水, 1μL正向引物, 1μL反向引物和1μL基因組DNA。 PCR反應(yīng)中先預(yù)變性4min, 而后進(jìn)行30個(gè)循環(huán), 每一循環(huán)包括94℃的變性1min, 45℃退火1min和72℃延伸1min, 最后延伸步驟為72℃, 7min。PCR產(chǎn)物交由專門的生物技術(shù)公司進(jìn)行純化及測(cè)序。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

將測(cè)序獲得的LSU和ITS序列與從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的參考序列使用MUSCLE(Edgar, 2004)進(jìn)行多重比對(duì)。采用CIPRES中的RAxML- HPC2 v.8中的最大似然法(maximum likelihood, ML)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析, 運(yùn)行1000次自舉檢驗(yàn)。此外, 運(yùn)行MrBayes v3.2.6(Ronquist et al, 2012)進(jìn)行貝葉斯推斷(Bayesian inference, BI)分析, 其經(jīng)PAPU v. 4.0構(gòu)建的最佳擬合模型是GTR+G。使用MEGA 7.0軟件查看系統(tǒng)發(fā)育樹。用MEGA 7.0計(jì)算不同序列間遺傳距離。

1.5 毒性分析

實(shí)驗(yàn)選用2株熱帶庫(kù)里亞藻(XS554、5XS15)藻株及1株(HSJ19)藻株, 將無毒的分離株HSJ19作為陰性(無毒)對(duì)照。

1.5.1 毒素粗提液制備

取處于穩(wěn)定期前期的細(xì)胞培養(yǎng)物, 離心收集后將藻團(tuán)冷凍干燥。藻團(tuán)中加入純甲醇, 在冰浴條件下用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎10min, 鏡檢確保無完整藻細(xì)胞后離心收集上清液, 再通入純N2將其干燥。干燥后溶解于含1%Tween-60的磷酸鹽緩沖液中(Rhodes et al, 2014), 制備的毒素粗提液的濃度為10mg·mL–1(干重濃度), 于4℃保存待用。

1.5.2 鹵蟲生物毒性實(shí)驗(yàn)

將鹵蟲(JBL Novotemia, 德國(guó))的干燥孢囊在25℃下加入過濾后的人工海水中孵化。孵化24h后隨機(jī)挑取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的鹵蟲幼蟲置于12孔板中, 每孔20只。鹵蟲幼蟲暴露于2mL試驗(yàn)溶液中, 無毒對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組毒素粗提液預(yù)設(shè)濃度為5、2.5、1、0.75和0.5mg·mL–1, 由含1%Tween-60的磷酸鹽緩沖液作為溶劑對(duì)照組的對(duì)應(yīng)濃度為0.5%、0.25%、0.1%、0.075%、0.05% Tween-60, 加入過濾后的人工海水作為空白對(duì)照組。72h暴露實(shí)驗(yàn)于25℃(±0.5℃)、光暗周期比為12L︰12D培養(yǎng)箱中進(jìn)行, 每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置三組平行。于設(shè)定時(shí)間點(diǎn)計(jì)數(shù)每個(gè)孔中死亡的鹵蟲幼蟲的數(shù)量, 計(jì)算死亡率, 并通過死亡率確定半致死濃度(LC50)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS19.0軟件進(jìn)行, 差異性分析利用單因素方差分析(One-way ANOVA),＜0.05為差異顯著,＜0.01為差異極顯著。使用Origin9.4進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)

熱帶庫(kù)里亞藻細(xì)胞如腹面觀及底面觀所示呈球形(圖2b、d; 圖3e、f; 圖4a、b)。在側(cè)面觀中, 上殼與下殼略微傾斜, 且上殼比下殼稍小(圖3a)。細(xì)胞中有許多金黃色的色素體(圖2a), 在熒光下觀察到在細(xì)胞中的排列如圖2b所示。細(xì)胞核靠近細(xì)胞的背面, 呈U形(圖2c), 細(xì)胞核長(zhǎng)度大約為19.6~ 28.2μm(平均值為23.7μm,= 39), 寬為4.3~8.4μm (平均值為6.3μm,= 39)。熒光下能夠初步觀察到細(xì)胞表面的甲板組成(圖2d)。熱帶庫(kù)里亞藻細(xì)胞長(zhǎng)為28.5~44.2μm(平均值為37.0μm,=34), 寬為25.5~ 43.3μm(平均值為32.3μm,=34), 背腹側(cè)的高為22.6~47.9μm(平均值為33.2μm,=28)。殼表面光滑, 由形狀不規(guī)則的、界限分明的、大小不一的甲板組成。所有的甲板表面都覆蓋有許多分散的圓孔, 孔的平均直徑為0.29μm(=70)。甲板排列式為(Po, 3′, 7′′, 6c, ?s, 5′′′, 2′′′′)。

熱帶庫(kù)里亞藻細(xì)胞的上殼由11塊甲板組成: 一塊頂孔板(Po), 三塊頂板(3′)和7塊溝前板(7′′)。頂孔(Po)位于第二頂板上且偏離整個(gè)上殼的中心, 包含一條細(xì)縫和一些小孔, 從頂面看呈現(xiàn)出略彎曲形, 頂孔長(zhǎng)為4.3~9.6μm(平均值為7.4μm,=40, 基于電鏡圖測(cè)量)(圖3b)。頂孔板與第一頂板(1′)、第三頂板(3′)、第二溝前板(2′′)、第三溝前板(3′′)、第四溝前板(4′′)相連(圖3c; 圖4a)。第一頂板(1′)是上殼中面積最大的甲板, 呈細(xì)長(zhǎng)的六邊形狀, 延伸到背腹側(cè), 與第二頂板(2′)/ 頂孔板(Po)、第三頂板(3′)、第一溝前板(1′′)、第二溝前板(2′′)、第六溝前板(6′′)、第七溝前板(7′′)相連(圖3d; 圖4a)。第三溝前板(3′′)、第四溝前板(4′′)、第五溝前板(5′′)在大小上幾乎相等, 第六溝前板(6′′)是溝前板中面積最大的甲板(圖3c; 圖4a)。第七溝前板(7′′)寬且短, 其寬與長(zhǎng)的比值為3.8(=6)。橫溝圍繞細(xì)胞一圈, 溝內(nèi)有兩排間隔相等的小孔?？v溝較深, 但沒有延伸到細(xì)胞的背面。

下殼由7塊甲板組成: 5塊溝后板(5′′′)和2塊底板(2′′′′)。第三溝后板(3′′′)比第四溝后板(4′′′)稍大(圖3e), 第二溝后板(2′′′)和第五溝后板(5′′′)的面積都較小(圖3f)。第一溝后板(1′′′)是面積最小的, 且在底面觀中較難辨別(圖3e、f)。第一底板(1'''')非常小, 第二底板(2′′′′)的形狀為六邊形(圖3f、圖4b)。

圖2 熱帶庫(kù)里亞藻的光鏡圖

a. 細(xì)胞呈圓球形; b. 色素體在細(xì)胞內(nèi)的分布; c. 細(xì)胞核呈U形; d. 細(xì)胞腹面觀, 顯示了橫溝和縱溝

Fig. 2 Light microscope (LM) images of. a) Cells showing spherical-shaped; b) the arrangement of chloroplasts; c) the U-shaped nucleus; d) ventral view showing cingulum and sulcus

2.2 分子系統(tǒng)發(fā)育分析

實(shí)驗(yàn)所用熱帶庫(kù)里亞藻最初經(jīng)由對(duì)活細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察來鑒定, 通過分子系統(tǒng)發(fā)育分析進(jìn)一步確認(rèn)。本研究獲得了4株熱帶庫(kù)里亞藻部分大亞基(LSU) rDNA(D1-D3)和內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)的序列。LSU rDNA和ITS的系統(tǒng)發(fā)育分析都以作為外類群。最大似然法(ML)與貝葉斯推斷法(BI)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹產(chǎn)生了相同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu), 因此, 本文僅展示了ML構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5、6)。分支節(jié)點(diǎn)處的數(shù)值表示對(duì)該分支的統(tǒng)計(jì)支持值, 分別為最大似然法自舉檢驗(yàn)值(100)和貝葉斯推斷后驗(yàn)概率值(1)。

圖3 熱帶庫(kù)里亞藻的掃描電鏡圖

a. 側(cè)面觀; b. 頂孔復(fù)合體; c. 頂面觀; d. 頂面觀; e. 底面觀; f. 腹面觀

Fig. 3 Scanning electron microscope (SEM) images of. a) Lateral view; b) close-up of APC; c) apical view of the epitheca; d) apical view of the epitheca; e) antapical view of the hypotheca; f) ventral view

圖4 熱帶庫(kù)里亞藻的殼板圖

a、b, 本研究; c、d, 重繪自Faust(1995); e、f, 重繪自Mohammad-Noor等(2013)。a、c、e為上殼板頂面觀; b、d、f為下殼板底面觀

Fig. 4 Thecal plate tabulation ofbased on original descriptions. (a, b) This study; (c, d) redrawn from Faust(1995); (e, f) redrawn from Mohammad-Noor et al (2013); (a, c, e) apical view of the epitheca; (b, d, f) antapical view of the hypotheca

對(duì)基于LSU rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析, 研究獲得了4株熱帶庫(kù)里亞藻部分大亞基(LSU) rDNA(D1-D3)序列, 結(jié)合從Genbank上獲得的庫(kù)里亞藻屬的39個(gè)已發(fā)表序列及2個(gè)外類群, 共45個(gè)序列進(jìn)行比對(duì)分析。基于LSU (D1-D3) rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示所有序列形成了7個(gè)清晰且支持值良好的分支:和(圖5)。本研究中4個(gè)西沙群島熱帶庫(kù)里亞藻株系與同種類來自世界各地的其他熱帶庫(kù)里亞藻株系聚類在一起形成單一進(jìn)化枝, 支持率高達(dá)99/1。本研究中的4個(gè)株系序列存在較小差異, 分別聚類在3個(gè)不同的子分支中, 熱帶庫(kù)里亞藻株系間遺傳距離最大為0.042(5XS15/2XS73)。其中, XS554與3XS45兩條序列的堿基組成無差異, 與澳大利亞株(HQ897276、MH319016、MH319017)、泰國(guó)株(AB908159)和印度尼西亞株(AM902740)聚集在同一子分支中, 支持率為99/0.73; 5XS15與XS554、3XS45的序列間存在10個(gè)堿基差異, 與中國(guó)香港株系(KX589144、KX589145)聚集在同一子分支中, 擁有較高的支持率(99/1); 2XS73與馬來西亞株(JX896691)和澳大利亞株(MH319018)聚集在同一子分支中, 支持率為73/1。另外, 2XS73與XS554、3XS45的序列差異為31個(gè)堿基, 與5XS11、5XS15的序列差異為38個(gè)堿基。熱帶庫(kù)里亞藻分支中顯示了一定程度的種內(nèi)差異, 平均遺傳距離為0.02?；贚SU rDNA序列的庫(kù)里亞藻種間平均遺傳距離為0.086 (×e)至0.450 (×) (表2)。

圖5 基于核糖體大亞基(LSU)D1-D3區(qū)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

以作為外類群, 分支節(jié)點(diǎn)處的數(shù)值表示對(duì)該分支的統(tǒng)計(jì)支持值, 分別為最大似然法自舉檢驗(yàn)值(100)和貝葉斯推斷后驗(yàn)概率值(1)

Fig. 5 Molecular phylogenetic tree based on the D1-D3 region of LSU rDNA withas outgroups. The numbers at nodes indicate the maximum likelihood booststrap (BS) values (100) and Bayesian Inference posterior probability (PP) values (1), representing the levels of support

表2 庫(kù)里亞藻不同物種間基于LSU rDNA序列的遺傳距離

對(duì)基于ITS區(qū)段序列的系統(tǒng)發(fā)育分析, 結(jié)合從Genbank上獲得的屬的23個(gè)已發(fā)表序列及2個(gè)外類群, 共29個(gè)序列進(jìn)行比對(duì)分析。由于GenBank中只有少數(shù)序列可供比對(duì)使用, 基于ITS區(qū)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹總體上支持LSU的結(jié)果, 但系統(tǒng)發(fā)育樹的綜合性不夠全面, 有待進(jìn)一步完善 (圖6)。本研究中4個(gè)西沙群島熱帶庫(kù)里亞藻株系與其余來自世界各地的熱帶庫(kù)里亞藻株系聚類在一起形成單一進(jìn)化枝, 支持率為99/1。本研究中的4個(gè)序列間存在差異, 在系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看到2XS73株更早的與熱帶庫(kù)里亞藻的其他株系分離開, 形成單一子分支, 支持率為99/1; 而其余三個(gè)株系進(jìn)入另一分支中。其中XS554與3XS45兩條序列的堿基組成無差異, 與西班牙株(KR605300、KR605299)和中國(guó)株(MF805767)聚集在同一子分支中, 支持率為60/1; 5XS15與XS554、3XS45株系存在9個(gè)堿基差異, 也與該分支中其余株系分離開, 形成單一子分支, 支持率為92/1; 另外, 2XS73與XS554、3XS45的序列差異為36個(gè)堿基, 與5XS15的序列差異為40個(gè)堿基。熱帶庫(kù)里亞藻分支中也顯示了一定程度的種內(nèi)差異, 平均遺傳距離為0.019, 其中西沙群島株系間的最大遺傳距離為0.097(5XS15/2XS73)。基于ITS rDNA序列的庫(kù)里亞藻種間平均遺傳距離為0.128(×)至0.798(×)(表3)。

2.3 毒性分析

西沙群島熱帶庫(kù)里亞藻株系XS554、5XS15毒素粗提物對(duì)鹵蟲()的毒性影響結(jié)果如圖7所示。無毒對(duì)照組HSJ19的鹵蟲游動(dòng)正常, 與海水對(duì)照組無明顯差別; 與對(duì)照組相比, 兩個(gè)株系對(duì)鹵蟲均出現(xiàn)了明顯的生物毒性作用, 前期表現(xiàn)為游動(dòng)遲緩或不動(dòng), 隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而致死。在暴露12h時(shí), 高濃度組(5mg·mL–1)出現(xiàn)了明顯的致死效應(yīng), XS554株系組死亡率高達(dá)73.33%, 而5XS15株系組死亡率為18.33%; 24h時(shí)觀察到兩個(gè)株系的高濃度組(5mg·mL–1)中鹵蟲的死亡率接近100%。XS554株系的2.5mg·mL–1濃度組的鹵蟲死亡率在12h至48h間有明顯增加, 48h時(shí)鹵蟲死亡率接近100%; 而在此濃度下, 5XS15株系組鹵蟲在暴露24h后致死率才有明顯的增加, 直至72h時(shí)死亡率達(dá)到100%。鹵蟲暴露在粗提液中72h后, 其余三個(gè)低濃度組的致死率仍較低, 大致為20%, 但幾乎所有的鹵蟲與對(duì)照組相比都有異常表現(xiàn), 如游動(dòng)遲緩或不動(dòng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 在相同時(shí)間內(nèi), 藻株毒素粗提液對(duì)鹵蟲的毒性效應(yīng)隨著濃度升高而增強(qiáng); 而在一定的濃度下, 對(duì)鹵蟲的毒性作用隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。在鹵蟲暴露在毒素粗提物中48h時(shí), XS554株系的LC50為1.42mg·mL–1(相當(dāng)于大約1.1×105cells·mL–1), 5XS15株系的LC50為1.92mg·mL–1(相當(dāng)于大約1×105cells·mL–1), 兩者間存在顯著性差異(＜0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 熱帶庫(kù)里亞藻同一種內(nèi)的不同株系間提取物的致死效力存在差異。

圖6 基于核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹核糖體

以作為外類群, 分支節(jié)點(diǎn)處的數(shù)值表示對(duì)該分支的統(tǒng)計(jì)支持值, 分別為最大似然法自舉檢驗(yàn)值(100)和貝葉斯推斷后驗(yàn)概率值(1)

Fig. 6 Molecular phylogenetic tree based on the ITS region withas outgroups. The numbers at nodes indicate the maximum likelihood booststrap (BS) values (100) and Bayesian Inference posterior probability (PP) values (1), representing the levels of support

表3 庫(kù)里亞藻不同物種間基于ITS區(qū)序列的遺傳距離

圖7 熱帶庫(kù)里亞藻不同濃度毒素粗提物在72h內(nèi)對(duì)鹵蟲的致死率

a. 藻株XS554; b. 藻株5XS15

Fig. 7 The death rate ofexposed to crude toxin extract ofwithin 72 h. a) XS554; b) 5XS15

3 討論與分析

3.1 熱帶庫(kù)里亞藻的形態(tài)學(xué)比較

本研究中的西沙群島株系間雖然在分子序列上存在微小差異, 但其形態(tài)特征上無明顯差異?；谛螒B(tài)的庫(kù)里亞藻屬物種之間的區(qū)別一直存在爭(zhēng)議(Mohammad-Noor et al, 2013; Leaw et al, 2016)。然而, 已經(jīng)明確的是, 不同種間第一頂板(1′)及第七溝前板(7′′)的大小和形狀與分子數(shù)據(jù)基本一致, 并廣泛被用于鑒定該種類, 特別是第七溝前板(7′′)的寬長(zhǎng)比(Fraga et al, 2008)。

Faust(1995)首次對(duì)熱帶庫(kù)里亞藻進(jìn)行了形態(tài)上的描述。本研究所用的西沙群島藻株的形態(tài)與其原始描述雖存在部分細(xì)微差異, 但基本一致, 而也更符合隨后更多研究中的描述(Mohammad-Noor et al, 2013; Momigliano et al, 2013; Ho et al, 2014; Nascimento et al, 2019; De Queiroz Mendes et al, 2019)。

西沙群島熱帶庫(kù)里亞藻株系的細(xì)胞大小比原始描述中的伯利茲株略大(Faust, 1995), 而已報(bào)道的馬來西亞株細(xì)胞則更大(Mohammad-Noor et al, 2013)。然而, Jeong等(2012)觀察到活細(xì)胞的大小明顯大于掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)下拍攝后測(cè)量的細(xì)胞大小, 因此認(rèn)為經(jīng)過掃描電鏡的一系列前處理會(huì)使得細(xì)胞明顯縮小。在本研究中也觀察到了同樣的現(xiàn)象。因此, 在比較庫(kù)里亞藻種類的細(xì)胞大小時(shí), 應(yīng)該考慮SEM下可能存在的細(xì)胞明顯收縮的情況。伯利茲株細(xì)胞通過掃描電鏡拍攝后測(cè)量的長(zhǎng)為23~40μm, 寬為25~39μm; 馬來西亞株細(xì)胞的長(zhǎng)為35~47μm(平均值: 40±4.7μm), 寬為30~45μm(平均值: 37±5.2μm); 而本研究中西沙群島株細(xì)胞長(zhǎng)為28.5~44.2μm(平均值: 37.0μm), 寬為25.5~43.3μm(平均值: 32.3μm)。頂孔的長(zhǎng)平均為7.4μm, 與伯利茲株(7μm)、澳大利亞株(6.5~8μm)和巴西株(7.0±0.9μm)無太大差異(Faust, 1995; Momigliano et al, 2013; Nascimento et al, 2019); 與越南株(7~9μm)及馬來西亞株(7.2~12μm)相比明顯更短(Mohammad-Noor et al, 2013; Ho et al, 2014); 比巴西株(4.9μm)差異明顯(De Queiroz Mendes et al, 2019)。

西沙群島株與1995年原始描述的主要差異是在部分甲板的形狀及大小(圖4)。原始描述中的第一頂板(1′)被描述為楔形, 并且在Momigliano (2013)中被描述為五邊形, 而在本研究中的西沙株是細(xì)長(zhǎng)、六邊形的, 與其他先前的描述類似(Mohammad-Noor et al, 2013; Ho et al, 2014)。但Mohammad-Noor (2013)通過仔細(xì)觀察原始描述(Faust, 1995)中的掃描顯微圖片, 發(fā)現(xiàn)其中第一頂板(1′)的形狀是被錯(cuò)誤描述的。第七溝前板(7′′)的寬長(zhǎng)比是用以鑒定庫(kù)里亞藻種類的最重要特征之一, 已有報(bào)道表明熱帶庫(kù)里亞藻的寬長(zhǎng)比大約為4(Fraga et al, 2008; Laza-Martinez et al, 2011), 本研究中其比值為3.8, 符合前人的描述。另外, 在第二頂板(2′)、第三頂板(3′)以及第二底板(2′′′′)也發(fā)現(xiàn)了差異。在本研究中, 第二頂板(2′)為六邊形, 第三頂板(3')為五邊形; 在Faust(1995)的描述中, 第二頂板(2′)為四邊形, 第三頂板(3′)被五塊甲板圍繞, 盡管它被描述為四邊形。第二底板(2′′′′)在Faust (1995) 的描述中是四邊形的, 而在Ho等(2014) 的描述中為五邊形或六邊形, 在本研究觀察中為六邊形。此外, 底板3′′′′和4′′′′在原始描述中大小相等, 而在本研究中, 甲板3′′′′略大于甲板4′′′′。

3.2 分子系統(tǒng)發(fā)育

基于LSU (D1-D3) rDNA和ITS rDNA的序列, 運(yùn)用ML及BI建成的系統(tǒng)發(fā)育樹產(chǎn)生了與近年報(bào)道中一致的主要進(jìn)化枝(Rhodes et al, 2014; Leaw et al, 2016; Leung et al, 2017; Lewis et al, 2018; David et al, 2020), 分別為、、、、和。由于的rDNA基因數(shù)據(jù)至今未能獲得, 在種間系統(tǒng)發(fā)育地位也無法確定。本研究中熱帶庫(kù)里亞藻形成了一個(gè)具有高支持率的單系起源分支, 基于LSU rDNA和ITS rDNA序列分析結(jié)果顯示西沙群島的四個(gè)株系被確認(rèn)為熱帶庫(kù)里亞藻。對(duì)比基于LSU rDNA序列及ITS rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果發(fā)現(xiàn), 在兩個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹中藻株間的親緣遠(yuǎn)近關(guān)系是一致的, 表現(xiàn)為2XS73株系與其余3個(gè)株系的親緣關(guān)系較為疏遠(yuǎn)。而由于GenBank中只有少數(shù)ITS區(qū)序列可供比對(duì)使用, 基于ITS區(qū)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹總體的可信度不及基于LSU rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。由于地理上的鄰近性, 推測(cè)西沙群島株系與中國(guó)香港株系及海南株系發(fā)育關(guān)系最密切。然而, 對(duì)LSU序列數(shù)據(jù)的分析表明, 西沙群島4個(gè)株系均與海南株關(guān)系較為疏遠(yuǎn), 僅5XS11、5XS15兩個(gè)株系與中國(guó)香港株系關(guān)系最親密。而由于西沙群島株系間已存在較大的堿基差異, 其進(jìn)化位置與地理區(qū)域間的關(guān)系也較為模糊。

在已有報(bào)道中發(fā)現(xiàn)庫(kù)里亞藻不同種間的分子進(jìn)化差異稍有不同(Leaw et al, 2010; Momigliano et al, 2013; Karafas et al, 2015; de Queiroz Mendes et al, 2019; Nascimento et al, 2019; David et al, 2020)。David等(2020)發(fā)現(xiàn), 庫(kù)里亞藻種間的最小平均遺傳距離(基于LSU rDNA序列)是在和之間, 該結(jié)果與David等(2014)的研究結(jié)果一致, 而在本研究所參考的序列基礎(chǔ)下, 發(fā)現(xiàn)基于LSU rDNA的種間遺傳距離在和之間差異較小?；贗TS rDNA的種間遺傳距離在和之間較小, 這與David等(2020)以及Karafas等(2015)的結(jié)果一致。

3.3 C. tropicalis毒性及差異

自從Holmes等(1995)學(xué)者首次報(bào)道Cooliatoxin以來, 通過對(duì)鹵蟲、鮑魚幼體、海膽、魚及小鼠等進(jìn)行生物毒性測(cè)定, 研究表明庫(kù)里亞藻屬的毒性具有物種特異性, 且至今測(cè)定出僅熱帶庫(kù)里亞藻、、及具生物毒性(Rhodes et al, 1997, 2000, 2010, 2014; Penna et al, 2005; Fraga et al, 2008; Paz et al, 2008; Mohammad-Noor et al, 2013; Leung et al, 2017)。Karafas 等(2015)驗(yàn)證了及對(duì)人體細(xì)胞的毒性作用, 盡管這不是一種生物測(cè)定法, 但在人體細(xì)胞上進(jìn)行試驗(yàn)可以了解其毒素對(duì)人體組織的影響。

本研究通過觀察藻細(xì)胞毒素粗提液對(duì)鹵蟲幼蟲的致死率測(cè)定熱帶庫(kù)里亞藻的毒性, 結(jié)果顯示西沙群島熱帶庫(kù)里亞藻的兩個(gè)株系均有明顯的生物毒性, 暴露于毒素粗提液后鹵蟲均出現(xiàn)了游動(dòng)異常或死亡現(xiàn)象, 分析得出在48h時(shí)XS554的LC50為1.42mg·mL–1(細(xì)胞密度約為1.1×105cells·mL–1), 但5XS15的LC50為1.92mg·mL–1(細(xì)胞密度約為1×105cells·mL–1), 兩者間存在顯著差異。然而, Leung等(2017)的研究結(jié)果顯示, 鹵蟲暴露在含熱帶庫(kù)里亞藻藻細(xì)胞毒素粗提液的試驗(yàn)溶液中并未出現(xiàn)明顯的致死現(xiàn)象, 推測(cè)可能是由于其設(shè)置最高試驗(yàn)濃度較低, 僅為0.5mg·mL–1; 而的S020株系在48h時(shí)的 LC50 為0.086mg·mL–1(細(xì)胞密度約為3×105cells·mL–1), Ve051株系為0.117mg·mL–1(細(xì)胞密度約為1×105cells·mL–1)。若LC50使用細(xì)胞密度數(shù)值相比較, 則西沙群島熱帶庫(kù)里亞藻株系與中國(guó)香港株系對(duì)鹵蟲的致死率是相當(dāng)?shù)? 此結(jié)論與Leung等(2017)的結(jié)論不一致。故在隨后的研究中, 應(yīng)盡量減少因毒素粗提液濃度單位的設(shè)置對(duì)毒性結(jié)果的影響。隨著研究的深入, 發(fā)現(xiàn)本研究中西沙群島熱帶庫(kù)里亞藻株系雖在形態(tài)上無明顯差異, 但其不同株系間的生物毒性卻存在較大差異, 類似情況也已有報(bào)道(Rhodes et al, 2014; Leung et al, 2017)。本研究中未提供西沙群島藻株的相關(guān)特定毒素的信息, 但是其很可能類似于從熱帶庫(kù)里亞藻澳大利亞株系鑒定出的Cooliatoxin(Holmes et al, 1995), 或從藻株中鑒定出的5種扇貝毒素的類似物(Wakeman et al, 2015)。

4 結(jié)論

基于形態(tài)學(xué)特征及系統(tǒng)發(fā)育分析, 鑒定本研究中4株庫(kù)里亞藻為熱帶庫(kù)里亞藻。不同藻株間形態(tài)特征上無明顯差異, 但其分子序列信息卻存在不同程度的差異。西沙群島熱帶庫(kù)里亞藻的兩個(gè)株系均具有明顯的生物毒性, 鹵蟲表現(xiàn)為游動(dòng)異?；蛩劳?。

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Morphology, phylogeny and toxicity of(Dinophyceae) from the Xisha Islands, China

HUANG Lifen1, LI Qun1, Lü Songhui1, ZHANG Liang2, XIE Xuedong2

1. Research Center for Harmful Algae and Marine Biology, Jinan University, Guangzhou 510632, China; 2. Guangdong environmental monitoring center, Guangzhou 510362, China

is a widespread and toxic genus of benthic marine dinoflagellate. In this study, four strains ofspecies were examined as, which were collected in the Xisha Islands of the South China Sea in recent years. Morphology was determined using light microscopy and scanning electron microscopy. Phylogenetic analyses were constructed based on the sequences of the large subunit rDNA and the internal transcribed spacer region. The bioassay toxicity test of brine shrimp () demonstrated that the algal lysates extracted from different strains ofexhibited different toxic effects. At 48 h, the LC50 of XS554 strain was 1.42 mg·mL–1(approximately 1.1×105cells·mL–1) and 5XS15 strain was 1.92 mg·mL–1(approximately 1×105cells·mL–1).

; morphology; phylogeny;toxicity;

Q178.53; Q945.45

A

1009-5470(2020)03-0086-12

10.11978/2019129

http://www.jto.ac.cn

2019-12-11;

2020-02-03。

林強(qiáng)編輯

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41876173、41706126); 科技基礎(chǔ)資源調(diào)查專項(xiàng)(2018FY100200、2018FY100100)

黃麗芬(1995—), 女, 廣東省清遠(yuǎn)市人, 碩士研究生, 研究方向?yàn)樵孱惙诸悺-mail: hhhliii22@163.com

呂頌輝。E-mail: lusonghui1963@163.com

2019-12-11;

2020-02-03.

Editor: LIN Qiang

National Natural Science Foundation of China(41876173, 41706126); Science & Technology Basic Resources Investigation Program of China (2018FY100200, 2018FY100100)

Lü Songhui. E-mail: lusonghui1963@163.com