潘肖蘭, 劉惠茹, 許濛, 許瀚之, 張華, 何毛賢

海洋生物學(xué)

馬氏珠母貝水通道蛋白基因cDNA克隆和表達(dá)分析

潘肖蘭1, 2, 3, 劉惠茹1, 2, 3, 許濛1, 2, 3, 許瀚之1, 2, 3, 張華1, 4, 何毛賢1, 4

1. 中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國科學(xué)院南海海洋研究所, 廣東 廣州 510301; 2. 廣東省應(yīng)用海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510301; 3. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 4. 中國科學(xué)院南海生態(tài)環(huán)境工程創(chuàng)新研究院, 廣東 廣州 510301

水通道蛋白4(aquaporin4, AQP4)是一類被動(dòng)運(yùn)輸水的通道蛋白。本研究根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的馬氏珠母貝片段, 采用RACE技術(shù)獲得了的全長cDNA, 命名為, 其5′非翻譯區(qū)(untranslated region, UTR)為114bp, 3′UTR為839bp, 開放閱讀框(open reading frame, ORF)為858bp, 編碼285個(gè)氨基酸。PfAQP4含有6個(gè)α螺旋跨膜區(qū)、5個(gè)環(huán)、1個(gè)主要內(nèi)嵌蛋白(major intrinsic protein, MIP)結(jié)構(gòu)域、2個(gè)NPA(Asn-Pro-Ala)基序, 屬于AQP1-like型。利用qPCR技術(shù)分析在不同組織、不同發(fā)育時(shí)期以及鹽度脅迫條件下的mRNA表達(dá)模式。結(jié)果顯示: (1)在所有被檢測(cè)組織中均表達(dá), 其中在閉殼肌、足和鰓中表達(dá)量較高; (2)在不同的發(fā)育時(shí)期均有表達(dá), 其表達(dá)量整體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì), 其中在2—4細(xì)胞期表達(dá)量最高, 在眼點(diǎn)幼蟲期表達(dá)量最低; (3) 在高鹽度組(36‰)鹽度脅迫24、72、120h后,表達(dá)量顯著上升, 在168h降至對(duì)照組水平; 在低鹽(16‰)組,表達(dá)量在24h顯著上調(diào), 在72h恢復(fù)至對(duì)照組水平, 說明鹽度影響鰓組織中的表達(dá)量, 也表明在馬氏珠母貝滲透壓調(diào)節(jié)中起著非常重要的作用。

馬氏珠母貝; 水通道蛋白4; 鹽度脅迫; 滲透壓調(diào)節(jié)

馬氏珠母貝()是一種生活于淺海的狹鹽性貝類, 適宜鹽度范圍為19.61‰~36.65‰(王如才等, 1993)。淺海是大陸架上方水體, 其鹽度容易受降雨以及長期無降雨的影響, 變化范圍通常較大。對(duì)于生長在淺海的物種來說, 及時(shí)響應(yīng)外界海水的鹽度變化尤為重要。在水產(chǎn)動(dòng)物中, 魚類滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制研究得較為深入, 部分魚類的滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制已經(jīng)得以闡明(林浩然, 1999), 而關(guān)于海水無脊椎動(dòng)物滲透壓調(diào)節(jié)的研究主要集中在甲殼類(Péqueux, 1995; Mcnamara et al, 2012)。海洋貝類馬氏珠母貝的此類研究還未見報(bào)道, 對(duì)其滲透壓調(diào)節(jié)的研究有助于理解其對(duì)鹽度變化的響應(yīng)。

水通道蛋白(aquaporin, AQP)在滲透壓調(diào)節(jié)中起重要作用, 該蛋白主要位于細(xì)胞膜, 通過響應(yīng)外界環(huán)境鹽度變化來指導(dǎo)水分的運(yùn)輸, 屬于主要內(nèi)嵌蛋白家族(major intrinsic protein, MIP)。CHIP28是一個(gè)28kD的疏水性跨膜蛋白(Denker et al, 1988), 1991年, 該蛋白被證實(shí)具有水運(yùn)輸功能并被更名為水通道蛋白1(aquaporin1, AQP1), 由此水通道蛋白正式被人類發(fā)現(xiàn)(Preston et al, 1992; Connolly et al, 1998)。人體中發(fā)現(xiàn)了13種AQP, 編號(hào)為0—12, 分為四種類型, 分別是AQP1-like(0、1、2、4、5、6), 只運(yùn)輸水, 水通道蛋白6(aquaporin6, AQP6)還可運(yùn)輸NO3+; AQP8-like(8), 可運(yùn)輸水和H2O2; AQP3- like(3、7、9、10), 可運(yùn)輸水和甘油; AQP11-like(11、12), 只含有一個(gè)NPA (Asn-Pro-Ala)序列, 目前對(duì)水的運(yùn)輸能力并不清楚(Campbell et al, 2008; Ishibashi et al, 2009; Soto et al, 2012)。AQP結(jié)構(gòu)以AQP1最為典型, 含有5個(gè)環(huán)(A—E)、6個(gè)跨膜區(qū)和兩個(gè)同向重復(fù)單元, 每個(gè)同向重復(fù)單元分別含有一個(gè)NPA序列。E環(huán)NPA序列前有一個(gè)汞抑制位點(diǎn)(Csy) (Hasegawa et al, 1994), 當(dāng)有機(jī)汞或離子汞與該位點(diǎn)結(jié)合后可抑制水的運(yùn)輸, AQP4不存在該位點(diǎn)(Parisi et al, 2007)。通常4個(gè)AQP亞基聚成一個(gè)四聚體, 每個(gè)單體中的兩個(gè)NPA序列折疊形成獨(dú)特的具有高度選擇性的“沙漏”形狀狹窄通道(Agre et al, 1993), 通道中有“芳香族/精氨酸(aromatic/ arginine, ar/R)選擇性過濾器, 只允許水分子排成單一縱列以適當(dāng)角度順勢(shì)通過(Agre et al, 2002; Ho et al, 2009)。AQP4水通透性最強(qiáng)(安皓, 2017)。在哺乳動(dòng)物中, AQP4與許多疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān), 特別是在創(chuàng)傷性腦損傷和腦卒中后引起的腦水腫的發(fā)展過程中起主要作用(Huang et al, 2007)。

在馬氏珠母貝中, 關(guān)于的研究還未見報(bào)道, 對(duì)于在鹽度脅迫下的表達(dá)特性還未知。本文通過RACE技術(shù)從馬氏珠母貝中獲得一個(gè)()的cDNA全長序列, 分析序列特性后通過qPCR技術(shù)分析在馬氏珠母貝不同組織、不同發(fā)育時(shí)期及不同鹽度脅迫時(shí)長下的mRNA表達(dá)情況, 為進(jìn)一步研究馬氏珠母貝的滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用的馬氏珠母貝為總重在7g左右的11月齡貝, 養(yǎng)殖于深圳市大鵬澳海區(qū)。

1.2 PfAQP4克隆

利用Magen公司通用RNA提取試劑盒提取全組織的總RNA, 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的cDNA片段設(shè)計(jì)5′和3′RACE引物(表1), 并進(jìn)行巢式PCR, PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳, 用Gel Extraction Kit (Omega)切膠回收, 回收的PCR產(chǎn)物用pMD?19-T Vector Cloning Kit(Takara)進(jìn)行TA連接后轉(zhuǎn)化Trans5α Chemically Competent Cell(TransGen), 藍(lán)白斑篩選重組子測(cè)序。

表1 本研究所用的引物序列

1.3 生物信息學(xué)分析

用NCBI ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih. gov/orffinder/)查找的開放閱讀框(open reading frame, ORF); 用prettyseq(http://www. bioinformatics.nl/emboss-explorer/)進(jìn)行序列展示; 用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì); 用ProtScale(https://web.expasy. org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)分析蛋白質(zhì)的親水性; 用TMpred(https://embnet.vital-it.ch/software/ TMPRED_form.html)進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測(cè); 用Origin 2018軟件進(jìn)行跨膜區(qū)數(shù)據(jù)處理; 用SMART(http:// smart.embl-heidelberg.de/)分析蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域; 用MatGAT2.01進(jìn)行氨基酸一致性分析; 用clustalx軟件進(jìn)行多序列比對(duì); 用BoxShade(https://embnet. vital-it.ch/software/BOX_form.html)和Adobe Illustrator CS6對(duì)多序列比對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理; 用SWISS- MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè); 用PyMOL軟件處理三級(jí)結(jié)構(gòu)模型; 用MEGA6以N-J法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 鹽度脅迫實(shí)驗(yàn)

將200只馬氏珠母貝隨機(jī)分為5組, 鹽度梯度設(shè)置為16‰、20‰、29‰、32‰、36‰。由于當(dāng)時(shí)養(yǎng)殖海區(qū)的海水鹽度為29‰, 故以鹽度29‰為對(duì)照組, 不同鹽度用海水和淡水或海水晶配置。每天8:00投喂扁藻1次, 14:00換水1次, 分別于處理后4、24、72、120、168h取樣, 每個(gè)鹽度組的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取5只貝的鰓組織用RNA保護(hù)劑(Takara)保存。

1.5 組織分布與不同發(fā)育時(shí)期樣品

用于組織分布實(shí)驗(yàn)的樣品取自3只貝, 每只貝取其鰓、足、外套膜、性腺、消化腺和閉殼肌6個(gè)組織保存。不同發(fā)育時(shí)期的樣品包含極體期、2—4細(xì)胞期、囊胚期、原腸期、擔(dān)輪幼蟲期、D型幼蟲期、殼頂幼蟲期、眼點(diǎn)幼蟲期、附著幼蟲期和稚貝期樣品。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR

按照1.2的方法提取鹽度脅迫實(shí)驗(yàn)、組織和不同發(fā)育時(shí)期樣品的總RNA, 用UV-Vis Spectrophotometer Q500(QUAWELL)測(cè)定RNA濃度, 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)RNA質(zhì)量。用帶有去除基因組功能的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix With gDNA Remover(Toyobo)進(jìn)行cDNA第一鏈合成, 用SYBR?Green Realtime PCR Master Mix(Toyobo)和Light Cycler 480(Roche, Switzerland),為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析, 每個(gè)樣品3個(gè)技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)體系為: SYBR?Green Realtime PCR Master Mix 5μL, 雙蒸餾水3.4μL, cDNA模板1μL, 上下游引物各0.3μL, 共10μL。反應(yīng)程序?yàn)? 95℃預(yù)變性10min; 95℃ 10s, 56℃ 15s, 72℃ 15s, 45個(gè)循環(huán)。2–Dct法計(jì)算相對(duì)mRNA表達(dá)量。用SPSS19.0軟件的單因素方差分析法(ANOVA)進(jìn)行顯著性分析(<0.01)。

2 結(jié)果

2.1 馬氏珠母貝PfAQP4的克隆和結(jié)構(gòu)分析

獲得的全長cDNA(GenBank No.: MN310685)為1837bp, 包含114bp的 5′非翻譯區(qū)(untranslated region, UTR), 839bp的3′UTR, 858bp 的ORF, 共編碼285個(gè)氨基酸(圖1)。

ProtParam分析得出該蛋白質(zhì)分子式為C1366H2146N350O396S11, 分子質(zhì)量為30.172kDa, 理論等電點(diǎn)(pI)為5.02; 含22個(gè)帶負(fù)電氨基酸(Asp+Glu)、15個(gè)帶正電氨基酸(Arg+Lys); 脂肪系數(shù)為105.72, 親水性總平均數(shù)為0.459, 為正數(shù), 故該蛋白是一類疏水性蛋白, 不穩(wěn)定指數(shù)計(jì)算為29.29(小于40), 是一類穩(wěn)定的蛋白。

圖1 PfAQP4的 cDNA全長序列及推導(dǎo)的氨基酸

小寫字母表示5′UTR和3′UTR序列, 大寫字母表示ORF序列, 陰影部分表示SMART預(yù)測(cè)的MIP結(jié)構(gòu)域, 方框示NPA序列, 下劃線示6個(gè)跨膜區(qū), *代表蛋白翻譯終止子, 粗體aataaa代表polyA加尾信號(hào)

Fig. 1 cDNA sequence and deduced amino acid sequence ofLower case letters indicate 5'UTR and 3'UTR, upper case letters indicate ORF, shaded areas indicate SMART-predicted MIP domains, boxes indicate NPA sequences, underlined letters indicate six transmembrane regions, and * represents protein translation terminator. aataaa in bold represents polyadenylation tail signal

TMpred和SMART分析表明該蛋白質(zhì)有1個(gè)MIP結(jié)構(gòu)域, 位于10~244AA; 有6個(gè)跨膜區(qū)(24~45AA、68~87AA、113~132AA、156~173AA、187~206AA、227~249AA); 5個(gè)環(huán), 分別是A—E, 與ProtScale分析PfAQP4親水性結(jié)果一致(圖2), 兩個(gè)NPA序列位于B環(huán)和E環(huán), 分別位于95~97AA和209~211AA。

利用SWISS-MODEL對(duì)PfAQP4序列進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè), 用Target-Template Alignment法進(jìn)行模型創(chuàng)建, 智人()AQP4(GenBank No.: 3GD8_A)為模板, 最后構(gòu)建的模型QMEAN為–3.79, GMQE為0.69, 說明構(gòu)建的模型質(zhì)量良好, 可用于該蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析。預(yù)測(cè)的PfAQP4三維結(jié)構(gòu)符合典型的水通道蛋白結(jié)構(gòu), 跨膜序列形成6個(gè)α螺旋包圍一個(gè)孔道, B、E環(huán)形成2個(gè)短螺旋以一定角度伸入孔道內(nèi), 共同形成一個(gè)只有水分子能夠通過的通道(圖3)。

2.2 多序列比對(duì)及進(jìn)化分析

MatGAT氨基酸一致性分析顯示馬氏珠母貝PfAQP4氨基酸序列與長牡蠣()和蝦夷扇貝()的AQP4氨基酸序列一致性較高, 分別為53.4%和52.2%, 與微生物停乳鏈球菌()和犬鏈球菌()的一致性較低, 分別為23.4%和23.5%(表2); 多序列比對(duì)顯示, PfAQP4與其他的AQP4蛋白序列較為一致, 都含有6個(gè)α螺旋跨膜區(qū)、5個(gè)環(huán)和2個(gè)NPA基序, F75、H197、C206、R212是構(gòu)成選擇性過濾器的4個(gè)氨基酸(圖4)。不同物種AQP4蛋白序列聚類分析發(fā)現(xiàn), 長牡蠣和蝦夷扇貝首先聚為一支, 其次與馬氏珠母貝聚為一支, 表明PfAQP4蛋白與長牡蠣和蝦夷扇貝AQP4蛋白親緣關(guān)系最近(圖5)。

圖2 PfAQP4疏水性示意圖

1—6表示6個(gè)跨膜區(qū); A—E表示5個(gè)環(huán); 窗口大小是指用于輪廓計(jì)算的間隔長度, 在計(jì)算給定殘基i的得分時(shí), 考慮以殘基i為中心的選定長度區(qū)間內(nèi)的氨基酸

Fig. 2 Hydrophobic plots of PfAQP4. Numbers 1-6 represents six transmembrane regions, A-E represent five loops, and the windows size refers to the interval length used for contour calculation. When calculating the score of a given residue i, the amino acids in the selected length interval centered on residue i are considered

圖3 PfAQP4 (a) 和H.sAQP4 (b) 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)

表2 PfAQP4與其他已知AQP4同源序列氨基酸一致性比較

α1—α6為6個(gè)跨膜區(qū), 方框表示NPA基序, 黑色背景白字表示縱列堿基保守性≥50%, 灰色表示縱列各堿基相似, 白色背景黑字表示堿基不保守

Fig. 4 Multi-sequence alignment of PfAQP4 with other species AQP4. α1-α6 represents six transmembrane regions, the box represents the NPA motif, the white letter with black background indicates the column are conserved (≥50%), the gray shading indicates the columns are similar, and the black letter with white background indicates that the residues are not conserved

圖5 PfAQP4與其他物種AQP4的系統(tǒng)進(jìn)化分析(N-J法)

2.3 PfAQP4在不同組織和不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量測(cè)定

在馬氏珠母貝的鰓、足、消化腺、閉殼肌、性腺和外套膜這6個(gè)組織中,都有表達(dá), 只是表達(dá)量高低的不同。在閉殼肌、足和鰓這3個(gè)組織中表達(dá)量最高, 其次為消化腺、性腺和外套膜(圖6)。

圖6 PfAQP4在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量

不同字母表示組間差異性顯著(<0.01)

Fig. 6 Relative expressions ofin different tissues. Different letters indicate significant differences between groups (<0.01)

在不同發(fā)育時(shí)期中均有表達(dá), 其表達(dá)在整體上呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì), 2—4細(xì)胞期表達(dá)量最高, 隨著胚胎發(fā)育向幼蟲發(fā)育時(shí)期推進(jìn),表達(dá)量緩慢下降, 在眼點(diǎn)幼蟲期表達(dá)量最低, 最高表達(dá)量為最低表達(dá)量的33.22倍(圖7)。

圖7 PfAQP4在不同發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量

2.4 鹽度脅迫對(duì)PfAQP4 mRNA表達(dá)量的影響

在16‰低鹽脅迫下,mRNA在4h的相對(duì)表達(dá)量為0.00179, 相應(yīng)時(shí)刻對(duì)照組mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.00191, 兩組間無顯著性差異; 在24h時(shí)mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.0351, 與對(duì)照組相比顯著上升(<0.01), 是對(duì)照組的20.98倍; 在72h時(shí),mRNA相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的1.14倍, 與對(duì)照組間無顯著性差異。

在20‰低鹽脅迫和在32‰高鹽脅迫下,mRNA相對(duì)表達(dá)量在所有時(shí)刻和對(duì)照組水平一致, 沒有顯著性差異。

在36‰高鹽脅迫下,mRNA在4h的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組無顯著性差異; 在24、72、120h,mRNA顯著高表達(dá)(<0.01), 相對(duì)表達(dá)量分別為0.00647、0.00607和0.00623, 分別為相應(yīng)時(shí)刻對(duì)照組的3.86、4.13和3.45倍; 在168hmRNA相對(duì)表達(dá)量降至0.00236, 為對(duì)照組的0.85倍, 無顯著差異(圖8)。

圖8 PfAQP4在不同鹽度脅迫下的相對(duì)表達(dá)情況

**表示同一鹽度組在不同時(shí)刻差異極顯著(<0.01)

Fig. 8 Relative expressions ofunder different salinity stress. ** indicates that the same salinity group is significantly different at different times (<0.01)

3 討論

3.1 PfAQP4的結(jié)構(gòu)與分類地位

本研究獲得的馬氏珠母貝的AQP編碼285個(gè)氨基酸, 該蛋白含有1個(gè)MIP結(jié)構(gòu)域, 6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域, 5個(gè)環(huán), 2個(gè)NPA基序, 第二個(gè)NPA基序后的Arg(R)高度保守, 符合AQP基因家族的特征。在構(gòu)成選擇性水孔構(gòu)件的4個(gè)氨基酸位點(diǎn)(F75、H197、C206、R212)中(Beitz et al, 2006; Kamegawa et al, 2016), 除了C206位點(diǎn), 其他3個(gè)位點(diǎn)的氨基酸在不同物種中都具有極高的保守性。在無脊椎動(dòng)物中C206位點(diǎn)氨基酸殘基為半胱氨酸(Csy), 而在脊椎動(dòng)物中該位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基為丙氨酸(Ala); 目前在哺乳動(dòng)物中已經(jīng)成功克隆了13種AQP, 而最先被發(fā)現(xiàn)且研究最清楚的AQP1蛋白序列的一個(gè)典型特征就是該位點(diǎn)氨基酸殘基為Csy, 以起到汞抑制性, 且只有AQP1存在這個(gè)特征, 其他專一性水分子通道不存在?；谛蛄刑卣? 馬氏珠母貝AQP應(yīng)歸為AQP1。

然而, 在系統(tǒng)進(jìn)化分析上, 馬氏珠母貝AQP與AQP4聚為一支?？紤]到低等無脊椎動(dòng)物和高等脊椎動(dòng)物的進(jìn)化地位不同, 序列特征可能有所不同, 因此我們認(rèn)為馬氏珠母貝AQP是屬于AQP4的一類蛋白, 將其命名為PfAQP4。進(jìn)化分析表明, PfAQP4首先與長牡蠣和蝦夷扇貝聚為一支, 然后與高等脊椎動(dòng)物聚為一支, 與微生物的遺傳距離較遠(yuǎn), 符合物種遺傳進(jìn)化關(guān)系。

3.2 PfAQP4在不同組織和不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式

在所有被檢測(cè)組織中均有表達(dá), 說明該基因?yàn)榻M成型表達(dá), 其中在閉殼肌、足和鰓表達(dá)量較高, 在消化腺、性腺和外套膜中較低。AQP4在不同物種的組織分布模式存在差異, 香港牡蠣()3種亞型的組織表達(dá)模式并不完全一樣, 在鰓和外套膜中的表達(dá)量最高, 閉殼肌的表達(dá)量次之(萬茜, 2014)56-58; 凡納濱對(duì)蝦()在其鰓、肌肉、腦和肝胰腺的表達(dá)量較高(高沿, 2016)40-42; 在尖吻角鯊()中,的表達(dá)量為肝臟>鰓>腸(Cutler et al, 2012)。這可能是因?yàn)椴煌锓N的生理特征不同, 導(dǎo)致在不同物種的不同組織中表達(dá)模式也不同。

在馬氏珠母貝不同發(fā)育時(shí)期中,的表達(dá)呈現(xiàn)先急劇升高, 然后緩慢下降, 最后緩慢升高的趨勢(shì)。馬氏珠母貝卵子在性腺內(nèi)的發(fā)育停留在減數(shù)分裂I前中期, 精卵結(jié)合后卵子繼續(xù)進(jìn)行減數(shù)分裂(沈亦平等, 1993; 何毛賢等, 2002)。海洋生物的胚胎發(fā)育需要適宜的鹽度, 鹽度不適宜會(huì)導(dǎo)致畸形率上升或者孵化率下降(張?chǎng)卫诘? 2006; 趙明等, 2011), 根據(jù)在馬氏珠母貝不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量變化, 推測(cè)PfAQP4可能參與馬氏珠母貝早期胚胎發(fā)育。

3.3 馬氏珠母貝對(duì)外界滲透壓力變化的調(diào)節(jié)機(jī)制

進(jìn)行滲透壓調(diào)節(jié)的生物可分為兩種類型, 分別是“滲透壓隨變者”(osmoconformers)和“滲透壓調(diào)節(jié)者”(osmoregulators), 前者是指在適應(yīng)鹽度波動(dòng)時(shí), 最終將內(nèi)部體液(即血液或血淋巴)的滲透壓調(diào)節(jié)到與外部介質(zhì)的滲透壓相同的水平。海洋無脊椎動(dòng)物雙殼貝類大部分屬于滲透壓隨變者, 在遇到鹽度壓力時(shí), 首先通過關(guān)閉貝殼、封閉外套腔來應(yīng)對(duì), 其次則由體內(nèi)與離子交換和水轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)基因的表達(dá)來進(jìn)行下一步調(diào)節(jié)(Davenport, 1979; Navarro, 1988; 水柏年, 2007)。貝類滲透壓的恒定主要是指貝類血淋巴的主要滲透效應(yīng)物與外部水環(huán)境中有機(jī)離子和無機(jī)離子含量平衡, 不會(huì)導(dǎo)致生物細(xì)胞膨脹或皺縮, 可以進(jìn)行正常生活的一種狀態(tài)。在無脊椎動(dòng)物中, 滲透壓主要效應(yīng)物包括各種無機(jī)離子和游離氨基酸等; Na+/K+-ATP酶被認(rèn)為參與甲殼類滲透壓調(diào)節(jié)(Wilder et al, 1998; 王劭雯, 2012), ?；撬嶙鳛橐环N游離氨基酸, 在哺乳動(dòng)物腦的滲透壓調(diào)節(jié)中起到重要作用(Pasantes-Morales et al, 1997), 馬氏珠母貝也含有大量的牛磺酸, 但其是否參與馬氏珠母貝滲透調(diào)節(jié)還未知。

目前未發(fā)現(xiàn)海洋貝類有專門用于滲透調(diào)節(jié)的器官, 其跟滲透壓調(diào)節(jié)關(guān)系最為緊密的是鰓組織。有研究報(bào)道, 在極端鹽度脅迫下, 海灣扇貝()的鰓組織和肝胰腺嚴(yán)重?fù)p傷(王吉橋等, 2001)。因此, 本研究對(duì)馬氏珠母貝鰓組織在不同鹽度脅迫下的mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。在低鹽(16‰)脅迫下,表達(dá)量在24h顯著上升, 為對(duì)照組的20.98倍, 在72h表達(dá)量下降至對(duì)照組水平, 在高鹽(36‰)脅迫下,mRNA相對(duì)表達(dá)量也在24h顯著上調(diào), 但只是對(duì)照組的4倍左右, 并保持該水平直至120h, 在168h降至對(duì)照組水平, 低鹽(16‰)組mRNA相對(duì)表達(dá)量的上升幅度比高鹽(36‰)組高出約5倍且恢復(fù)至對(duì)照組水平的時(shí)間較高鹽組快。說明在面對(duì)鹽度脅迫時(shí), 鰓通過升高的表達(dá)量來控制水分的進(jìn)出, 低鹽脅迫時(shí)作用時(shí)間短, 高鹽脅迫時(shí)作用時(shí)間長, 暗示馬氏珠母貝更容易適應(yīng)低鹽環(huán)境。面臨鹽度脅迫時(shí)表達(dá)量改變的現(xiàn)象也見于其他物種, 在香港牡蠣中, 低鹽脅迫和高鹽脅迫均顯著上調(diào)鰓組織AQP4的表達(dá)量(萬茜, 2014)61-62; 在凡納濱對(duì)蝦中, 高鹽脅迫顯著上調(diào)鰓表達(dá)量(高沿, 2016)50-55; 在大鼠中, 高鹽脅迫顯著上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)量(Arima et al, 2003); 在人體中, 高鹽脅迫顯著下調(diào)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)量(Willermain et al, 2014), 對(duì)于下調(diào)的原因, 研究者表示是由于AQP4發(fā)生內(nèi)化從而導(dǎo)致含量減少, 且內(nèi)化的原因是由鈉離子和氯離子介導(dǎo), 現(xiàn)醫(yī)學(xué)上正在開發(fā)AQP4抑制劑來治療腦水腫及高眼壓等癥狀(陳海, 2005; 丁穎, 2014)。在面對(duì)鹽度脅迫時(shí), 物種通過控制的表達(dá)來進(jìn)行滲透壓的調(diào)節(jié)。鑒于滲透調(diào)節(jié)是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng), 且不同生物體的不同組織由于結(jié)構(gòu)特征不同而具有不同的功能, 因此還要從不同物種、不同器官、離子交換、游離氨基酸含量等方面來解釋滲透壓調(diào)節(jié)。目前馬氏珠母貝的水分運(yùn)輸和滲透壓的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚,的調(diào)節(jié)機(jī)制也不明確, 有待進(jìn)一步的研究。

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Cloning and expression analysis of aquaporin genecDNA from

PAN Xiaolan1,2.3, LIU Huiru1,2, XU Meng1,2, XU Hanzhi1, 2, ZHANG Hua1, 3, HE Maoxian1, 3

1. CAS Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China;2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Applied Marine Biology, Guangzhou 510301, China;3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;4. Institution of South China Sea Ecology and Environmental Engineering, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China

Aquaporin 4 (AQP4) is a major channel that passively transports water. In this study, based on a fragment ofofobtained by transcriptome sequencing, the full cDNA was obtained using RACE technology, named, which includes 114 bp of 5'UTR, 839 bp of 3'UTR, and 858 bp of the Open Reading Frame (ORF) encoding a total of 285 amino acids. Thehas six alpha-helix transmembrane regions, five loops, one major intrinsic protein (MIP) domain, and two NPAs (Asn-Pro-Ala) motif, indicating that it belongs to AQP1-like type. Real-time fluorescent quantitative PCR was used to analyze the mRNA expression pattern ofin different tissues, different developmental stages, and different salinity stress conditions. The results showed that: (1)was expressed in all tested tissues, and its expression level was higher in adductor muscle, foot, and gill; (2) in different developmental stages,was increased first and then decreased, highly expressed in the 2-4 cell stage and lowly expressed in eye-spot larva stage; (3) the expression of gillmRNA in hypersaline group (36‰) increased significantly at 24h, 72h, and 120h, and returned to the control level at 168 h; in the hyposaline group (16‰),was significantly up-regulated at 24 h, and the expression level returned to the control level at 72h. These results showed that the salinity can affect the expression ofin gill, andhad a very important effect on the osmoregulation of

aquaporin 4, salinity stress, osmoregulation

Q753; S917.4

A

1009-5470(2020)03-0066-10

10.11978/2019074

http://www.jto.ac.cn

2019-08-19;

2019-11-28。

林強(qiáng)編輯

國家貝類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系崗位科學(xué)家(CARS-49); 海洋生態(tài)文明工程項(xiàng)目(ISEE2018PY03); 廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(

潘肖蘭(1996—), 女, 廣西壯族自治區(qū)河池市人, 碩士研究生, 研究方向?yàn)轳R氏珠母貝分子遺傳育種。E-mail: panxiaolan17@mails.ucas.edu.cn

何毛賢。E-mail: hmx2@scsio.ac.cn, 電話: 020-89023144

2019-08-19;

2019-11-28.

Editor: LIN Qiang

The Earmarked Fund for Modern Agro-industry Technology Research System ( CARS-49); Marine Ecological Civilization Project(ISEE2018PY03); Science and Technology Planning Project of Guangdong Province, China()

HE Maoxian. E-mail: hmx2@scsio.ac.cn, Tel: 020-89023144