鐘必鳳，鄧家林，李文貴，張全軍*，劉冬梅，曲么日布

(1. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所, 農(nóng)業(yè)部西南地區(qū)園藝作物生物學(xué)及種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室, 四川 成都 610066；2. 江油市農(nóng)業(yè)和畜牧局, 四川 江油 621700；3. 普格縣農(nóng)牧局 ，四川 普格 615300)

【研究意義】多年生木本植物，尤其是以生殖器官作為主要經(jīng)濟產(chǎn)出的果樹類植物，成花發(fā)生情況直接關(guān)系到生產(chǎn)產(chǎn)品的產(chǎn)出和質(zhì)量。高等植物的成花是由非常復(fù)雜的系統(tǒng)決定的，整合了自身遺傳信息的表達信號以及外界條件的影響[1]。這一過程包括了細胞生理和形態(tài)分化兩個過程?！厩叭搜芯窟M展】目前的研究表明，至少存在著光周期、春化反應(yīng)、自主控制途徑、赤霉素途徑等多個不同的途徑控制開花過程[2]。而這些過程可以彼此獨立，也可以相互交錯影響，將植物自身的發(fā)育信號與外界環(huán)境因子影響進行整合，共同決定營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)變。SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein like)是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，因其具有約80個氨基酸構(gòu)成的SBP結(jié)構(gòu)域，能結(jié)合到SQUAMOSA啟動子上而得名[3]。研究表明，SPL蛋白在調(diào)控植物成花中起著重要的調(diào)控作用，參與了包括促進植物成年態(tài)轉(zhuǎn)變[4]、調(diào)控GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[5]、連接光受體信號傳遞[2]、控制花器官形態(tài)發(fā)育[6]等一系列生理活動。通過整合miR156/157的調(diào)控功能，直接或間接影響成花有關(guān)蛋白[7]?！颈狙芯壳腥朦c】在我國南方地區(qū)，梨正?；ㄆ谠?-5月。但因為環(huán)境條件不適，如遭遇高溫、干旱等脅迫，可以在當(dāng)年8-10月再次開花(二次成花)。這一過程中，伴隨著礦質(zhì)養(yǎng)分、植物激素等多個水平的變化[8-9]，同時也涉及到復(fù)雜的基因表達變化過程[10]。該現(xiàn)象的發(fā)生給成花機理研究提供良好的機會。課題組前期研究表明，在正常條件下，可以通過人工可控的摘葉過程模擬二次成花發(fā)生[10]。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究從梨全基因組的角度對SPL編碼基因進行鑒定，同時關(guān)注其中在人工誘導(dǎo)二次成花過程中差異表達的成員，為繼續(xù)深入研究SPL蛋白在花發(fā)育過程中的作用提供前期準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 全基因組鑒定SPL蛋白編碼基因

白梨基因組序列從梨基因組項目獲得(南京農(nóng)業(yè)大學(xué))。從植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(plantTFdb)下載已經(jīng)鑒定的梨SPL蛋白家族成員序列。采用MAFFT軟件(v7.27)進行序列比對，使用HMMER3.1構(gòu)建隱馬爾科夫模型。最后采用HMMSEARCH對全基因組進行SPL蛋白搜索(E<0.00001)。對搜索獲得的候選SPL蛋白序列，提交NCBI保守結(jié)構(gòu)域(CDD)數(shù)據(jù)庫進行鑒定后進行人工校對。剔除候選蛋白中不含有SBP結(jié)構(gòu)域的序列，同時也剔除編碼基因中含有N的序列。

1.2 全基因組SPL蛋白的系統(tǒng)分類

對獲得的SPL蛋白序列，采用MAFFT軟件進行序列多重比對。采用IQTREE1.5.5軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹重建。其中氨基酸模型替代最優(yōu)模型采用Modelfinder模塊以貝葉斯信息指數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)進行選擇。對重建的系統(tǒng)發(fā)生樹，采用fastbootstrap自展校驗法評估單個進化分支拓撲結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

1.3 SPL的染色體定位

因目前沒有完整的梨染色體水平基因組數(shù)據(jù)，因此選用了公開的scaffold水平白梨基因組[11]為參考，對SPL編碼基因在每個scarfold上的物理排列進行繪圖。

1.4 摘葉誘導(dǎo)二次成花轉(zhuǎn)錄組SPL編碼基因差異表達分析

參考課題組前期工作[10]，以容易出現(xiàn)二次花的梨品種‘豐水’為材料，在采收果實后人工摘除葉片誘導(dǎo)二次成花。分別于摘葉后7，17，27 d (DF7，DF17, DF27)采集花芽為材料提取總RNA和轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建和測序(由博奧生物有限公司完成)。同時以未進行成花誘導(dǎo)的相同時間點的芽為對照(C7, C17, C27)同樣進行轉(zhuǎn)錄組分析。測序獲得的原始數(shù)據(jù)，剔除含有N大于50 %，質(zhì)量(Q-value)小于15的reads后，采用soap2軟件()進行基因組回帖。每個編碼基因?qū)?yīng)回帖的reads數(shù)為基礎(chǔ)，采用TPM算法進行單個基因表達量歸一化。相同時間點的處理和對照組對應(yīng)基因的表達量進行相對豐富度χ2檢驗。差異表達基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為變異倍數(shù)大于2，且校正后的P-value小于0.001。

2 結(jié)果與分析

2.1 梨SPL全基因組鑒定

在植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫中，共包含了33個白梨SPL蛋白序列。以這些序列為特征，通過隱馬爾科夫模型搜索，在整個基因組中共鑒定了36個候選SPL因子。人工校對過程中發(fā)現(xiàn)，1個候選因子不含有SBP結(jié)構(gòu)域，1個候選因子編碼基因中含有N，均予以剔除。最后全基因組鑒定的SPL蛋白編碼基因如表1所示。這些蛋白分子量變化范圍在11.5～128.1 kDa內(nèi)。分子量最大的蛋白為Pbr041959.1。SPL蛋白等電點范圍較廣，其中Pbr026854.1達到了10.3，說明該蛋白帶有較多帶正電荷側(cè)鏈，預(yù)示著其功能的特殊性。

2.2 SPL蛋白的系統(tǒng)分類分析

對獲得的SPL蛋白序列，結(jié)合擬南芥SPL家族成員序列信息[12]，采用IQTREE進行系統(tǒng)發(fā)育樹重建。最優(yōu)氨基酸替換模型JTT+F+R4構(gòu)建的系統(tǒng)樹如圖1所示?？傮w上，SPL蛋白根據(jù)氨基酸相似序列一致性可以分為3個大的類群。其中類群I和II包含的蛋白最多，分別為16個和14個，而第III類中包含了2個梨SPL蛋白，與擬南芥SPL蛋白At1G02065.1起源于共同祖先基因。若進一步按進行類群劃分，可以將34個梨SPL劃分為8個小的進化支系，與Cai等[13]人對棉屬植物SPL的劃分一致。

表1 梨全基因組SPL編碼基因鑒定及其蛋白特征

2.3 SPL蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

對獲得的SPL編碼蛋白序列，進一步進行保守蛋白結(jié)構(gòu)域分析(圖2)發(fā)現(xiàn)：絕大部分(29個)SPL蛋白僅含有該家族的特征結(jié)構(gòu)域SBP位點。但少數(shù)SPL成員還擁有其他功能蛋白結(jié)構(gòu)域，包括參與MYB-bHLH-WD40復(fù)合體的WD40結(jié)構(gòu)域(Pbr011184.3)，參與蛋白和蛋白互作的錨蛋白重復(fù)序列ANK(Pbr037762.1,Pbr015125.1,Pbr018552.1和Pbr037761.1)。這些典型的結(jié)構(gòu)特征預(yù)示著他們可能與其他蛋白互作形成復(fù)合體行駛功能。

圖1 基于SPL氨基酸序列的最大似然樹

圖2 SPL蛋白家族成員保守結(jié)構(gòu)域分析

2.4 SPL編碼基因的染色體定位情況分析

功能相關(guān)蛋白通常在染色體上集中排列[14]。以白梨公開的基因組序列為參考，34個鑒定的SPL編碼基因分布在27個scaffold上(圖3)。其中僅有scaffold67上串聯(lián)排列了3個SPL編碼基因，平均距離9088 bp。其余成簇排列的SPLs包括位于scaffold1上的Pbr000386.1和Pbr000388.1，scaffold1095上的Pbr002300.1和Pbr002303.1以及scaffold78上的Pbr037761.1和Pbr037762.1。有趣的是，這些成簇排列的SPLs一致性非常高，蛋白結(jié)構(gòu)特征上僅含有少量差異。比如，Pbr03776.1僅比Pbr03762.1多1個ANK結(jié)構(gòu)域。

圖3 SPL編碼基因在梨基因組scaffold上的分布情況

2.5 SPL基因在摘葉誘導(dǎo)二次花形成過程中的響應(yīng)

在前期的研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過人工摘葉處理，‘豐水‘梨可以在當(dāng)年完成花芽分化，并在9月開花[9]。該結(jié)果證明了在摘葉處理后，芽經(jīng)歷了由營養(yǎng)生長到生殖細胞轉(zhuǎn)變的生理分化和形態(tài)分化的完整過程。為了進一步挖掘可能參與了該過程的SPL轉(zhuǎn)錄因子，利用RNA-seq數(shù)據(jù)分析了34個SPL編碼基因在成花誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)條件下的差異表達情況。處理組合對照組在同一時間節(jié)點的比較發(fā)現(xiàn)，34個SPL編碼基因表達模式明顯可以歸為兩類(圖4)，21個SPL在整個觀察時間段內(nèi)表達量較高(TPM>4),其余的SPL基因為一類，在花芽中維持較低的表達水平。摘葉組和正常組基因差異表達分析僅鑒定出兩個差異表達的基因(圖4陰影高亮)。其中Pbr038289.1在摘葉處理27 d后被極顯著誘導(dǎo)，而Pbr002303.1在摘葉處理初期被極顯著抑制。在摘葉誘導(dǎo)成花中，27 d后花芽生理分化結(jié)束，形態(tài)分化已經(jīng)非常明顯，因此Pbr038289.1可能參與了花器官的發(fā)育過程或者配子育性的調(diào)控過程。而在成花誘導(dǎo)前期，Pbr002303.1可能在早期促花信號感應(yīng)中起作用。

3 討 論

現(xiàn)有的研究表明，SPL蛋白參與了植物胚胎發(fā)育、葉片、花和果實的發(fā)育，參與了赤霉素信號、光信號傳遞等多個生物性進程[15]。作為植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，在不同的植物材料中包含的成員數(shù)有很大的差異。擬南芥的基因組中共鑒定出了17個SPL家族成員[12]，煙草(Nicotianatabacum)基因組中包含有32個SPL編碼基因[16]，森林草莓基因組編碼了14個SPL蛋白[17]。甚至在同屬內(nèi)，不同種的SPL數(shù)目也差異巨大。亞洲棉(Gossypiumarboreum)包含有29個編碼基因，而陸地棉(G.hirsutum)則編碼了59個SPL蛋白[13]。在本研究中，首次揭示了白梨基因組中的34個完整SPL蛋白編碼基因。與擬南芥相比，數(shù)目激增。但不同物種中SPL蛋白進化類群數(shù)目較為接近，目前多數(shù)為8個亞類群[13, 17]。每個類群的擴張程度相較于擬南芥差異較大：如類群I中At5G50570.1所在的亞組中，擬南芥僅有兩個成員，而梨中包含了8個成員。證明在進化過程中，SPL發(fā)生了顯著的復(fù)制擴增，功能可能發(fā)生了分化。

盡管SPL蛋白家族成員氨基酸長度差異明顯，但均包含高度保守的SBP結(jié)構(gòu)域。在其他物種的研究中，除了SBP結(jié)構(gòu)域以外，SPL成員可能還包括其他一至多個其他蛋白結(jié)構(gòu)域。其中最為典型的是ALSLLS結(jié)構(gòu)域，作為miRNA156調(diào)控的靶序列存在于SPL的C端[6]。在本研究中的34個成員中，有14個含有該位點(進化類群II的成員)。這些結(jié)構(gòu)域的存在意味著他們在行駛生物性功能時能接受miRNA156的調(diào)控。在番茄中，超過半數(shù)的SPL基因都是miRNA156的調(diào)控靶標(biāo)，其中CNR直接參與了花器官的發(fā)育過程[18]。除此以外，本研究還發(fā)現(xiàn)了一個包含WD40結(jié)構(gòu)域的SPL蛋白。WD40蛋白通常情況下作為連接其它轉(zhuǎn)錄因子蛋白的中間體，蛋白不直接參與下游基因的轉(zhuǎn)錄激活過程[19]，因此Pbr011184.3可能作為特定蛋白復(fù)合體中的一員參與了特定生物反應(yīng)。

圓圈面積大小表示基因表達量高低(log2TPM), 差異表達的基因名用方框標(biāo)出

Xiong等[17]在草莓SPL基因的組織和時空表達特性分析中發(fā)現(xiàn)，SPL基因表達情況差異較大。miRNA156靶向的SPL基因均表現(xiàn)出組織表達特異性，而其他均組成型表達。這表明，差異表達的SPL在特定時間發(fā)揮其作用。在本研究中，34個SPL編碼基因在摘葉處理誘導(dǎo)成花過程中絕大部分表達變化不大。僅有2個差異表達的基因被鑒定出來(圖4)。其中表達量較高的Pbr038289.1表達得到明顯上調(diào)，進一步分析發(fā)現(xiàn)：該蛋白與蘋果的SPL4蛋白一致性達到了97 %。在擬南芥中，SPL3/4/5蛋白能夠整合發(fā)育信號，在miRNA156表達量下降的情況下轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，進而直接調(diào)控下游成花有關(guān)的蛋白如FD, LEAFY和FRUITFULL等編碼基因的表達[20]。在摘葉誘導(dǎo)二次花形成的過程中，SPL基因Pbr038289.1表達量的上調(diào)是否受miRNA156的影響目前仍不清楚，有待進一步的研究確認。

4 結(jié) 論

本研究基于已有的白梨(PyrusbretschneideriRehd.)基因組數(shù)據(jù)，從全基因組范圍對SPL轉(zhuǎn)錄因子編碼基因進行了鑒定，共獲得了34個典型的SPL蛋白家族成員，只有3個成員在目前的梨參考基因組上串聯(lián)排列。系統(tǒng)進化分析將34個成員劃歸為8個進化類群，與其他物種SPL分類一致。結(jié)合前期二次花誘導(dǎo)過程的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)：34個SPL蛋白編碼基因中僅2個顯著差異表達，其中Pbr038289.1顯著上調(diào)表達，而Pbr002303.1表達量顯著下降，這2個蛋白有望成為深入研究梨成花過程調(diào)控的重要靶點。