張松賀，周甜甜，劉遠(yuǎn)思

(河海大學(xué)環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210098)

水體污染造成的水生植物消退、藻類暴發(fā)以及生物多樣性降低等問題已經(jīng)成為當(dāng)今社會的熱點問題之一[1-3]。水生植物作為初級生產(chǎn)者，對整個水生生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、功能和穩(wěn)定性具有決定性的影響[4-5]。水生植物可以直接從水體吸收溶解態(tài)氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)，通過光合作用釋放氧氣，為水生動物提供食物、棲息和產(chǎn)卵場所，在改善水質(zhì)、抑制沉積物再懸浮方面起著重要作用[6-8]。因而，恢復(fù)水生植物對修復(fù)水生態(tài)系統(tǒng)和防治水體富營養(yǎng)化具有重要的意義。

浮葉植物和沉水植物的葉片通常漂浮或浸沒在水面，可以為細(xì)菌、藻類和其他微生物提供附著空間，形成微生物群落[9]。水生植物與生物膜之間存在復(fù)雜的相互作用：一方面水生植物可以為附生微生物提供營養(yǎng)物質(zhì)和微生態(tài)位[10]；另一方面水生植物分泌化感物質(zhì)，導(dǎo)致附生細(xì)菌群落的多樣性和宿主專一性[11]。葉片附著生物膜在水體污染物的分解、轉(zhuǎn)化和吸收方面起著重要作用的同時，還為水生植物提供光合作用所必需的二氧化碳，降低植物葉片受到的輻射[12]。然而，對植物表面附著微生物的結(jié)構(gòu)的研究尚不深入。

本研究以自然河流中4種水生植物(典型沉水植物金魚藻、伊樂藻和典型浮葉植物萍蓬草、菱角)表面的附著微生物為研究對象，利用熒光顯微鏡和電子顯微鏡觀測水生植物表面附著微生物的分布特征，并對藻類組成進(jìn)行分析；利用高通量測序技術(shù)，比較分析4種水生植物表面細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的差異性，以期為河流水生態(tài)修復(fù)工程提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況及樣品采集

水樣(取自水面下50 cm處)和植物樣品于2015年7月采集于江蘇省宿遷市沭陽縣新開河(圖1)。新開河地處農(nóng)村，周邊以農(nóng)田為主，無生活污水排入。植物樣品采集了沉水植物(金魚藻和伊樂藻)水面下10～20 cm處的新鮮葉片和浮葉植物(萍蓬草和菱角)新長出的葉片和水面下20～30 cm處的須根。每種植物至少取自3個樣品點，同一種植物樣品點間隔不少于150 m。

圖1 新開河采樣點位置

1.2 樣品測定

1.2.1水質(zhì)測定

TN質(zhì)量濃度采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定，TP質(zhì)量濃度采用鉬酸銨分光光度法測定。河流的TN質(zhì)量濃度為(3.07±0.01) mg/L,TP質(zhì)量濃度為(0.11±0.04) mg/L，總體來講水質(zhì)較好。收集的樣品在4 ℃下冷藏，6 h內(nèi)運回實驗室內(nèi)保存和處理。

1.2.2植物表面微生物數(shù)和附著藻類密度的測定

采集植物葉片3～5片放入裝有10 mL磷酸緩沖液(pH值7.2)的離心管中，在225 r/min的速度下震蕩10 min，然后在50 W的功率超聲下清洗 1 min，將附著微生物從葉片上分離。為測定微生物濃度，選取100 μL不同稀釋梯度的混勻洗脫液，并加入700 μL濃度為10 μg/mL的DAPI工作液，避光染色30 min，過濾至0.22 μm的黑色背景whatman濾膜上,將濾膜制片在熒光顯微鏡下觀察、拍照后計數(shù)[13]。將洗脫完微生物的葉片取出，鋪平放置在鋪有保鮮膜的玻璃板上，在光下以直尺為對照進(jìn)行拍照，計算其表面積，后放入65 ℃烘箱內(nèi)至恒重，記下干質(zhì)重。

取出適量洗脫液，并加入適量的魯戈試劑固定。膠頭滴管滴2～3滴稀釋后的樣品于浮游生物計數(shù)框中央，蓋上蓋玻片，小心擦去蓋玻片周圍多余液體，放在顯微鏡下用40倍物鏡觀察。

1.2.3掃描電鏡分析

將切取后的樣品依次用30%、50%、70%、80%、90%的酒精脫水各15 min，再用100%的酒精脫水兩次，每次15 min，在冷凍干燥儀中干燥12 h后備用。處理后的樣品經(jīng)粘樣、噴金后使用日立S-4800場發(fā)射掃描電鏡進(jìn)行觀察[9]。

1.2.4附著生物膜細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的測定

洗脫的生物膜的主要來自金魚藻、伊樂藻、萍蓬根、萍蓬葉、菱角根、菱角葉，將洗脫的生物膜分裝、存放于2 mL離心管中冷凍保存(-80 ℃)。生物膜樣品DNA提取按照DNA提取試劑盒(MoBio Laboratories, USA)說明進(jìn)行，每組樣品3個平行樣。隨后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性和純度，同時利用NanoDrop One檢測DNA的濃度和純度。隨后對細(xì)菌的16S rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 引物為342F(5′-CTACGGGGGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACCGGGGTATCT-3′)。PCR反應(yīng)和高通量測序在上海美吉公司進(jìn)行，使用Roche 454 GS FLX+ Titanium測序平臺(Roche 454 Life Sciences, Branford, CT, U.S.)測序。利用QIIME(version 1.17)對原始序列進(jìn)行處理，得到高質(zhì)量序列。使用Usearch(vsesion 7.1)按照97%相似性對非重復(fù)序列(不含單序列)進(jìn)行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列。最后采用RDP Classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并分別在各個分類水平——域、界、門、綱、目、科、屬、種統(tǒng)計各樣本的群落組成[14]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)的處理及作圖使用Origin 8.0。利用PAST生態(tài)學(xué)分析軟件進(jìn)行聚類分析,利用Heml軟件繪制熱圖(heatmap)，運用“circlize”包通過RStudio軟件繪制弦圖。網(wǎng)絡(luò)圖(network)利用“psych”包基于Spearman相關(guān)系數(shù)在RStudio軟件上分析后，運用Gephi進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水生植物葉片和根表面附著微生物密度

如表1所示，在同一水域中，金魚藻的單位質(zhì)量附著微生物密度最大，其次為萍蓬草根、萍蓬草葉、伊樂藻、菱角根和菱角葉。金魚藻單位葉面積附著微生物密度最大，其次為菱角、萍蓬草和伊樂藻。

表1 植物表面單位質(zhì)量和單位葉面積附著微生物密度

2.2 水生植物葉片附著生物膜結(jié)構(gòu)特征

圖2為金魚藻、伊樂藻、萍蓬草和菱角葉片表面的掃描電鏡照片。金魚藻葉片表面顆粒物較少，生物膜結(jié)構(gòu)不明顯，存在少量藻類、桿菌和球菌；伊樂藻葉片表面顆粒物較多，生物膜結(jié)構(gòu)明顯，存在大量藻類，未觀察到菌落；萍蓬草葉片表面顆粒物很多，生物膜結(jié)構(gòu)不明顯，只觀察到零散的幾個硅藻和桿菌；菱角葉片表面顆粒物較多，生物膜結(jié)構(gòu)明顯，觀察到大量藻類和桿菌。

(a) 金魚藻

(b) 伊樂藻

(c) 萍蓬草

(d) 菱角

2.3 水體中浮游藻類和水生植物葉片表面附著藻類密度及組成

表2為水生植物表面的附著藻類密度。在相同水域條件下，植物葉片單位質(zhì)量附著藻類密度從大到小順序為：伊樂藻，金魚藻，萍蓬草，菱角。植物葉片單位面積附著藻類密度從大到小順序為：金魚藻，伊樂藻，菱角，萍蓬草。

表2 植物單位質(zhì)量和單位葉面積附著藻類密度

從新開河水體及水生植物葉片表面上共檢測出綠藻門、藍(lán)藻門、硅藻門、黃藻門、隱藻門和裸藻門共6個門以及42個屬。不同植物類型表面的藻類有一定的差異，金魚藻和萍蓬草的優(yōu)勢藻類為硅藻門，其次為綠藻門和藍(lán)藻門；伊樂藻和菱角的優(yōu)勢藻類為綠藻門、硅藻門和藍(lán)藻門；新開河水體里浮游藻類的優(yōu)勢藻類依次為綠藻門、藍(lán)藻門、硅藻門和裸藻門(圖3(a))。

(a) 門水平

(b) 屬水平

金魚藻、伊樂藻、萍蓬草和菱角葉片表面分別檢測出24、20、15和15種藻屬，而新開河水體內(nèi)有19種藻屬，其中，10個藻屬均存在于4種水生植物葉片上，5個藻屬在新開河水體和4種水生植物葉片上均有檢出。豐度最高的5個藻屬依次為：小球藻、微囊藻、卵形藻、雙菱藻和色球藻，其中小球藻和微囊藻在新開河水體和4種水生植物葉片上的比例均較高，尤其是在水體里，卵形藻在萍蓬草上的比例遠(yuǎn)高于其他樣品，而雙菱藻在萍蓬草上的比例遠(yuǎn)低于其他樣品，色球藻只存在于水樣中(圖3(b))。

2.4 水生植物表面附著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與功能

根據(jù)高通量數(shù)據(jù)結(jié)果的注釋，對多樣性指數(shù)進(jìn)行了分析，結(jié)果如表3所示。由Ace指數(shù)和Chao指數(shù)可知，金魚藻、萍蓬草根和菱角根附著生物膜群落豐度較高。由Shannon指數(shù)可知，萍蓬草根、伊樂藻和菱角根附著生物膜群落多樣性較高。根據(jù)OTU水平上的聚類分析圖(圖4(a))，可知浮葉植物萍蓬草和菱角的根和葉表面附著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。

表3 水生植物樣品細(xì)菌測序數(shù)據(jù)和多樣性指數(shù)

6種表面生物膜樣品中共檢測出36個細(xì)菌門，包含有13個優(yōu)勢門(至少1個樣品中的豐度大于1%)。金魚藻、伊樂藻、萍蓬草和菱角的根葉表面生物膜中優(yōu)勢細(xì)菌門類依次為變形菌門(Proteobacteria，22.66%～48.37%)、厚壁菌門(Firmicutes，0.97%～41.54%)、綠彎菌門(Chloroflexi，18.51%～36.93%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，2.04%～11.86%)、酸桿菌門(Actinobacteria，3.11%～11.57%)和疣微菌門(Verrucomicrobia，2.92%～10.69%)。變形菌門在各個樣品中相對豐度均較高，尤其在菱角葉片上；厚壁菌門在萍蓬草葉片和金魚藻上明顯高于伊樂藻、萍蓬草根、菱角葉片和根部，且在萍蓬草葉片上最高；擬桿菌門在金魚藻表面最高；綠彎菌門、酸桿菌門和疣微菌門在菱角根和萍蓬草根表面較高(圖4(b))。在屬水平上，6個樣品中共發(fā)現(xiàn)682個細(xì)菌屬，其中46個屬的相對豐度在至少一個樣品中大于1%，優(yōu)勢屬為微桿菌屬(Exiguobacterium)、Caldilineaceae_uncultured、Acidaminobacter屬、Enterobacteriaceae_unclassified、庫特氏菌屬(Kurthia)、Acidaminococcaceae_uncultured和Subgroup_6_norank。

(a) OTU水平聚類

(b) 門水平弦圖

基于46個屬進(jìn)行共現(xiàn)性分析，結(jié)果如圖5所示。至少1個樣品中相對豐度大于1%，每個節(jié)點代表一個屬，每條邊代表所連的屬間的相關(guān)性，去除小于3個屬的組，紅色表示正相關(guān)，藍(lán)色表示負(fù)相關(guān)。圖5有42個節(jié)點和102條邊，42個屬之間呈顯著性相關(guān)(Spearman’s |r|>0.6,p<0.05)，平均度為4.857，平均聚類系數(shù)為0.559。在42個節(jié)點中，有29個節(jié)點的屬隸屬于變形菌門、厚壁菌門和疣微菌門。在102條邊中，其中有68條邊連接的屬呈正相關(guān)，34條邊連接的屬呈負(fù)相關(guān)。

3 討 論

沉水植物和浮葉植物及其根系上面都有大量的藻類和細(xì)菌等微生物附著，沉水植物附生藻類的密度顯著高于浮葉植物[14]，這些和植物葉片的結(jié)構(gòu)差異有關(guān)，如金魚藻的葉片為針狀，而伊樂藻的葉片較小，比浮葉植物的比表面積大，能為附著微生物提供更大的固著面積[15]。浮葉植物的附著微生物主要分布在葉片下方，使得藻類獲取陽光的效率降低，進(jìn)而影響藻類的生長[14]。水體內(nèi)藻類與不同植物表面附著藻類的群落結(jié)構(gòu)間存在著一定的差異(圖3)。這些差異，一方面可能與宿主植物的結(jié)構(gòu)和化感作用有關(guān)[16]；另一方面，與浮游藻類相比，附著在沉水植物表面的藻類從水中和植物組織中獲取營養(yǎng)方面具有競爭優(yōu)勢。

圖5 細(xì)菌主要屬之間相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

浮葉植物菱角和萍蓬草根單位質(zhì)量總菌數(shù)、Ace指數(shù)、Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)均大于葉，浮葉植物的根表面細(xì)菌群落豐富度和多樣性較高。其主要原因一方面是菱角和萍蓬草葉片下表面存在大量的微生物，而葉片上表面由于暴露在空氣中會受到紫外線和水分減少的影響導(dǎo)致微生物較少[17]；另一方面是由于它們的根貼近沉積物，附著在根上的微生物棲息于特定的生態(tài)位，這些生態(tài)位的營養(yǎng)物質(zhì)來源和環(huán)境參數(shù)可能受到植物根、地表水、沉積物成分甚至水生動物的影響。因此，水生植物根上附著微生物豐富度和多樣性通常高于葉表面。

根據(jù)高通量測序結(jié)果，4種水生植物根和葉表面附著細(xì)菌群落優(yōu)勢門類依次為變形菌門、厚壁菌門、綠彎菌門、擬桿菌門、酸桿菌門和疣微菌門。不同水生植物和同種植物不同器官上附著細(xì)菌群落組成均不同，如伊樂藻、菱角葉片、菱角根和萍蓬草根上的優(yōu)勢門為變形菌門和綠彎菌門，而金魚藻和萍蓬草葉片上的優(yōu)勢門為厚壁菌門、變形菌門和綠彎菌門。這些結(jié)果表明不同植物載體乃至組織器官上附著的微生物群落具有一定的差異性，這與洪澤湖內(nèi)沉水和浮葉植物附著生物膜的結(jié)果相似[14]。已有研究表明，植物化感作用和分泌出的多酚類等物質(zhì)可能是造成植物附生微生物量和微生物組成差異的主要因素之一[14]。細(xì)菌群落組成的差異性也可能與空間分布有關(guān)，萍蓬草和菱角的葉漂浮在水面上，而金魚藻和伊樂藻的整個植株浸在水中。水生植物空間分布不同，進(jìn)而生長環(huán)境也不同，水流、光照條件和營養(yǎng)濃度等方面也不同，從而導(dǎo)致細(xì)菌群落的差異性。植物表面微生物在水生態(tài)系統(tǒng)中能量轉(zhuǎn)換和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收等方面起著關(guān)鍵作用，水生態(tài)系統(tǒng)中水生植物的修復(fù)可以增加微生物的多樣性和數(shù)量，增加生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

變形菌門內(nèi)大多數(shù)都是兼性或?qū)Ｐ詤捬醯漠愷B(yǎng)細(xì)菌，對有機物和氮的去除有重要作用[18]。根據(jù)圖4，組一和組二內(nèi)的屬間主要呈正相關(guān)關(guān)系，其中，組一內(nèi)的屬主要來自芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、α-變形菌綱、β-變形菌綱和γ-變形菌綱，主要分布在伊樂藻和菱角葉片表面，γ-變形菌和β-變形菌是污水處理系統(tǒng)中參與有機質(zhì)降解的主要細(xì)菌[19-20]，具有降解復(fù)雜有機大分子的能力。而組二中的屬主要來自α-變形菌綱，Rhodobacter、Rhizobium、Rhodobacteraceae_unclassified、Hyphomicrobium和MNG7_norank屬間呈顯著正相關(guān)關(guān)系，主要分布在浮葉植物葉片上。Rhodobacter、Rhizobium、Rhodobacteraceae_unclassified和Hyphomicrobium均是好氧反硝化菌，能在好氧條件下進(jìn)行反硝化。生絲微菌屬可以在處理成熟堆填區(qū)滲濾污水方面發(fā)揮重要作用，芽孢桿菌屬能吸收利用多種有機碳源，假單胞菌屬可以降解碳?xì)浠衔铩Ｈ欢?，?變形菌綱內(nèi)的Aeromonas與組二內(nèi)的Hyphomicrobium、Rhodobacter和MNG7_norank呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(主要分布在浮葉植物葉片上)，而Aeromonas也可與厚壁菌門內(nèi)的Acidaminobacter和擬桿菌門內(nèi)的Paludibacter、vadinBC27_wastewater-sludge_group呈正相關(guān)關(guān)系(主要分布在金魚藻上)。有研究顯示Acidaminobacter、Aeromonas和Paludibacter為嚴(yán)格厭氧或兼性厭氧菌[21]。金魚藻葉片能夠吸附大量懸浮顆粒物，可能為這些厭氧或兼性厭氧菌提供了低氧或無氧環(huán)境。

組三內(nèi)的屬來自10個門，主要來自疣微菌門和綠彎菌門。其中變形菌門的屬Comamonadaceae_unclassified與酸桿菌門內(nèi)的Subgroup_4_norank、擬桿菌門的Saprospiraceae_uncultured、綠彎菌門內(nèi)的Chloroflexi_uncultured、Armatimonas屬和疣微菌門內(nèi)的Verrucomicrobiaceae_unclassified和OPB35_soil_group_norank屬呈顯著正相關(guān)關(guān)系，主要分布在萍蓬草和菱角的根部；而Kurthia和Peptostreptococcaceae_incertae_sedis(厚壁菌門，主要分布在萍蓬草葉表面)均與OPB35_soil_group_norank、Candidate_division_WS3_norank、Candidate_division_BRC1_norank和Sphingomonadales_unclassified呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。綠彎菌門是光合自養(yǎng)菌，兼性厭氧，可降解難降解的有機碳。綠彎菌門可能附著在萍蓬草和菱角靠近沉積物的低氧環(huán)境中。有研究表明酸桿菌門在根際土壤中含量豐富，具有較高的代謝活性，而疣微菌門普遍存在于土壤中[22]。擬桿菌和厚壁菌對有機物的降解起到非常重要的作用。綜上所述，呈正相關(guān)關(guān)系的屬以相對較高的豐度出現(xiàn)在同一載體上，而呈負(fù)相關(guān)關(guān)系的屬則出現(xiàn)在不同載體上，即不同種類或同種植物不同部位地附著于生物膜內(nèi)。這些菌的生態(tài)功能需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

a. 新開河4種水生植物中，沉水植物金魚藻和浮葉植物萍蓬草、菱角的根表面微生物群落豐度較高；萍蓬草根、伊樂藻和菱角根表面附著群落多樣性較高；金魚藻單位質(zhì)量和單位面積表面附著總菌數(shù)最高，金魚藻和伊樂藻單位質(zhì)量和單位面積附著藻類密度最高。

b. 4種水生植物附生藻類優(yōu)勢門相同，而附生藻類組成與周圍水體的藻類組成不同。

c. 不同水生植物表面附著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)均不相同，附生細(xì)菌群落具有多樣性和宿主專一性。萍蓬草和菱角的根表面細(xì)菌群落組成相似性較高，而與4種水生植物葉片表面細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成差異較大。