王佳興 謝巖黎 宋 娟

(河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院1，鄭州 450001) (河南省糧油食品安全檢測(cè)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，鄭州 450001)

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑及培養(yǎng)基配置

細(xì)胞培養(yǎng)液的配制：在90 mL培養(yǎng)基(RPMI 1640培養(yǎng)基)中加入10 mL胎牛血清，必要時(shí)加入1%的雙抗(青鏈霉素混合液)，配制成RPMI 1640完全培養(yǎng)基。

2-氨基芴、大鼠肝S9活化系統(tǒng)、二甲基亞砜(DMSO)、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、RPMI-1640培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液、磷酸鹽緩沖液(PBS)、CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株及細(xì)胞

鼠傷寒沙門氏菌TA98，TA100：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

人肝癌細(xì)胞系HepG2，由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供。

1.2 儀器與設(shè)備

BC-J二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱；LGT-10C真空冷凍干燥機(jī)；BM-37XB倒置顯微鏡； Infinite F50酶標(biāo)儀；血球計(jì)數(shù)板。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Ames實(shí)驗(yàn)1.3.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株培養(yǎng)

將兩個(gè)菌株分別接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯(按GB15193.4—2014配置)中，37 ℃搖床(100 r/min)培養(yǎng)10 h，培養(yǎng)過程中注意用錫紙包裹。

1.3.1.2 自發(fā)回變數(shù)的測(cè)定

向2 mL頂層培養(yǎng)基(融化狀態(tài))中加入菌液0.1 mL，迅速搖勻倒入底層培養(yǎng)基平板中，轉(zhuǎn)動(dòng)平板使平板表面平整均勻，37 ℃培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)每個(gè)平板的菌落總數(shù)。

1.3.1.3 AFB1降解后的致突變性(Ames)實(shí)驗(yàn)

1)受試物的準(zhǔn)備

將25μL AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度為100 μg/mL)與975 μL PADE在37 ℃，180 r/min暗處降解72 h，分別在降解0、1、2、3 d的時(shí)間點(diǎn)向反應(yīng)體系中加入3 mL的二氯甲烷渦旋進(jìn)行萃取，獲得降解后的有機(jī)相受試物(二氯甲烷層)和水相受試物，有機(jī)相在氮?dú)庀麓蹈芍匦氯芙庠贒MSO，使原AFB1的濃度分別為2.5、0.5、0.1 μg/mL；水相進(jìn)行冷凍干燥，重新溶解在DMSO中，與有機(jī)相設(shè)置相同濃度稀釋。將DMSO作為溶劑對(duì)照，0.1 mg/mL的氨基芴作為陽性對(duì)照，所有待檢測(cè)溶液都要過濾除菌。

2)平板摻入法測(cè)定AFB1降解后的致突變性

與自發(fā)回變數(shù)的操作相同，只是加入菌液的同時(shí)加入0.1 mL的受試物溶液(將0.1 mL菌液與0.1 mL受試物溶液提前混合或者先向頂層培養(yǎng)基中加入受試物45 ℃水浴，再加入菌液)，代謝活化組還需要加入0.5 mL大鼠肝S9活化溶液。

1.3.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖-毒性

AFB1的準(zhǔn)備：分別配置1.0、2.5、5.0、10.0μg/mL的AFB1溶液，在氮?dú)庀麓蹈桑肈MSO溶解，再添加RPMI-1640完全培養(yǎng)液，使DMSO的含量為1%。

降解后產(chǎn)物的準(zhǔn)備：降解反應(yīng)結(jié)束后(72 h)，通過二氯甲烷萃取分別獲得有機(jī)相和水相，有機(jī)相通過氮?dú)獯蹈啥燃淄椋瑲埩粑镉肈MSO(1%)溶解，再用RPMI-1640完全培養(yǎng)液稀釋，使原AFB1濃度分別為1.0、2.5、5.0、10.0 μg/mL；水相通過冷凍干燥去除水分，重新溶解在DMSO(1%)中，加入RPMI-1640完全培養(yǎng)液，配置相應(yīng)濃度的待測(cè)物質(zhì)。

將制備的細(xì)胞懸液以及不含細(xì)胞的完全培養(yǎng)液(100 μL/孔)加入96孔板，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜(待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)良好)，再將孔板取出加入10 μL不同濃度的待測(cè)物質(zhì)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再向每孔中加入10 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中孵育1～4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度。設(shè)置空白孔(無細(xì)胞的培養(yǎng)液，不加藥)，對(duì)照孔(含細(xì)胞的培養(yǎng)液，1%DMSO的培養(yǎng)液)，實(shí)驗(yàn)孔(含細(xì)胞的培養(yǎng)液，不同濃度的待測(cè)物質(zhì))。細(xì)胞存活率的計(jì)算：

2 結(jié)果與分析

2. 1 Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株生物學(xué)鑒定標(biāo)準(zhǔn)

對(duì)于生物學(xué)特性鑒定合格及自發(fā)回變菌落數(shù)在正常范圍內(nèi)(表1)的測(cè)試菌株可進(jìn)行樣品測(cè)試。平板摻入法的結(jié)果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為[20-22]，測(cè)試菌株TA98的回變菌落數(shù)等于或大于無處理對(duì)照組的2倍，其他測(cè)試菌株的回變菌落數(shù)等于或大于無處理對(duì)照組的2倍，并具有以下兩種情況之一的可判定為陽性結(jié)果：1)有劑量-反應(yīng)關(guān)系；2)某一測(cè)試點(diǎn)有可重復(fù)的陽性結(jié)果。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株生物學(xué)鑒定標(biāo)準(zhǔn)

注：+表示陽性，-表示陰性。

2.1.2 自發(fā)回變數(shù)的測(cè)定

由表2可知，這兩株菌的自發(fā)回變菌落數(shù)均在正常范圍內(nèi)。

表2 測(cè)試菌株的自發(fā)回變數(shù)

2.1.3 AFB1降解后的致突變性分析

在未有代謝活化物激活受試物的情況下(圖1)，未降解組(降解0 d)，有機(jī)相受試物測(cè)試，在2.5 μg/mL濃度時(shí)，TA98和TA100的回變菌落數(shù)較大(大于陽性對(duì)照組)，且在0.1 μg/mL濃度下，TA98的回變菌落數(shù)與濃度呈比例關(guān)系；在降解1 d的情況下，有機(jī)相受試物測(cè)試，三個(gè)濃度下TA98和TA100的回變菌落數(shù)超過溶劑對(duì)照的2倍，但濃度與回變菌落數(shù)之間不存在比例關(guān)系，且與未降解組相比回變數(shù)明顯減少；在降解2 d的情況下，有機(jī)相受試物測(cè)試，三個(gè)濃度下TA98和TA100的回變菌落數(shù)明顯減少(與降解0 d和降解1 d的相比)，濃度與回變菌落數(shù)之間無比例關(guān)系，TA98的回變菌落數(shù)遠(yuǎn)超過溶劑對(duì)照組的兩倍，TA100的回變菌落數(shù)達(dá)到溶劑對(duì)照組的一倍多；在降解3 d的情況下，有機(jī)相受試物測(cè)試，TA98和TA100在三個(gè)濃度下的回變菌落數(shù)與溶劑對(duì)照組及自發(fā)回變相比，無很大差別。水相受試物測(cè)試中，整個(gè)過程三個(gè)濃度下TA98和TA100的回變菌落數(shù)與溶劑對(duì)照的無明顯差別。

注：a、b分別為TA98和TA100在AFB1劑量分別在0.1、0.5、2.5 μg/mL情況下有機(jī)相受試物的致突變性；c、d分別為TA98和TA100在AFB1劑量分別在0.1、0.5、2.5 μg/mL情況下水相受試物的致突變性。圖1 待測(cè)物致突變性檢測(cè)結(jié)果(S9-)

結(jié)果顯示，在降解0 d 時(shí)，有機(jī)相受試物為致突變陽性，且致突變性極強(qiáng)(較強(qiáng)的致癌性)，在降解1 d到降解2 d時(shí)，AFB1已經(jīng)降解一部分，總的來看還是呈現(xiàn)致突變陽性，在降解3 d時(shí)，呈現(xiàn)致突變陰性；在該實(shí)驗(yàn)條件下水相受試物對(duì)TA98和TA100無致突變作用。

在代謝活化物(S9)活化情況下(圖2)，所有測(cè)試組的回變菌落數(shù)與未代謝活化的相比普遍增多。未降解組(降解0 d)，有機(jī)相受試物測(cè)試，TA98的回變菌落數(shù)在濃度0.1 μg/mL時(shí)呈相應(yīng)的比例關(guān)系，TA100的回變菌落數(shù)大于陽性對(duì)照組并遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于溶劑對(duì)照組；隨著降解時(shí)間的延長(zhǎng)，三個(gè)濃度下TA98和TA100的回變菌落數(shù)均呈下降趨勢(shì)。在降解3 d的情況下，有機(jī)相呈現(xiàn)致突變陰性。水相受試物測(cè)試中，整個(gè)過程三個(gè)濃度下TA98和TA100的回變菌落數(shù)與溶劑對(duì)照的無明顯差別。

結(jié)果顯示，在降解0 d時(shí)，有機(jī)相受試物(AFB1)表現(xiàn)出強(qiáng)致突變作用；在降解1 d到降解2 d時(shí)，降解的量還很少，有機(jī)相受試物中還存在較多的AFB1，仍是表現(xiàn)出致突變陽性；在降解3 d的情況下，有機(jī)相呈現(xiàn)致突變陰性。在該實(shí)驗(yàn)條件下水相受試物對(duì)TA98和TA100均無致突變作用。

結(jié)果表明，AFB1經(jīng)過降解后，其致突變性明顯降低，降解3 d后，其降解產(chǎn)物已表現(xiàn)出致突變陰性結(jié)果。李文明[23]研究AFB1降解產(chǎn)物的致突變性，將反應(yīng)體系經(jīng)旋蒸干燥重新溶解，通過Ames實(shí)驗(yàn)的平板摻入法檢測(cè)降解產(chǎn)物的致突變性，得到降解產(chǎn)物是低毒或無毒的結(jié)果，與本研究結(jié)果相似。Alberts等[24]和Rao等[25]均將有機(jī)相和水相進(jìn)行了Ames實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，得到了相似的結(jié)論。

注：a、b分別為TA98和TA100在AFB1劑量分別在0.1、0.5、2.5 μg/mL情況下有機(jī)相受試物的致突變性；c、d分別為TA98和TA100在AFB1劑量分別在0.1、0.5、2.5 μg/mL情況下水相受試物的致突變性。圖2 待測(cè)物致突變性檢測(cè)結(jié)果(S9+)

2.2 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

2.2.1 AFB1處理HepG2細(xì)胞后的細(xì)胞存活率

HepG2細(xì)胞在1.0、2.5、5.0、10.0 μg/mL的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液作用24 h后，利用cck-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，以未經(jīng)任何處理的細(xì)胞作為對(duì)照，AFB1作用24 h后的細(xì)胞活性隨著 AFB1濃度的增加而呈下降趨勢(shì)，2.5 μg/mL時(shí)細(xì)胞活性已低于72%，10.0 μg/mL時(shí)細(xì)胞活性已低于56%。

2.2.2 AFB1降解后的細(xì)胞毒性

在所測(cè)濃度范圍內(nèi)，降解后產(chǎn)物對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率均小于17%，降解后有機(jī)相的細(xì)胞毒性隨著AFB1的濃度增加略有提高但無明顯差異，初始濃度為2.5 μg/mL的AFB1經(jīng)降解后，有機(jī)相降解液作用于細(xì)胞的存活率達(dá)到92%；初始濃度為10.0μg/mL的AFB1經(jīng)降解后，有機(jī)相降解液作用于細(xì)胞的存活率達(dá)到83%，降解后水相對(duì)HepG2的細(xì)胞存活率均在91%以上。數(shù)據(jù)分析，降解后的細(xì)胞毒性與降解前相比明顯降低，只有微量毒性，這與Liu等[26]研究結(jié)果相似。

2.2.3 不同濃度的AFB1及其降解物對(duì)HepG2細(xì)胞的影響

對(duì)照組(未處理)細(xì)胞呈多邊形密度大。經(jīng)過AFB1處理的細(xì)胞，數(shù)量明顯減少，部分細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著改變，細(xì)胞褶皺，有些細(xì)胞死亡而不再緊密貼壁，有些細(xì)胞呈圓形，還有些細(xì)胞呈現(xiàn)半透明狀態(tài)推測(cè)其即將凋亡(圖3)。

圖3 不同濃度AFB1處理下的HepG2細(xì)胞狀態(tài)

不同濃度AFB1降解后作用于HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞其數(shù)量稍有減少(倒置顯微鏡下觀察)。圖4為有機(jī)相降解液對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響，整體上細(xì)胞濃度有所減少，有些細(xì)胞邊界不清晰，折光性差。圖5為水相降解液對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響，整體細(xì)胞狀態(tài)比有機(jī)相降解液處理的細(xì)胞狀態(tài)稍好，細(xì)胞形態(tài)稍有改變，折光性稍差。在5.0 μg/mL的濃度下，細(xì)胞有些稀少；在10.0 μg/mL的濃度下，細(xì)胞密度大，可見對(duì)細(xì)胞的毒害較小，這與前人的研究結(jié)果相似[27]。

圖4 不同濃度有機(jī)相降解液對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響

圖5 不同濃度水相降解液對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響

3 結(jié)論

本研究對(duì)AFB1經(jīng)PADE降解后的產(chǎn)物進(jìn)行毒性分析，將降解后的產(chǎn)物分為有機(jī)相和水相，分別對(duì)有機(jī)相和水相進(jìn)行Ames實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)分析。

1)Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AFB1經(jīng)PADE降解后對(duì)鼠傷寒沙門氏菌TA98、TA100的致突變作用顯著小于空白對(duì)照組(未降解的AFB1)，甚至與自發(fā)突變無顯著差異，降解3 d后，其降解產(chǎn)物已表現(xiàn)出致突變陰性結(jié)果。

2)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，與未處理細(xì)胞組相比，經(jīng)AFB1降解產(chǎn)物作用的細(xì)胞存活率均達(dá)到83%以上。AFB1經(jīng)PADE降解后其細(xì)胞毒性明顯降低(與AFB1相比)，在低濃度AFB1經(jīng)過降解的情況下，降解后無細(xì)胞毒性。