張國(guó)輝 綜述 隨蓓蓓 審校

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院,日照 276826)

在我國(guó),每年約有14萬肝癌新發(fā)患者,占全世界新發(fā)肝癌人數(shù)50%以上，其死亡率極高，已成為嚴(yán)重危害人類健康的重要疾病[1]。Hippo信號(hào)通路作為近年來腫瘤抑制研究的熱點(diǎn)，在調(diào)節(jié)器官大小，組織生長(zhǎng)與再生中扮演重要角色。此外Hippo通路可以通過影響內(nèi)皮細(xì)胞的活化，進(jìn)而調(diào)控血管萌發(fā)、血管屏障形成和血管重構(gòu)等生理活動(dòng)[2]。因此，Hippo信號(hào)通路中的各調(diào)控因子在腫瘤血管生成中的調(diào)控作用成為研究治療腫瘤的重要突破口。

1 Hippo通路

Hippo信號(hào)通路由多種保守激酶串聯(lián)組成，可通過影響細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡來控制器官大小和組織生長(zhǎng)。人Hippo通路組成大體分為三種：核心分子(MST、LATS、SAV、MOB)、上游調(diào)節(jié)因子[KIBRA、Merlin(NF2)、Expanded(Ex)等]和主要效應(yīng)分子(YAP/TAZ )。Hippo信號(hào)通路調(diào)節(jié)過程主要包括接頭蛋白(SAV1、MOB1A、MOB1B)和激酶(MST1/2、LATS1/2)的磷酸化，以及下游轉(zhuǎn)錄因子YAP/TAZ的磷酸化和降解。首先，MST1/2與SAV1形成復(fù)合物，使LATS1/2的疏水基序(HM)磷酸化(其中LATS1HM為T1079，LATS2HM為T1041)，磷酸化的HM觸發(fā)LATS1/2活化環(huán)(AL)的自磷酸化(LATS1 AL為 S909；LATS2 AL為S872)(圖1)。其次，當(dāng)HM和AL均被磷酸化后，LATS1/2被完全激活，完全激活后的LATS1/2進(jìn)一步與YAP/TAZ作用[3]，使后者滯留于胞質(zhì)中無法行使轉(zhuǎn)錄作用，以阻止細(xì)胞增殖[4]。反之，未磷酸化的YAP/TAZ入核，促進(jìn)各類生長(zhǎng)基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。當(dāng)Hippo信號(hào)通路在行使正常生理功能時(shí)，其通路各成員處于相對(duì)平衡狀態(tài)，嚴(yán)格調(diào)控組織細(xì)胞的增殖與凋亡，進(jìn)而控制器官的形狀和大小。

注：a.LATS上的HM(T1079/T1041)被MST-MOB復(fù)合體磷酸化，該過程MOB起促進(jìn)作用；b.HM磷酸化后，LATS上的AL(S909/S872)自磷酸化，該過程MOB起促進(jìn)作用

圖1 Hippo通路激活機(jī)制

2 Hippo信號(hào)通路與肝癌血管生成

血管生成是指從已有的血管中發(fā)展而形成新血管的過程，其中包括舊基底膜破裂與降解，內(nèi)皮細(xì)胞的活化、增值、分化、遷移，新血管網(wǎng)形成等過程。血管系統(tǒng)的生成機(jī)制復(fù)雜，受多種通路和因子的調(diào)控。

動(dòng)物組織和器官的生長(zhǎng)離不開血管網(wǎng)絡(luò)的生成，提示Hippo信號(hào)通路與血管生成相關(guān)通路存在一定的交互和串?dāng)_，并且Hippo通路的異常調(diào)節(jié)已被證實(shí)參與包括肝臟在內(nèi)的多個(gè)器官腫瘤血管的發(fā)生過程[5]。在某些情況下，Hippo信號(hào)通路中的核心成員YAP/TAZ，亦能繞過激酶模塊進(jìn)行非Hippo通路的調(diào)節(jié)作用[6]，這更增加了其生物學(xué)復(fù)雜性。

2.1 Hippo信號(hào)通路上游與肝癌血管生成

Hippo信號(hào)通路上游受多種因素調(diào)控，其主要調(diào)控分子MST1/2、LATS1/2和效應(yīng)分子YAP/TAZ與多種血管生成信號(hào)途徑產(chǎn)生交集。其中YAP/TAZ為血管生成等生理功能的“交叉口”分子[7]，參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)各種生理活動(dòng)。

2.1.1Merlin(NF2) Merlin(NF2)是Hippo通路中重要的調(diào)節(jié)分子，與Expanded(Ex)、KIBRA組成復(fù)合體，共同激活MST1/2激酶以抑制YAP/TAZ的活性，并以此抑制腫瘤生長(zhǎng)。Merlin(NF2)不僅參與對(duì)Hippo通路的調(diào)控，還可以與某些抗血管生成因子產(chǎn)生作用，例如：SEMA3F[8]，后者在維持正常的生理性血管中發(fā)揮重要作用，并在肝細(xì)胞癌(HCC)的發(fā)生過程中具有重要意義，提示Merlin(NF2)在肝臟腫瘤血管生成中具有潛在調(diào)節(jié)作用。此外，Merlin(NF2)還可以與β2-血影蛋白作用，共同參與對(duì)肝癌干細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)[9]。Merlin(NF2)作為維持細(xì)胞骨架穩(wěn)定性的重要蛋白質(zhì)，其調(diào)控的生物學(xué)效應(yīng)與其功能息息相關(guān)。主要原因可能是受細(xì)胞密度影響的環(huán)境適應(yīng)，即高密度細(xì)胞的接觸抑制。在腫瘤發(fā)生過程中，接觸抑制喪失是其發(fā)生的關(guān)鍵因素，并可能會(huì)引起細(xì)胞骨架穩(wěn)定性的變化，進(jìn)而促進(jìn)各種轉(zhuǎn)錄因子的核轉(zhuǎn)移?？梢奙erlin(NF2)作為重要的腫瘤抑制因子，具有成為藥物新靶點(diǎn)的潛力。

2.1.2血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)/內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR) VEGF/VEGFR是典型的血管生成信號(hào)通路，二者在調(diào)節(jié)血管上皮細(xì)胞的活化中具有重要意義[10]。Azad等[11]開發(fā)了一種LATS生物傳感器屏幕，通過對(duì)LATS激酶活性的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)VEGF/VEGFR通路可以通過PI3K-AKT間接抑制MST1/2與LATS1/2的活性；這表明VEGF/VEGFR通路的部分功能可能需要Hippo通路中關(guān)鍵成員的介導(dǎo)，特別是一些涉及細(xì)胞增殖和細(xì)胞極性的效應(yīng)，如：血管生成和血管上皮細(xì)胞遷移等。此外，VEGFR在肝癌組織細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并成為預(yù)后的關(guān)鍵指標(biāo)，提示在肝癌發(fā)生過程中，VEGF/VEGFR通過Hippo通路間接影響腫瘤微環(huán)境(TME)的穩(wěn)定性，并在腫瘤形成初期的腫瘤大小過渡階段，調(diào)節(jié)新生血管環(huán)境——血管微環(huán)境的產(chǎn)生以維持腫瘤內(nèi)部所需要的必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。因此，切斷TME的形成途徑，是防止肝癌以及其他惡性腫瘤新生和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵思路。目前，酪氨酸激酶抑制劑(TKI)可以抑制包括VEGFR在內(nèi)的多種酪氨酸激酶受體，通過影響血管微環(huán)境的產(chǎn)生阻止腫瘤的生長(zhǎng)，在肝癌臨床治療中廣泛應(yīng)用。但由于VEGFR處于通路的上游，容易受其他通路的代償性補(bǔ)充等影響而喪失療效，所以靶點(diǎn)下移是解決代償性耐藥的方法之一。Hippo通路中兩大激酶和兩大效應(yīng)因子作為其下游的重要調(diào)控分子，為靶向治療提供了思路。

2.1.3血管蛋白家族 血管蛋白家族主要包括血管蛋白(AMOT)、類血管蛋白1(AMOTL1)和血管平滑肌樣蛋白2(AMOTL2)，該家族在調(diào)節(jié)血管生成和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)中具有重要功能。AMOTs與Hippo通路密切相關(guān)，可直接調(diào)控YAP/TAZ的定位與活性[12]，并且可以作為腳手架蛋白將MST-SAV、LATS-MOB、YAP/TAZ三種復(fù)合體組合，使級(jí)聯(lián)反應(yīng)快速、穩(wěn)定進(jìn)行[13]。AMOTs大多在血管內(nèi)皮、上皮細(xì)胞中表達(dá)，通過調(diào)節(jié)這些細(xì)胞的活性來影響血管生成，提示在腫瘤血管細(xì)胞內(nèi)，AMOTs表達(dá)下調(diào)可使YAP/TAZ核轉(zhuǎn)移并伴隨Hippo通路失活，引發(fā)血管細(xì)胞的增殖。Liu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌引起的高糖性狀態(tài)下，AMOT喪失了對(duì)YAP/TAZ的抑制，使YAP/TAZ去磷酸化入核，上調(diào)各種血管生成相關(guān)基因。這可能跟肝癌某些病理特征相呼應(yīng)，為腫瘤的發(fā)生與發(fā)展提供了正反饋的條件基礎(chǔ)。雖然AMOT蛋白在該通路激酶級(jí)聯(lián)中的作用機(jī)制已基本確定，但AMOT介導(dǎo)的復(fù)雜而又精確的血管生成機(jī)制仍不明確。

2.1.4血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(VE-cadherin) VE-cadherin是一類存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的黏附連接蛋白，參與調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的極性，并在肝癌組織血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)強(qiáng)烈[15]。VE-cadherin可以通過PI3K-AKT使Hippo通路關(guān)鍵激酶MST和LATS失活，導(dǎo)致YAP/TAZ的核聚集并導(dǎo)致Ang-2表達(dá)上調(diào)[16]；其中對(duì)YAP/TAZ的直接調(diào)節(jié)可能涉及細(xì)胞骨架F-actin的穩(wěn)定性，即穩(wěn)定的細(xì)胞骨架可以將其滯留于細(xì)胞質(zhì)中。此外，VE-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞間連接與細(xì)胞密度直接相關(guān)，當(dāng)細(xì)胞密度降低導(dǎo)致細(xì)胞間穩(wěn)定連接減少時(shí)，YAP的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移量增加，基因表達(dá)上調(diào)，反之亦然(圖2)。這提示肝臟腫瘤中血管生成可能部分依賴于Hippo通路的激活。通過對(duì)上文VEGFR和VE-Cadherin的研究可以發(fā)現(xiàn)，AKT是Hippo通路和血管生成通路產(chǎn)生串?dāng)_的關(guān)鍵橋梁之一；存在AKT對(duì)Hippo通路的調(diào)節(jié)，這將意味著其他更多通路以及某些生理效應(yīng)也可通過某種手段經(jīng)AKT介導(dǎo)參與激活Hippo的旁效應(yīng)。但機(jī)體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是一種精準(zhǔn)有規(guī)律的調(diào)節(jié)方式，AKT如何精確介導(dǎo)Hippo調(diào)節(jié)血管生成是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)領(lǐng)域必須要解決的一大難題。

注：a.Crb介導(dǎo)TJ的形成，由AMOT將YAP/TAZ固定于細(xì)胞膜上;b.VE-Cadherin在穩(wěn)定連接(SJ)時(shí)抑制PI3K-AKT，在不穩(wěn)定連接(UJ)時(shí)激活PI3K-AKT;c.Merlin復(fù)合物上游受CD44、FAT4等受體激活;d.已證實(shí)YAP/TAZ與Smad存在相互作用，但具體機(jī)制不清楚

圖2 Hippo信號(hào)通路在血管生成中的調(diào)控

2.1.5Rho Rho家族蛋白屬于小GTP結(jié)合蛋白，與細(xì)胞骨架有密切關(guān)系，可間接參與調(diào)節(jié)細(xì)胞極性、血管生成等多種生理效應(yīng)。Rho在多種肝癌組織細(xì)胞中表達(dá)量明顯升高，與肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，主要由于Rho參與對(duì)細(xì)胞骨架重組的調(diào)節(jié)并以此促進(jìn)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。此外，Rho所具有的潛在的血管生成功能可能與Hippo通路有關(guān)，可抑制AMOT的磷酸化并存在某種特殊機(jī)制抑制Hippo通路[17]，提示Rho可通過AMOT-MST、AMOT-LATS等復(fù)合體調(diào)控Hippo通路，進(jìn)而激活血管生成途徑；此過程可能廣泛存在于血管上皮細(xì)胞中。此外，Rho可通過與細(xì)胞骨架密切相關(guān)的因子如：YAP/TAZ、Merlin(NF2)等進(jìn)一步與Hippo通路產(chǎn)生串?dāng)_，但具體分子機(jī)制仍有待挖掘。

2.1.6細(xì)胞機(jī)械力 目前對(duì)腫瘤細(xì)胞機(jī)械力的研究大多集中于細(xì)胞外基質(zhì)硬度等方面，特別是基質(zhì)硬度增加引起的組織壓力和組織張力升高，在腫瘤的檢測(cè)和治療中有重要意義。Hippo通路關(guān)鍵成員YAP/TAZ作為重要的機(jī)械力感受器，參與外界物理環(huán)境改變等相關(guān)應(yīng)答，并可以直接通過受機(jī)械力擠壓的核孔復(fù)合體進(jìn)行核轉(zhuǎn)移[18]。幾乎90%的HCC患者合并肝硬化，即肝細(xì)胞外基質(zhì)硬度增加。提示較高的基質(zhì)硬度有利于肝癌細(xì)胞的增殖，其中可能與YAP/TAZ對(duì)基質(zhì)硬度的響應(yīng)有關(guān)。此外，血管上皮細(xì)胞作為機(jī)械力學(xué)敏感細(xì)胞，可能通過YAP/TAZ來介導(dǎo)機(jī)械力引起細(xì)胞生理活動(dòng)[19]?？傊?，細(xì)胞機(jī)械力等物理因素在肝癌發(fā)展和肝癌血管生成中的作用愈發(fā)重要。

2.2 Hippo下游與肝癌血管生成

YAP/TAZ作為Hippo通路下游效應(yīng)因子，介導(dǎo)了多種分子間的相互作用，參與多種靶基因的調(diào)控。

2.2.1TGF-β/CTGF 結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)是一類分泌肽，屬新的富含半胱氨酸生長(zhǎng)因子家族，具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞遷移和分化等功能，并作為一種促血管生成因子調(diào)節(jié)腫瘤血管的產(chǎn)生。在HCC中，不管是受激酶級(jí)聯(lián)還是旁效應(yīng)導(dǎo)致的YAP/TAZ核轉(zhuǎn)移，都會(huì)引起CTGF表達(dá)上調(diào)，表明CTGF是YAP/TAZ的關(guān)鍵靶基因。CTGF在腫瘤血管生成中具有重要意義，可通過影響腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(TAFs)間接參與腫瘤血管生成；TAFs是TME的重要組成部分，與血管微環(huán)境的產(chǎn)生有關(guān)；特別是TAFs中Hippo通路介導(dǎo)的CTGF分泌量的問題，可能是腫瘤血管生成的關(guān)鍵，但尚未對(duì)TAFs中Hippo活化程度的研究。Chen等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在非酒精脂肪性肝病(NAFLD)中YAP/TAZ與TGF-β/Smad信號(hào)通路產(chǎn)生相互作用；TGF-β是CTGF的強(qiáng)效誘導(dǎo)劑，提示TGF-β/Smad可能通過YAP來上調(diào)CTGF的表達(dá)。此外，Smad通路還可以非依賴YAP/TAZ來獨(dú)立調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移[21]。

2.2.2MFAP5 MFAP5是一種微纖維相關(guān)糖蛋白(MAGP)，在構(gòu)建微纖絲網(wǎng)絡(luò)具有重要作用，并在多種腫瘤基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)[22]。MFAP5可以通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮其潛在的血管生成功能。Marti等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在膽管癌(CC)細(xì)胞中，MFAP5是YAP/TAZ的直接轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)，并且MFAP5的上調(diào)將直接導(dǎo)致細(xì)胞活力的增加。此外，由于MFAP5在惡性CC中普遍上調(diào)，與癌細(xì)胞增殖、腫瘤血管生成高度相關(guān)，已成為CC診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。提示YAP/TAZ異常核轉(zhuǎn)移引起的MFAP5上調(diào)在肝癌進(jìn)程調(diào)控方面具有重要意義。

2.2.3Ang/Tie2 Ang/Tie2包括血管生成素(Ang)與其受體血管生成素受體酪氨酸激酶(Tie)。是除VEGF/VEGFR之外，與血管生成關(guān)系最緊密的一個(gè)體系[24]。Ang/Tie2在各類癌組織中表達(dá)量均增高，與腫瘤血管生成有緊密聯(lián)系。Choi等[25]研究發(fā)現(xiàn)在肝臟腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中，Ang-2是YAP/TAZ的直接作用靶點(diǎn)。提示Hippo通路可能直接作為腫瘤血管生成的信號(hào)。此外，Ang-2也可以通過YAP調(diào)節(jié)血管張力，在新生血管和血管重構(gòu)中起著重要作用[26]。這可能與VE-Cadherin存在功能相關(guān)。

3 小結(jié)與展望

Hippo通路的異常激活或抑制對(duì)腫瘤血管發(fā)生起著重要調(diào)節(jié)作用。其中，YAP/TAZ作為Hippo通路主要效應(yīng)因子，引起了科學(xué)家的廣泛關(guān)注。針對(duì)Hippo信號(hào)通路各成員的效應(yīng)劑特別是下游TAZ/YAP的抑制劑，已經(jīng)進(jìn)行了許多臨床試驗(yàn)，并在腫瘤的靶向治療中取得了初步進(jìn)展。但如果我們只關(guān)注靶向針對(duì)其核心分子來開展相關(guān)研究和治療，則難以在癌癥后續(xù)治療中達(dá)到好的治療效果。首先，在細(xì)胞和組織層面，Hippo介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞活化機(jī)制并不明確，Hippo調(diào)節(jié)TME穩(wěn)態(tài)的機(jī)制也不明確。其次，在分子層面，AMOT既作為血管生成關(guān)鍵因子，又作為Hippo通路重要的調(diào)節(jié)分子，可能是賦予Hippo通路血管生成功能的關(guān)鍵因子，但調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚。在肝癌組織血管生成中，Hippo信號(hào)通路仍然存在太多我們未知的因素。解決這些問題，可使我們更深入地了解Hippo信號(hào)通路，為肝癌的治療提供新思路。