王警 張雪寒 郭蕓蕓 張碧成 吳慶俠 何孔旺

摘要：為了調(diào)查江蘇地區(qū)奶牛場大腸桿菌中blaNDM基因的分子流行病學(xué)特征。從江蘇部分地區(qū)3個奶牛場采集樣品134份，使用PCR和測序的方法篩選blaNDM陽性大腸桿菌，同時對其進(jìn)行超廣譜β-內(nèi)酰胺酶類基因的檢測，采用藥敏試驗檢測blaNDM陽性大腸桿菌對19種常用抗生素的敏感性，通過多位點序列分型（MLST）和脈沖場凝膠電泳（PFGE）對攜帶NDM基因的大腸桿菌進(jìn)行親緣關(guān)系分析，通過質(zhì)粒結(jié)合試驗驗證blaNDM基因的可轉(zhuǎn)移性。結(jié)果顯示，從134份奶牛場樣品中共分離15株blaNDM陽性大腸桿菌，包括NDM-1和NDM-5 2種變體。15株blaNDM陽性大腸桿菌對多種抗生素均呈現(xiàn)不同程度的耐藥，奶牛場15株blaNDM陽性大腸桿菌包括7種ST型，分別是ST410、ST846、ST206、ST101、ST1642、ST3076、ST1626，同一種ST型在糞便樣品和環(huán)境樣品中同時存在，表明相同ST型blaNDM陽性大腸桿菌可在動物與環(huán)境間相互傳播。PFGE試驗結(jié)果表明，15株blaNDM陽性大腸桿菌可以分為11個簇，同一樣品的分離株傾向于相同的簇，在比較小的范圍內(nèi)存在PFGE圖譜相同的現(xiàn)象;對15株菌株的結(jié)合子進(jìn)行blaNDM基因的轉(zhuǎn)移性試驗結(jié)果表明，15株大腸桿菌的blaNDM耐藥基因均通過質(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)移至受體菌J53。表明，blaNDM陽性大腸桿菌在江蘇省部分地區(qū)奶牛場中流行相對較為嚴(yán)重，存在多重耐藥現(xiàn)象，推測blaNDM基因主要通過質(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)移的方式進(jìn)行水平傳播，這為食品源耐藥菌的監(jiān)測及風(fēng)險評估提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：NDM耐藥基因;大腸桿菌;多位點序列分型;藥敏試驗

中圖分類號：S852.61+2文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1000-4440（2020）02-0391-07

Abstract：To investigate the epidemiology and molecular characteristics of blaNDM gene in Escherichia coli from dairy farms in Jiangsu province， a total of 134 samples were collected from three dairy farms in Jiangsu province. The blaNDM-positive E. coli was screened using PCR and sequencing， and the extended-spectrum β-lactamase gene was detected. The antimicrobial susceptibility testing was used to detect the sensitivity of blaNDM-positive E. coli to 19 commonly used antibiotics. The genetic relationship of E. coli carrying NDM gene was analyzed by multi-locus sequence typing （MLST） and pulsed-field gel electrophoresis （PFGE）. The transferability of blaNDM gene was verified by conjugation experiments. The results showed that fifteen strains of blaNDM-positive E. coli were isolated from 134 dairy samples， including NDM-1 and NDM-5. All fifteen strains of blaNDM-positive E. coli exhibited different resistance to multiple antimicrobials and belonged to seven STs， namely ST410， ST846， ST206， ST101， ST1642， ST3076， ST1626. The same ST was involved in both fecal and environmental samples， indicating that blaNDM-positive E. coli with the same type of ST could be transmitted from animals to environment. The results of PFGE showed that fifteen strains of blaNDM-positive E. coli could be divided into 11 clusters， isolates of the same sample tended to have the same PFGE cluster， and the same PFGE pattern existed in a relatively small range. The blaNDM gene of fifteen strains of E. coli was transferred to receptor bacterium J53 by binding with plasmids. The blaNDM-positive E. coli is relatively more prevalent in dairy farms in Jiangsu， and there is multi-drug resistance. The blaNDM gene is mainly transmitted by means of combined transfer， which provides a basis for monitoring and risk assessment of drug-resistant bacteris.

Key words：drug-resistant gene NDM;Escherichia coli;multi-locus sequence typing（MLST）;antimicrobial susceptibility testing

新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶（NDM）能夠水解除單環(huán)β-內(nèi)酰胺酶類外的所有金屬內(nèi)酰胺酶（MBL）[1-2]，包括碳青霉烯酶。碳青霉烯酶是治療許多革蘭氏陰性細(xì)菌引起的嚴(yán)重感染的主要抗微生物劑[3-4]，是在臨床治療中的最后一道防線。目前臨床上無法獲得NDM酶水解內(nèi)酰胺類藥物的抑制劑，包括克拉維酸，他唑巴坦和舒巴坦。NDM-1最初是在2008年從印度新德里住院的瑞典患者中分離出的肺炎克雷伯菌中鑒定出來的，此后陸續(xù)在腸桿菌科、不動桿菌屬和假單胞菌的各種物種中發(fā)現(xiàn)NDM-1，并已鑒定出24種NDM變體，其中肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌是blaNDM基因主要攜帶者，對于大腸桿菌，其ST410、ST167、ST617是最流行的[5]。NDM陽性菌株已在世界范圍內(nèi)傳播并被發(fā)現(xiàn)，在印度次大陸，中東和巴爾干各島地區(qū)的流行率最高，對臨床管理和公共衛(wèi)生構(gòu)成了重大挑戰(zhàn)[6-7]。

不僅在醫(yī)院，這種攜帶blaNDM基因的菌株在社區(qū)和環(huán)境中也有發(fā)現(xiàn)。近些年來，已在食品源動物、伴侶動物、野生動物中發(fā)現(xiàn)NDM陽性菌[8]。2017年Wang等[9]對肉雞產(chǎn)業(yè)鏈中blaNDM基因進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)NDM陽性大腸桿菌來源于商品雞場，并可在商品雞場的雞、狗、人、家燕和蒼蠅等不同生物間傳播。2019年Liu等[10]在鵝場的水樣中發(fā)現(xiàn)了ST48型的攜帶blaNDM-5的大腸桿菌，這是第一次在水禽環(huán)境中發(fā)現(xiàn)NDM陽性大腸桿菌。2017年He等[11]首次在江蘇省奶牛糞便和生牛乳中發(fā)現(xiàn)攜帶blaNDM-5的肺炎克雷伯菌。在國外，2013年Ghatak等[12]在牛奶樣品中發(fā)現(xiàn)了攜帶有blaNDM的大腸桿菌，同年歐洲科學(xué)家分別在野生鳥類和寵物狗中分離得到NDM陽性沙門氏菌和NDM陽性大腸桿菌[13-14]。這些都表明伴侶動物和食品動物已成為攜帶blaNDM 的細(xì)菌儲庫，對公共衛(wèi)生安全造成潛在威脅。

對于NDM陽性細(xì)菌來說，優(yōu)勢克隆菌株的擴(kuò)散傳播或質(zhì)粒在動物、動物性食品和人之間進(jìn)行快速傳播是導(dǎo)致NDM基因流行的主要分子機制。中國作為食品動物大國，加強對食品源動物中碳青霉烯酶耐藥基因NDM流行狀況的監(jiān)測顯的尤為重要，對國家控制細(xì)菌耐藥性具有重要的意義。本研究從江蘇部分地區(qū)奶牛場中采集樣品，分離碳青霉烯酶耐藥大腸桿菌，對blaNDM耐藥基因在食品動物源大腸桿菌中的流行狀況和傳播特征進(jìn)行了調(diào)查研究。

1材料與方法

1.1樣品和菌株來源

2018年6月從江蘇淮安2個奶牛養(yǎng)殖場采集樣品104份，包括糞便樣品和環(huán)境樣品，2018年5月在徐州某奶牛養(yǎng)殖場采集糞便樣品和環(huán)境樣品共30份，其中環(huán)境樣品包括皮膚擦拭子和環(huán)境水樣品。3個奶牛養(yǎng)殖場均使用過β-內(nèi)酰胺酶制劑來處理牛乳腺炎，例如阿莫西林和頭孢噻呋。大腸埃希菌ATCC25922和J53均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所何濤博士提供。

1.2主要試劑及培養(yǎng)基

頭孢噻呋、頭孢他啶、亞胺培南、美羅培南和氨曲南均購自北京索萊寶科技有限公司，EC肉湯、麥康凱培養(yǎng)基、MH瓊脂以及 MH肉湯購自青島海博生物技術(shù)有限公司，PCRmix購自廣州東盛生物技術(shù)有限公司，限制性核酸內(nèi)切酶XbaⅠ購自大連寶生物工程（TaKaRa）有限公司，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3blaNDM陽性大腸桿菌的分離與鑒定

將糞便樣品和環(huán)境擦拭子用PBS處理后，以1%的比例加入到100 ml含新生霉素的EC肉湯中37～40 ℃增菌8～12 h，然后在含有1 μg/ml美羅培南的麥康凱瓊脂板上劃線，37 ℃培養(yǎng)16～24 h，挑取平板上的紅色單菌落用16S rRNA引物和微生物鑒定儀（Aris2×）來鑒定菌屬，煮沸法制取模板。鑒定成功的大腸桿菌用PCR方法擴(kuò)增blaNDM基因，NDM特異性引物按照參考文獻(xiàn)[15]合成，對擴(kuò)增的陽性NDM進(jìn)行測序，測序結(jié)果使用DNAMAN軟件進(jìn)行比對確定NDM變體。

1.4耐藥基因的檢測

對攜帶有blaNDM基因的大腸桿菌進(jìn)行其他ESBL類基因的檢測，引物按參考文獻(xiàn)[16]合成，分別檢測了blaSHV、blaTEM、blaCTX-M-1、blaCTX-M-2、blaCTX-M-9、blaCTX-M-25、blaPER-1、blaPER-2、blaVEB、blaGES、blaKPC、blaOXA-2-group、blaOXA-10-group。

1.5毒力基因的檢測

對攜帶有blaNDM基因的大腸桿菌進(jìn)行相關(guān)毒力基因的檢測，三重PCR檢測stx1、stx2、hly基因，二重PCR檢測stx2v、eae基因，引物由本實驗室保存。

1.6藥敏試驗

按照美國臨床試驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會CLSI（2013）推薦的瓊脂稀釋法測定大腸桿菌對臨床感染常用的抗感染藥物β-內(nèi)酰胺酶類藥物（頭孢他啶、頭抱噻呋、美羅培南、亞胺培南和氨曲南）以及四環(huán)素、氨基酸糖苷類藥物（慶大霉素）、氟喹諾酮類（環(huán)丙沙星）等幾類藥物的敏感性。大腸埃希菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株，同時設(shè)MH肉湯為陰性對照。每株菌株做2個重復(fù)。操作步驟及結(jié)果判定按照標(biāo)準(zhǔn)藥敏實驗標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.7多位點序列分型（MLST）

本研究對15株blaNDM陽性大腸桿菌進(jìn)行MLST分型，7對管家基因引物[17]詳見表1，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，再送南京思普金公司進(jìn)行測序。把一代測序的結(jié)果參照E.coli MLST的數(shù)據(jù)庫（https：//pubmlst.org/bigsdb？db=pubmlst_escherichia_seqdef）進(jìn)行分型。

1.8脈沖場凝膠電泳試驗（PFGE）

參照美國CDC（Centers for disease control and prevention ）Pusle Net大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)PFGE操作規(guī)程，對攜帶有blaNDM基因的大腸桿菌進(jìn)行PFGE分型。

1.9質(zhì)粒結(jié)合試驗

使用膜接合轉(zhuǎn)移的方法對blaNDM基因的傳播方式進(jìn)行驗證，分別以攜帶blaNDM基因大腸桿菌和J53作供體菌和受體菌，用含 1 mg/L的美羅培南和100 mg/L的疊氮化鈉的麥康凱平板篩選攜帶blaNDM基因陽性接合子，通過PCR方法驗證結(jié)合子blaNDM基因是否被成功結(jié)合轉(zhuǎn)移。

2結(jié)果

2.1NDM陽性大腸桿菌的分離與鑒定

2018年5月至6月在江蘇省淮安市和徐州市奶牛場134份樣品中共分離出15株blaNDM陽性大腸桿菌，經(jīng)測序，并在DNAMAN上與24種NDM變體比對，發(fā)現(xiàn)包括NDM-1和NDM-5 2種變體（13株NDM-1，2株NDM-5），其中有5份來自環(huán)境樣品，10份來自糞便樣品。blaNDM樣品陽性率達(dá)7.23%（9/134），blaNDM陽性大腸桿菌的陽性率為 25.00%（15/60）。

2.2耐藥基因檢測結(jié)果統(tǒng)計

對15株blaNDM陽性大腸桿菌進(jìn)行13種ESBL類基因的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有blaNDM陽性大腸桿菌攜帶一種或多種ESBL類基因，有1株從糞便樣品中分出的菌株同時攜帶NDM基因和多黏菌素耐藥基因mcr-1，由表2可知，環(huán)境樣品比糞便樣品含有ESBL類基因種類多。

2.3藥敏試驗

由圖1可看出，15株blaNDM陽性大腸桿菌對頭孢類（頭孢噻呋、頭孢他啶、頭孢唑啉）、四環(huán)素、氨芐西林都呈現(xiàn)100%的耐藥率，對氨曲南的耐藥率為0;15株菌對β-內(nèi)酰胺酶類藥物美羅培南和亞胺培南的耐藥率分別為33.3%（5/15）和60%（9/15），對亞胺培南的耐藥率高于美羅培南;對氨基酸糖苷類藥物慶大霉素、妥布霉素和阿米卡星的耐藥率分別為53.3%（8/15）、33.3%（5/15）和6.7%（1/15）;對四環(huán)素類抗生素米諾環(huán)素的耐藥率達(dá)66.7%（10/15）;對喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星和左氟沙星的耐藥率分別為60%（9/15）和33.3%（5/15）。

2.4多位點序列分型結(jié)果

通過多位點序列分型將15株blaNDM陽性大腸桿菌共分成7種ST型，包括ST206（2株）、ST846（4株）、ST410（1株）、ST1626（1株）、ST101（1株）、ST3076（1株）、ST1642（1株），以ST206和ST846較為流行（表3）。

2.5PFGE分型結(jié)果

如圖2所示，將15株blaNDM陽性大腸桿菌使用XbaⅠ酶進(jìn)行PFGE分型，根據(jù)PFGE聚類結(jié)果，15株大腸桿菌可以分為11個簇，菌株1-28-139和菌株1-28-144具有相同的PFGE型別。菌株M3-1、M3-21和菌株M3-27具有相同的PFGE型別。菌株M1-41和菌株1-5-106具有相同的PFGE型別。其他8個型別分別只包含1株菌株。同一樣品的分離株傾向于相同的PFGE型別，在小范圍內(nèi)存在相同的PFGE圖譜。

2.6質(zhì)粒結(jié)合試驗

通過PCR方法對結(jié)合子進(jìn)行blaNDM基因的驗證，15株大腸桿菌的blaNDM耐藥基因全部結(jié)合轉(zhuǎn)移至大腸桿菌J53中。這表明NDM耐藥基因可能會在不同的ST型大腸桿菌中以質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的方式進(jìn)行傳播擴(kuò)散。

3討論

本研究對江蘇省部分地區(qū)奶牛場的blaNDM耐藥基因的流行狀況及其傳播規(guī)律進(jìn)行了研究。本研究從3個不同的奶牛場共采集樣品134份，其中blaNDM樣品陽性率達(dá)7.23%（9/134），blaNDM陽性大腸桿菌的陽性率25.00%（15/60），主要流行NDM-1和NDM-5 2種變體，在糞便樣品和環(huán)境樣品中均檢測到這2種變體的存在，表明blaNDM基因可能在動物體與環(huán)境間相互傳播，并存在從動物向人群擴(kuò)散的風(fēng)險。blaNDM-5陽性大腸桿菌相比blaNDM-1陽性大腸桿菌對以美羅培南為代表的碳青霉烯酶類抗生素，MIC高出14倍，推測NDM-5變體的酶活性高于NDM-1，可誘導(dǎo)菌株產(chǎn)生更強的耐藥能力;同時發(fā)現(xiàn)在環(huán)境樣品分離的菌株中攜帶有比較多種類的β-內(nèi)酰胺酶基因。

碳青霉烯酶類藥物作為治療腸桿菌科細(xì)菌感染效果最好的抗菌藥物之一，治療效果都好于三、四代頭孢[18]，從本研究結(jié)果看，blaNDM陽性大腸桿菌除對單環(huán)β-內(nèi)酰胺酶類抗生素氨曲南耐藥率為0外，幾乎對所有的碳青霉烯酶類抗生素都表現(xiàn)為不同水平的耐藥性，對頭孢類藥物已達(dá)到比較高的耐藥水平，對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別達(dá)60.0%和33.3%，這與報道一致[19]。不僅如此，15株blaNDM陽性大腸桿菌對氨基酸糖苷類藥物、四環(huán)素類抗生素、喹諾酮類藥物都有不同水平的耐藥性;作為在獸醫(yī)臨床上使用率較高的藥物，本研究中15種blaNDM陽性大腸桿菌對慶大霉素和環(huán)丙沙星的耐藥率分別為53.3%和60.0%，這可能跟牛場的飼養(yǎng)管理有關(guān)，3個奶牛養(yǎng)殖場的養(yǎng)殖方式均是農(nóng)戶散養(yǎng)，飼養(yǎng)管理水平比較落后，使得奶牛源大腸桿菌存在多重耐藥性，這也更有利于blaNDM基因從動物擴(kuò)散到環(huán)境。

15株blaNDM陽性大腸桿菌共分成7種ST型，包括ST410、ST206、ST846、ST1626、ST101、ST3076、ST1642，奶牛場以ST206和ST846較為流行。除ST410外，其余都鮮少在奶牛中報道，只在人醫(yī)臨床中有報道。不同ST型對各種藥物的最小抑菌濃度無明顯差異，但當(dāng)攜帶相同blaNDM基因時，大腸桿菌ST206對美羅培南MIC值比大腸桿菌ST846高出4倍。15株blaNDM陽性大腸桿菌使用XbaⅠ酶進(jìn)行PFGE分型，根據(jù)PFGE聚類結(jié)果，15株大腸桿菌可以分為11個簇，小范圍內(nèi)存在相同的PFGE圖譜[20-21]。從質(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)移試驗結(jié)果中看出，15株大腸桿菌的blaNDM耐藥基因可全部結(jié)合轉(zhuǎn)移至大腸桿菌J53中，推測NDM耐藥基因可在不同的ST型中以質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的方式進(jìn)行傳播，為確定NDM耐藥基因位于哪種質(zhì)粒以哪種方式進(jìn)行的傳播，后續(xù)需要做S1-PFGE和Southernblot進(jìn)行驗證。

近年來，隨著抗菌藥物在人醫(yī)臨床及動物養(yǎng)殖中的廣泛使用，多重耐藥現(xiàn)象普遍存在。2017年世界經(jīng)濟(jì)全球風(fēng)險報告指出，病菌對抗生素的耐藥性己經(jīng)成為人類健康的最大威脅之一，同時也給環(huán)境微生態(tài)平衡以及養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展帶來了巨大損害[22]。本研究通過在江蘇部分地區(qū)奶牛場采集134份樣品，分離到15株碳青霉烯酶耐藥大腸桿菌，對blaNDM耐藥基因在奶牛場的流行狀況和傳播特征進(jìn)行了調(diào)查研究，為食品動物源blaNDM陽性大腸桿菌的流行病學(xué)調(diào)查研究提供依據(jù)，加強了獸醫(yī)臨床動物中blaNDM基因的流行監(jiān)測，對控制耐藥性的擴(kuò)散具有重要意義。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）