惠小涵 程婷婷 柯衛(wèi)東 郭宏波

摘要：為了解蓮藕多酚氧化酶（PPO）基因密碼子使用偏好性、不同物種中PPO基因同源關(guān)系及異源表達(dá)受體，本研究運(yùn)用 CondonW 和 EMBOSS 程序?qū)ι徟篜PO基因密碼子進(jìn)行分析。結(jié)果表明，蓮藕PPO基因偏好性較弱但偏好于G/C結(jié)尾的密碼子，其中高頻密碼子有 24 個（同義密碼子相對使用度>1），偏好性最強(qiáng)的有 3 個（同義密碼子相對使用度>2）。用SPSS和MEGA軟件對34種單子葉和雙子葉植物的 PPO 密碼子進(jìn)行偏性比較和聚類分析，發(fā)現(xiàn)不同物種PPO基因存在不同密碼子偏好模式，多數(shù)單子葉植物PPO 基因密碼子偏好性比雙子葉植物強(qiáng)。PPO 密碼子相關(guān)性分析結(jié)果表明，蓮藕 PPO 密碼子使用偏好主要受突變壓力的影響。在異源轉(zhuǎn)化受體選擇中，大腸桿菌真核表達(dá)系統(tǒng)適合蓮藕PPO的異源表達(dá)，擬南芥則是蓮藕PPO轉(zhuǎn)基因的理想受體。蓮藕PPO密碼子偏好模式分析為后續(xù)的PPO基因遺傳轉(zhuǎn)化研究提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：蓮藕;PPO;密碼子;偏好性

中圖分類號：S645.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1000-4440（2020）02-0438-09

Abstract：To explore the codon usage preference of polyphenol oxidase（PPO） gene in lotus root， the homology of PPO gene in different species and heterologous expression receptors， the codon of PPO gene was analyzed by CondonW and EMBOSS programs. The results showed that the PPO gene favored codons ending in G or C. There were 24 high-frequency codons （relative synoymous codon usage>1）， and three codons （relative synoymous codon usage>2） had the strongest preference. The PPO codon bias of 34 monocotyledonous and dicotyledonous plants was analyzed by SPSS and MEGA software. It was found that ?PPO genes from different species had different codon preference patterns， and most monocotyledonous PPO genes had stronger codon preference than dicotyledons. Correlation analysis of PPO codon indicated that the PPO codon usage preference in lotus root was mainly affected by mutation. In the selection of heterologous transforming receptors， eukaryotic expression system of Escherichia coli is suitable for heterologous expression of PPO in lotus root， and Arabidopsis thaliana is an ideal receptor for PPO transgene. The PPO codon preference pattern analysis of lotus root provides a theoretical basis for the subsequent study of PPO gene transformation.

Key words：lotus root;polyphenol oxidase （PPO）;codon;preference

密碼子是在信使RNA上相鄰的3個核苷酸殘基組成的基本單位，在合成蛋白質(zhì)過程中，信使RNA上每個三聯(lián)體核苷酸會編碼對應(yīng)某一個氨基酸，而一種氨基酸會有一種或多種密碼子，稱為密碼子簡并性[1]，這是氨基酸合成的規(guī)律。其中對應(yīng)同一種氨基酸的密碼子稱為同義密碼子[2]。在生物長期進(jìn)化過程中，不同物種的密碼子使用頻率存在著較大差異，各種生物偏好使用同義密碼子，稱為密碼子偏好性[3]。在轉(zhuǎn)基因研究中，在外源基因[4]的表達(dá)和翻譯水平等方面會受到不同物種密碼子偏好性差異的影響。研究密碼子偏好性，便于選擇合適的宿主表達(dá)系統(tǒng)[5]，以達(dá)到提高基因表達(dá)水平的目的[6]。蓮藕（Nelumbo nucifera Gaertn）是蓮的地下莖，屬木蘭亞綱，盛產(chǎn)于湖北等地，有較高的營養(yǎng)價值。蓮藕味甘多液可清熱涼血，含有黏液蛋白和膳食纖維，可通便止瀉、健脾開胃。同時含有鐵、鈣等多種微量元素，可補(bǔ)氣益血、增強(qiáng)人體免疫力，并富含大量單寧酸，可以止血散瘀[7]。然而蓮藕不耐儲存，極易發(fā)生褐變現(xiàn)象，這與多酚氧化酶（PPO）的含量和活性密切相關(guān)。多酚氧化酶在自然界中分布極其廣泛，在植物[8]、動物[9]和真菌[10]中均可檢測到且發(fā)揮重要作用，如增強(qiáng)抗性等。多酚氧化酶主要特點(diǎn)是存在分子氧時能催化酚類物質(zhì)生成有色醌進(jìn)而形成黑色素。密碼子偏好性在芍藥[11]、小麥[12]、杉木[13]、橄欖[14]等植物中均有研究，目前蓮藕PPO基因密碼子使用偏好性還未見相關(guān)研究。通過對蓮藕PPO基因密碼子使用偏好性的分析，討論其形成的主要因素，再與擬南芥、煙草、酵母和大腸桿菌基因組密碼子進(jìn)行比較分析，為蓮藕 PPO 后續(xù)的基因研究中選擇最佳受體提供依據(jù)，也為深入研究蓮藕PPO的轉(zhuǎn)基因受體、功能驗(yàn)證、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源

蓮藕PPO基因序列全長2 069 bp（GenBank登錄號為FJ999635.1），其開放閱讀框?yàn)?1 794 bp，編碼 597 個氨基酸。鳳梨、油棕、小麥、玉米、木薯、川桑、可可等 34 種植物的PPO基因序列來源于 GenBank（ http： //www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/），登錄號見表1。大腸桿菌（Escherichia coli）、酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）和煙草（Nicotiana tabacum）等生物基因的密碼子偏好性數(shù)據(jù)來源于密碼子使用數(shù)據(jù)庫 Codon Usage Database（http：//www.kazusa.or.jp/codon/）。

1.2數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用 CondonW 軟件和 CHIPS 在線程序?qū)PO基因的編碼序列（CDS）的有效密碼子數(shù)（ENc）、同義密碼子相對使用度（RSCU）、密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI）、第3位堿基G+C含量（GC3s）和總G+C含量（GC）等密碼子偏好性參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計。將 34 種植物的PPO 基因的密碼子使用偏性用 SPSS 軟件進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，進(jìn)一步對 PPO 密碼子進(jìn)行中性繪圖分析、ENc-plot 分析以及 PR2-plot分析。利用 MEGA 軟件并結(jié)合組間鄰接法（Neigh-bour joining）構(gòu)建PPO基因 CDS系統(tǒng)發(fā)育樹。

2結(jié)果與分析

2.1蓮藕PPO密碼子的偏好性分析

2.1.1蓮藕PPO的ENc、GC、GC3s和CAI分析由CondonW 程序分析蓮藕 PPO基因密碼子的GC和有效密碼子數(shù)[15]。結(jié)果顯示蓮藕PPO基因中密碼子的GC和GC3s分別為51.8%和66.3%，說明蓮藕PPO基因中的密碼子比較偏好以G/C結(jié)尾。ENc值為 52.12，大于35[16]，接近61，說明蓮藕PPO密碼子偏好性較弱，基因表達(dá)水平偏低。蓮藕 PPO的CAI為0.204，遠(yuǎn)小于1，進(jìn)一步證明蓮藕PPO對密碼子的偏好性弱。

2.1.2蓮藕PPO同義密碼子相對使用度利用 CondonW、EMBOSS 在線程序分析各基因的 RSCU 值[17]。同義密碼子的相對使用度（RSCU）是指在不影響基因編碼的氨基酸組成情況下，密碼子的實(shí)際頻率與期望密碼子頻率的比值，它能夠直接反應(yīng)密碼子的使用偏好性[18]。若RSCU大于1則表示密碼子的偏好性較強(qiáng)，RSCU小于1則表示密碼子偏好性較弱，RSCU值接近于1則表示密碼子沒有偏好性[19]。計算結(jié)果（表2）表明，在蓮PPO基因密碼子中，RSCU<1的有35個密碼子，RSCU=1的有3個密碼子，RSCU>1的有24個密碼子，其中CAG、UCG、AGG 3個密碼子的RSCU值均大于2，說明蓮藕PPO密碼子中共有24個具有偏好性，其中有3個偏好性極強(qiáng)。

2.2不同物種間PPO密碼子偏好性分析

2.2.1不同物種間ENc、RSCU及GC分析不同物種間PPO基因密碼子偏好性參數(shù)如表3所示，發(fā)現(xiàn)單子葉、雙子葉植物PPO基因的CAI值相近。且范圍為0.165～0.318，遠(yuǎn)小于1，表明這34個物種PPO密碼子使用偏好性都較弱。單子葉植物鳳梨、二穗短柄草、小麥等PPO基因的 ENc值為31.00～38.00，平均值為 36.85，雙子葉植物蓮、蘋果、木薯等PPO 基因的ENc值為49.00～56.00，平均值為 53.08，表明這些物種的PPO密碼子偏好性及基因表達(dá)水平有差異，單子葉植物的PPO基因表達(dá)高于雙子葉植物，與基于CAI的分析結(jié)果相同。34 個物種的GC3s為0.174～0.947，均值為0.682，GC為0.342～0.704，均值為0.569。表明不同物種PPO更偏向于G/C結(jié)尾的密碼子。其中有10種單子葉植物的GC3s含量均大于 0.8，偏向于G/C結(jié)尾的密碼子，谷子（Setaria italica）對G/C結(jié)尾的密碼子的偏性最強(qiáng)。雙子葉植物中的GC含量均分布在0.5左右，其中薊罌粟（Argemone mexican）的 GC3s 為 0.342，偏向于A/U結(jié)尾的密碼子。34個物種PPO密碼子偏好性的RSCU值[20]分析結(jié)果表明，RCSU值>1.0的密碼子數(shù)最多有31個（大葉藻、橡膠樹和木薯）;最少的有24個（蓮藕）。RSCU值>1.5的密碼子數(shù)最多有25個（大麥）;最少有6個（可可、金茶花和葡萄）。

2.2.2PPO堿基組成分析用SPSS 軟件對PPO密碼子成分進(jìn)行相關(guān)性分析[21]，對GC、GC3s、ENc、CAI、密碼子偏愛指數(shù)（CBI）、最優(yōu)密碼子使用頻率（Fop）、第3位堿基U含量（U3s）、第3位堿基A含量（A3s）之間的兩兩相關(guān)性進(jìn)行分析[22]。表4中ENc 與U3s、A3s這兩個參數(shù)呈正相關(guān)，ENc和GC、GC3s、CAI、CBI、Fop這5個參數(shù)呈負(fù)相關(guān)，說明PPO密碼子偏好性越強(qiáng)，其堿基中GC越高。如圖 1A 所示，PPO分布在中性分析圖回歸線的兩側(cè)，第1、2位堿基G+C含量（GC12）和GC3s的線性回歸系數(shù)（斜率）為0.096 8，且在相關(guān)性分析中存在極顯著相關(guān)（P<0.01）。由此推斷，密碼子的偏好性主要受突變影響。如圖1B所示，在ENc-plot分析中，PPO基因密碼子分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線附近，再次驗(yàn)證其密碼子偏好性僅受突變影響。此外，圖1C顯示，在PR2-plot分析中，基因較多集中在圖的中間位置，即密碼子C+G和A+U頻率基本相同，同時有較少的基因出現(xiàn)在平面圖的其他位置，表明多數(shù)物種PPO密碼子偏好模式主要受突變壓力作用。

2.2.3密碼子選用偏好性和CDS序列的系統(tǒng)聚類34個物種PPO基因的密碼子通過鄰接法[23]進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析[24]，如圖2所示。在系統(tǒng)發(fā)育樹中，34個物種大致按照原本的單子葉和雙子葉植物進(jìn)行分類，說明單子葉植物和雙子葉植物的PPO密碼子偏好模式不同。單子葉植物玉米、高粱、大麥、節(jié)節(jié)麥歸為一小類，且同屬禾本科，表明親緣關(guān)系相近的物種表現(xiàn)出相近的PPO密碼子使用偏好性。但是同屬薔薇科的蘋果和白梨、沙梨沒有優(yōu)先聚類，且遺傳距離大于不同屬蘋果和川桑，同屬禾本科的小麥和日本水稻也遺傳距離較遠(yuǎn)，表明不同物種PPO密碼子偏好性的差異與物種進(jìn)化沒有必然聯(lián)系。整體來看，蓮藕PPO與其他植物PPO有較高同源性。其中蓮藕PPO與葡萄PPO的親緣關(guān)系最近，與獼猴桃PPO的親緣關(guān)系相對于其他植物較近。

2.3蓮藕PPO基因受體系統(tǒng)的選擇

探究相關(guān)基因的功能特征常用的研究植物為擬南芥[25]和煙草[26]，基因原核表達(dá)和真核表達(dá)系統(tǒng)常用大腸桿菌[27-30]和酵母菌[31]為受體。目前，蓮藕的遺傳轉(zhuǎn)換沒有成熟體系，PPO相關(guān)基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并不明確，蓮藕PPO基因的研究通常需要異源表達(dá)[32]，借助如大腸桿菌、酵母菌等遺傳轉(zhuǎn)換體系成熟的受體。不同物種存在密碼子使用模式差異，在異源表達(dá)過程中，應(yīng)采用密碼子使用模式較為相似的受體，提高轉(zhuǎn)錄、翻譯效率，進(jìn)而提高表達(dá)量。將蓮藕PPO密碼子分別與大腸桿菌、酵母菌、擬南芥、煙草基因組密碼子使用頻率進(jìn)行對比分析。結(jié)果表明蓮藕PPO基因與大腸桿菌有20組密碼子有較大的差別，而與酵母有27組密碼子存在較大差別（表5），說明大腸桿菌真核異源表達(dá)系統(tǒng)更適用于蓮藕PPO異源表達(dá)。蓮藕PPO基因與擬南芥基因密碼子存在較大差別的有19組，與煙草基因密碼子存在較大差別的有21組，說明在蓮藕PPO基因遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中，擬南芥更適合作為異源受體。

3討論

用生物信息學(xué)方法對蓮藕PPO密碼子偏好模式進(jìn)行了系統(tǒng)分析研究，ENc為52.12以及CAI為0.204均表明蓮藕PPO基因密碼子偏好性較弱，基因表達(dá)水平偏低。GC3s為66.3%，表明PPO基因密碼子較偏好以G/C結(jié)尾的密碼子。這一結(jié)果不符合大部分雙子葉植物密碼子偏好使用A/U結(jié)尾的特征[33]，這可能是在進(jìn)化過程中受突變的影響，密碼子偏好由A、U變?yōu)镚、C，密碼子偏好性產(chǎn)生變化的具體機(jī)制和原因還有待深入研究。

中性繪圖分析、ENc-plot 分析和PR2-plot 分析結(jié)果表明，多數(shù)物種PPO密碼子偏好模式主要受突變壓力影響，其中少數(shù)物種PPO受突變作用壓力和其他因素的綜合作用。34個物種PPO 基因的偏好性分析結(jié)果顯示，不同物種PPO基因的ENc值和 CAI 值均不相同，PPO 基因在各物種內(nèi)密碼子使用偏好性較弱，單子葉植物PPO基因表達(dá)高于雙子葉植物，但基因表達(dá)量普遍不高。經(jīng)過長期的自然進(jìn)化，在突變壓力、自然選擇和基因功能等各方面綜合影響下[34]，密碼子的偏好模式會出現(xiàn)差異，整體來說，親緣關(guān)系相近的物種的基因密碼子偏好模式比較相似。分析不同物種基因的密碼子偏好模式和聚類對物種間系統(tǒng)分類和親緣關(guān)系研究有重要的參考意義。

表達(dá)翻譯水平與密碼子偏好性相關(guān)，本研究結(jié)果對蓮藕PPO基因進(jìn)行簡并引物設(shè)計、點(diǎn)突變引入等試驗(yàn)提供了參考價值。目前，蓮藕的遺傳轉(zhuǎn)換沒有成熟體系，PPO相關(guān)基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并不明確，蓮藕PPO 基因的研究通常需要異源表達(dá)，借助如大腸桿菌、酵母菌等遺傳轉(zhuǎn)換體系成熟的受體。本研究通過比較蓮藕與擬南芥、擬南芥、大腸桿菌、酵母菌的PPO基因密碼子使用模式的差異，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌真核異源表達(dá)系統(tǒng)更適用于蓮藕PPO異源表達(dá)試驗(yàn)，在蓮藕PPO基因遺傳轉(zhuǎn)化功能驗(yàn)證中，擬南芥更適用于異源受體。

通過對蓮藕多酚氧化酶密碼子的分析發(fā)現(xiàn)，該基因密碼子偏好性較弱，但較偏好以 G/C 結(jié)尾的密碼子。這種使用偏好模式主要受突變壓力作用，其次受多種因素共同影響。通過比較密碼子使用頻率發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌和擬南芥可作為蓮藕目標(biāo)基因異源轉(zhuǎn)化的受體。本試驗(yàn)結(jié)果初步揭示了蓮藕PPO密碼子使用規(guī)律，對以后進(jìn)一步開展轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證模式作物的篩選有重要的指導(dǎo)作用，同時也可為研究蓮藕分子進(jìn)化提供一定的科學(xué)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）