李 潔，車玉琴

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽 110032）

缺血性中風(fēng)（IS）是世界范圍內(nèi)最常見的腦血管疾病之一，也是嚴(yán)重殘疾和死亡的主要原因。吸煙、肥胖、高同型半胱氨酸血癥、高血壓、糖尿病、高脂血癥、感染甚至炎癥等多種危險因素都與IS的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。盡管在控制腦血管疾病方面取得了長足的進展，但其發(fā)病率和患病率仍在繼續(xù)增加。因此，需要更多的途徑探索IS發(fā)病機制以提供更好的診斷和治療。microRNA作為小的非編碼RNA分子，在腦血管疾病中發(fā)揮了重要作用[1]。以往研究表明了在IS中具有功能的miRNA，包括miR-30a、miR-126、miR-181b和miR-31。此外，研究表明PKD可能為miR-31的靶向基因[2]。PKD1作為PKD家族成員和絲氨酸/蘇氨酸激酶參與了神經(jīng)元應(yīng)激反應(yīng)[3]。同時，研究顯示JAK/STAT磷酸化的抑制在IFN-γ處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞中起到抗炎作用[4]。據(jù)報道，JAK/STAT通路與局灶性腦缺血的星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)有關(guān)，這表明JAK/STAT通路可作為IS的潛在治療選擇[5]。根據(jù)上述文獻，我們可以推斷，在IS治療中，可以應(yīng)用miR-31調(diào)控JAK/STAT3通路，但其機制尚未被探討。因此，我們旨在通過構(gòu)建氧-糖剝奪（oxygen-glucose deprivation,OGD）缺血模型，干預(yù)其星狀膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)miR-31調(diào)控PKD1基因表達，抑制JAK-STAT3信號通路活化介導(dǎo)OGD模型乳小鼠的星狀膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)神經(jīng)元炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激損傷，為腦卒中治療奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原代星狀膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的提取及細(xì)胞分選 取24 h內(nèi)新生乳小鼠（武漢云克隆科技股份有限公司），75%醫(yī)用酒精消毒，剪下乳鼠大腦，剔除軟腦膜及血管后取大腦皮質(zhì)，剪成小塊后加入5 mL 0.25%胰蛋白酶，37 ℃消化15 min。終止消化，收集細(xì)胞懸液，以300目尼龍網(wǎng)過濾，除去細(xì)胞團塊，離心除去細(xì)胞碎片；加入一抗GFAP（1:100，ab4674，Abcam）、神經(jīng)元標(biāo)志蛋白MAP-2（ab32454，1:100，Abcam，上海），混勻，4 ℃反應(yīng)30 min，4 ℃含5%胎牛血清的PBS洗滌2 次，加入FITC標(biāo)記的二抗（1:500），混勻，4 ℃反應(yīng)30 min。用流式細(xì)胞儀分選出乳小鼠大腦皮層中星狀膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP陽性）和神經(jīng)元（MAP-2陽性）。

1.2 OGD缺血模型構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 收集流式細(xì)胞儀分選的星狀膠質(zhì)細(xì)胞，以5×105個/cm2接種于涂有多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中，無血清DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)，用于后續(xù)實驗。收集流式細(xì)胞儀分選的神經(jīng)元，接種于Transwell外孔中，5% CO2、95% O2混合氣體的37 ℃飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)，Neurobasal培養(yǎng)基（含有2% B27和2 mmol/L L-谷氨酰胺）培養(yǎng)，每3 d換半液。星形膠質(zhì)細(xì)胞分為blank組（空白）、NC組（轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒）、miR-31 mimic組（轉(zhuǎn)染miR-31 mimic）、miR-31 inhibitor組（轉(zhuǎn)染miR-31 inhibitor）、si-PKD1組（轉(zhuǎn)染siRNA-PKD1）和si-PKD1＋CdCl2組（轉(zhuǎn)染siRNA-PKD1＋JAK-STAT3抑制劑10 μmol/L CdCl2處理4 h）。

OGD建模星狀膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元共培養(yǎng)：Transwell為雙層培養(yǎng)皿，其間為0.4 μm的聚碳酸酯膜，細(xì)胞不能自由通過聚碳酸酯膜，但細(xì)胞因子及其他信號分子可自由通過此膜。將星狀膠質(zhì)細(xì)胞傳代接種于Transwell內(nèi)孔中，置于已接種神經(jīng)元的Transwell外孔上，將培養(yǎng)基更換為無糖培養(yǎng)基，放入通有混合氣體（5% CO2，2% O2和93% N2）、37℃的低氧培養(yǎng)箱60 min后取出，轉(zhuǎn)入37 ℃、5% CO2飽和常氧培養(yǎng)箱，完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，模擬體內(nèi)缺血再灌注損傷。OGD建模后將轉(zhuǎn)染的星狀膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元共培養(yǎng)并分組為：normal組（神經(jīng)元＋星狀膠質(zhì)細(xì)胞），blank OGD組（神經(jīng)元＋星狀膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)后OGD建模）、NC OGD組（神經(jīng)元＋轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒星狀膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)后OGD建模）、miR-31 mimic OGD組（神經(jīng)元＋轉(zhuǎn)染miR-31 mimic星狀膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)后OGD建模）、miR-31 inhibitor OGD組（神經(jīng)元＋轉(zhuǎn)染miR-31 inhibitor星狀膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)后OGD建模）、si-PKD1 OGD組（神經(jīng)元＋轉(zhuǎn)染si-PKD1星狀膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)后OGD建模）和si-PKD1＋CdCl2OGD組（神經(jīng)元＋轉(zhuǎn)染siRNA-PKD1并用JAK-STAT3抑制劑10 μmol/L CdCl2處理4 h的星狀膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)后OGD建模）。

1.3 MTT法檢測OGD共培養(yǎng)體系中神經(jīng)元存活率 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長密度達到80%左右時，PBS液洗2遍，0.25%胰酶消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。計數(shù)后，以每孔3×103～6×103個細(xì)胞接種于96孔板中，每孔體積0.2 mL，重復(fù)6 孔，培養(yǎng)箱孵育，分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時取出培養(yǎng)板，換含10% MTT溶液（5 g/L）（GD-Y1317，古朵生物科技公司，上海）的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸掉上清液，每孔加100 μL二甲基亞砜（DMSO）（D5879-100ML，Sigma，USA），輕輕振蕩混勻10 min，使其充分溶解由活細(xì)胞產(chǎn)生的甲瓚晶體，于酶標(biāo)儀 （南京德鐵實驗設(shè)備有限公司）檢測490 nm處各孔吸光度值，計算細(xì)胞存活率，OGD組細(xì)胞存活率（%）＝OGD組吸光度值/對照組吸光度值×100%，以對照組的細(xì)胞存活率為100%作為對比。

1.4 乳酸脫氫酶（LDH）漏出率測定OGD共培養(yǎng)體系中神經(jīng)元細(xì)胞損傷 OGD會造成神經(jīng)元細(xì)胞的損傷，細(xì)胞膜被破壞，通透性增加，細(xì)胞漿內(nèi)的LDH釋放到培養(yǎng)基中。因此，測定培養(yǎng)液中LDH的活性，被用于測定細(xì)胞的損傷。采用CytoTox96非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒（Promega，Madison，WI，USA）進行LDH的測定。經(jīng)1 h OGD處理，加入15 μL裂解液（9% Triton?X-100溶于水）在37 ℃培養(yǎng)箱孵育45 min；從中取出50 μL細(xì)胞上清液至另一個提前加入配制好的底物混合物（50 μL）96孔板中，室溫下反應(yīng)30 min，注意避光；每孔加50 μL終止液來終止酶反應(yīng)，最后使用酶標(biāo)儀在490 nm測量吸光值。

1.5 ELISA檢測OGD共培養(yǎng)體系中炎癥因子 細(xì)胞實驗中吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用無菌管收集，2 500 r/min離心20 min，仔細(xì)收集上清。按照ELISA試劑盒說明書操作步驟測定細(xì)胞培養(yǎng)基中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量。每組實驗重復(fù)3 次。炎癥因子表達水平以pg/mL蛋白質(zhì)表達。

1.6 熒光探針法檢測OGD共培養(yǎng)體系中ROS含量接種于96孔板中的神經(jīng)元經(jīng)實驗處理后，用含10 μmol/L DCFH-DA熒光探針的培養(yǎng)液于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3 次以去除探針。用自動酶標(biāo)檢測儀檢測細(xì)胞內(nèi)二氯熒光黃（DCF）的熒光強度而測得細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm。

1.7 TUNEL法檢測OGD共培養(yǎng)體系中神經(jīng)元凋亡將OGD共培養(yǎng)細(xì)胞制備密度為5×107個/mL的細(xì)胞懸液，取100 μL涂片，放入二甲苯中進行常規(guī)脫蠟，隨后放入梯度乙醇中水化；滴加0.3% H2O2-甲醇溶液于切片上封閉內(nèi)源性過氧化物酶（室溫，30 min）。TBS洗涂2 次，每次5 min；用濾紙吸干組織周圍水分，滴加蛋白酶K工作液，37 ℃孵育30 min?；謴?fù)至室溫后，TBS洗涂2 次，每次5 min；置于0.1% TritonX-100，0.1%枸櫞酸鈉溶液中，室溫下浸泡5 min。雙蒸水洗片2 次，每次5 min；用濾紙吸干標(biāo)本周圍多余水分，滴加TUNEL反應(yīng)混合物，37 ℃孵育90 min?；謴?fù)至室溫后，TBS洗涂2次，每次5 min。用濾紙吸干標(biāo)本周圍多余水分，滴加正常山羊血清，室溫下封閉20 min。棄去血清，加入轉(zhuǎn)化的POD溶液，37 ℃下放置30 min?；謴?fù)至室濕后，TBS洗涂2 次，每次5 min；用濾紙吸干標(biāo)本周圍水分，滴加0.3% H2O2-0.05% DAB顯色液，待陽性細(xì)胞核染色成棕黃色，用雙蒸水沖洗，終止反應(yīng)。神經(jīng)元TUNEL染色在滴加TUNEL溶液后，在暗室中于37 ℃溫育90 min后PBS洗滌5 min×3次，用DAPI染核5 min，用抗熒光淬滅封片液封片后在熒光顯微鏡下觀察。在400倍顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞數(shù)，每張片隨機選擇5 個視野。光鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。光鏡下計算凋亡率，計算方法：取5 個高倍鏡視野，分別計數(shù)總細(xì)胞數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)，凋亡率（%）＝(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.8 免疫熒光法檢測OGD共培養(yǎng)體系中氧化應(yīng)激損傷相關(guān)蛋白4-HNE和8-OHdG表達 細(xì)胞爬片上加入一抗4-HNE（1:500，ab46545，Abcam）或8-OHdG（1:500，ab62623，Abcam）4 ℃孵育過夜，PBS洗5 min×3 次，加FITC標(biāo)記二抗（1:400）室溫孵育2 h（避光），清洗，封片，即可于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察拍照。各組實驗獨立重復(fù)3 次。

1.9 硫代巴比妥酸（TBA）法檢測OGD共培養(yǎng)體系中MDA含量 收集OGD 1 h，再恢復(fù)24 h后共培養(yǎng)細(xì)胞懸液100 μL，利用過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA可與TBA縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰的原理，嚴(yán)格按照試劑盒說明書測定共培養(yǎng)體系中MDA含量，MDA含量單位為nmol/mgprot。

1.10 黃嘌呤氧化酶法檢測OGD共培養(yǎng)體系中SOD含量 收集OGD 1 h，再恢復(fù)24 h后，共培養(yǎng)細(xì)胞懸液100 μL，利用機體通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺生成亞硝酸鹽，在顯色劑作用下呈現(xiàn)紫紅色，可通過分光光度計測定其光密度值，當(dāng)被測樣品中含SOD時，則對超氧陰離子自由基有專一抑制作用，形成的亞硝酸鹽減少的原理，取共培養(yǎng)細(xì)胞懸液，嚴(yán)格按照試劑盒說明書測定共培養(yǎng)體系內(nèi)SOD活力。細(xì)胞中SOD活力的定義為每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中抑止率達50%時所對應(yīng)的SOD量為一個活力單位（U/mL）。

1.11 雙熒光素酶報告基因 使用生物學(xué)預(yù)測網(wǎng)站microRNA.org進行miR-31的靶基因分析，預(yù)測miR-31可能的靶基因，并獲取含有作用位點的片段序列?？寺U增PKD1基因的3'UTR區(qū)的全長至pmiRGLO（E1330，Promega，USA）Luciferase載體上，命名為pPKD1-Wt。利用生物信息軟件預(yù)測miR-31與靶基因PKD1的結(jié)合位點，定點突變。構(gòu)建pPKD1-Mut載體，內(nèi)參為表達海腎熒光素酶的pRL-TK載體（E2241，Promega，USA），miR-31 mimic以及miR-31 NC分別與pPKD1-Wt和pPKD1-Mut載體共轉(zhuǎn)染，進入HEK-293T細(xì)胞（CRL-1415，ATCC，USA），用熒光檢測儀（Glomax20/20，Promega，USA）檢測熒光強度。

1.12 qRT-PCR檢測OGD共培養(yǎng)體系中miR-31和PKD1的表達 6孔板培養(yǎng)的各實驗組細(xì)胞，采用Trizol（15596026，Invitrogen，USA）一步法提取細(xì)胞總RNA，用miRVanaTMmiRNA提取試劑盒（AM1552，Ambion，USA）提取miRNA，紫外分光光度儀（DU640，Beckman，USA）檢測RNA純度和濃度，A260/A280比值在1.8～2.0認(rèn)為純度較高。按照PrimeScript RT reagent Kit（RR047A，Takara，Japan）說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)條件為：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；體系20 μL。使用SYBR Premix EX Taq試劑盒（RR420A，Takara）在實時熒光定量PCR儀（ABI 7500，ABI，USA）進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：SYBR Mix 9 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，cDNA 2 μL，RNase Free dH2O 8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，連續(xù)進行40 個循環(huán)。每個孔均設(shè)置3個重復(fù)。U6、miR-31、PKD1和β-actin引物購自上海吉凱基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司（表1）。記錄各孔Ct值，以U6為miR-31內(nèi)參，β-actin為PKD1內(nèi)參，采用2－ΔCt法計算產(chǎn)物相對表達量。

表1 引物序列

1.13 Western blot檢測OGD共培養(yǎng)體系中PKD1及JAK-STAT3通路相關(guān)蛋白表達 6孔板培養(yǎng)的各實驗組細(xì)胞，分別加入RIPA蛋白裂解液（PS0013，雷根生物技術(shù)有限公司，北京），在冰上裂解30 min，以12 000 r/min、4 ℃離心20 min，取上清液分裝備用。按BCA試劑盒（23250，賽默飛世爾科技有限公司，上海）說明書操作步驟說明測定總蛋白的含量后分裝，置入－80 ℃冰箱冷凍待用。各取50 μg各組蛋白，加入蛋白質(zhì)變性劑（38249090，西巴斯生物公司，上海），煮沸10 min變性，后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDSPAGE）分離，在電泳結(jié)束后，用電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。硝酸纖維素膜在含有10%脫脂奶粉的PBST中4 ℃封閉后過夜，PBST漂洗（5 min×3 次），分別加入一抗Bax（1:100，ab77566，Abcam，UK）、cleaved caspase-3（1:100，ab49822，Abcam，UK）、PKD1抗體（1:1 000，ab51246，Abcam）、STAT3（1:2 000，ab68153，Abcam，UK）、p-STAT3（1:500，ab30647，Abcam，UK）和GAPDH（1:100，ab9485，Abcam，UK）37 ℃孵育2 h，PBST充分漂洗（10 min×3 次），后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:1 000，DF109489，瑤韻生物科技有限公司，上海），37 ℃孵育2 h，PBST充分漂洗（10 min×3次）后，利用化學(xué)熒光法（ECL試劑盒，36208ES60，Amersham Life Sciences公司產(chǎn)品，美國）顯色，利用ImageJ灰度分析軟件對Western blot檢測結(jié)果做定量分析。以GAPDH作內(nèi)參，以目標(biāo)條帶與內(nèi)參照條帶的灰度值之比作為蛋白質(zhì)的相對表達水平。每份樣品均設(shè)3個重復(fù)。

1.14 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理，計量資料采用（±s）標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，多組間的比較應(yīng)采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)正態(tài)性檢驗采用Kolmogorov-Smirnov法，呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)多組間比較使用One Way ANOVA中的Tukey's post hoc test，對于偏態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用Kruskal-Wallis test中的 Dunn's post hoc test。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OGD模型乳小鼠星狀膠質(zhì)細(xì)胞miR-31調(diào)控炎癥反應(yīng) 為研究星狀膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)miR-31調(diào)控的炎癥反應(yīng)對正常神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷，我們在星狀膠質(zhì)細(xì)胞分別轉(zhuǎn)入miR-31 mimic和miR-31 inhibitor，培養(yǎng)24 h后收集培養(yǎng)液，檢測其中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達量，此外將收集的培養(yǎng)基按照1:5的濃度加入正常神經(jīng)元培養(yǎng)板各孔之中，其后補加無血清的培養(yǎng)液至每孔液體總量為100 μL，培養(yǎng)48 h后，檢測神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷程度。結(jié)果顯示：與blank和NC組相比，miR-31 mimic組炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達量顯著降低（均P＜0.05），miR-31 inhibitor組炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達量顯著上升（均P＜0.05）。與blank和NC組相比，miR-31 mimic組神經(jīng)元存活率上升，LDH漏出率、ROS表達量顯著降低（均P＜0.05），miR-31 inhibitor組神經(jīng)元存活率顯著降低，LDH漏出率和ROS表達量顯著升高（均P＜0.05）（圖1）。

圖1 OGD模型乳小鼠星狀膠質(zhì)細(xì)胞miR-31調(diào)控炎癥反應(yīng)對神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷

2.2 OGD模型乳小鼠星狀膠質(zhì)細(xì)胞miR-31調(diào)控對神經(jīng)元的活性的影響 為研究星狀膠質(zhì)細(xì)胞分泌的炎癥因子是否會對OGD中神經(jīng)元的損傷有影響，我們采用神經(jīng)元和星狀膠質(zhì)細(xì)胞進行共培養(yǎng)建立OGD模型，對神經(jīng)元損傷情況進行檢測。結(jié)果顯示：與單獨培養(yǎng)（Neuron組）相比，共培養(yǎng)條件下神經(jīng)元（Neuron＋astrocytes）的增殖及存活率、LDH表達及凋亡率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。與神經(jīng)元組（Neuron組）相比，神經(jīng)元OGD模型組（Neuron OGD組）細(xì)胞增殖及存活率減少，培養(yǎng)液中LDH表達增加，細(xì)胞凋亡率增加（均P＜0.05）；與神經(jīng)元OGD模型（Neuron OGD組）相比，神經(jīng)元＋星狀膠質(zhì)細(xì)胞OGD組（Neuron＋astrocytes OGD）細(xì)胞存活率減少，培養(yǎng)液中LDH表達增加，細(xì)胞凋亡率增加（均P＜0.05）。以上說明共培養(yǎng)體系對神經(jīng)元和星狀膠質(zhì)細(xì)胞的生存活力無顯著影響，但OGD模型下，神經(jīng)元會發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，而星狀膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)會加重OGD對神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷程度（圖2，見封二）。

2.3 雙熒光素酶報告基因 通過在線預(yù)測軟件分析，miR-31與PKD1-3'UTR存在結(jié)合位點，PKD1是miR-31的靶基因，圖3A雙熒光素酶實驗結(jié)果顯示：與NC組相比，野生型miR-31 mimic組的熒光素酶活性強度明顯下降（P＜0.05），而突變型質(zhì)粒熒光素酶活性強度無明顯變化（P＞0.05）。說明miR-31能特異結(jié)合PKD1-3'-UTR并下調(diào)PKD1基因表達（圖3B）。

圖3 雙熒光素酶報告基因

2.4 OGD模型乳小鼠星狀膠質(zhì)細(xì)胞miR-31調(diào)控PKD1對各組細(xì)胞中mRNA、蛋白表達水平及炎癥因子表達量的影響 在OGD建模后共培養(yǎng)體系中，采用qRT-PCR檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞中PKD1 mRNA（圖4A），WB檢測PKD1表達和JAK-STAT3通路STAT3蛋白及其磷酸化水平（圖4B、C），ELISA試劑盒檢測炎癥因子表達量（圖4D）。結(jié)果顯示：相比于normal組，blank OGD組的星狀膠質(zhì)細(xì)胞中miR-31的表達量下降（P＜0.05），而PKD1表達和p-STAT3/STAT3顯著上升（P＜0.05），炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達量上調(diào)（P＜0.05）；相比于blank OGD組，miR-31 mimic OGD組星狀膠質(zhì)細(xì)胞中miR-31的表達量上調(diào)（P＜0.05），而PKD1表達和p-STAT3/STAT3顯著降低（P＜0.05），炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達量下調(diào)（P＜0.05）；miR-31 inhibitor OGD組miR-31的表達量下降（P＜0.05），而PKD1表達和p-STAT3/STAT3顯著上升（均P＜0.05），炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達量上調(diào)（P＜0.05）；si-PKD1 OGD組和si-PKD1＋CdCl2OGD組miR-31的表達量無顯著變化（P＞0.05），而PKD1表達和p-STAT3/STAT3顯著降低（均P＜0.05），炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達量下調(diào)（P＜0.05）； NC OGD組各指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。以上結(jié)果說明，星形膠質(zhì)細(xì)胞中miR-31靶向抑制PKD1表達，阻礙JAK-STAT3通路的激活，降低炎癥反應(yīng)。

圖4 星狀膠質(zhì)細(xì)胞miR-31調(diào)控PKD1基因抑制OGD引起的炎癥反應(yīng)

2.5 OGD模型乳小鼠星狀膠質(zhì)細(xì)胞miR-31調(diào)控PKD1基因抑制OGD導(dǎo)致的神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷 為深入研究星狀膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)miR-31調(diào)控PKD1基因介導(dǎo)JAK-STAT3信號通路參與缺血性腦卒中神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷保護機制，我們加入miR-31 mimic或inhibitor，si-PKD1或JAK-STAT3通路抑制劑，更有針對性研究各分子具體調(diào)控作用。本研究采用MTT、LDH、TUNEL染色和WB檢測神經(jīng)元損傷與凋亡情況。結(jié)果顯示：相比于normal組，blank組LDH和MDA表達量上升，SOD表達下降，神經(jīng)元膜脂質(zhì)過氧化損傷標(biāo)志蛋白4-HNE和DNA氧化損傷標(biāo)志蛋白8-OHdG免疫染色強度增強，神經(jīng)元存活率降低，神經(jīng)元出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷（均P＜0.05）；與blank OGD組相比，miR-31 inhibitor OGD組LDH漏出量和MDA表達量上升，SOD表達下降，神經(jīng)元膜脂質(zhì)過氧化損傷標(biāo)志蛋白4-HNE和DNA氧化損傷標(biāo)志蛋白8-OHdG免疫染色強度增強，神經(jīng)元存活率降低，細(xì)胞凋亡率上升，神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷加重 （均P＜0.05）；miR-31 mimic OGD組、si-PKD1 OGD組和si-PKD1＋CdCl2OGD組LDH漏出量和MDA表達量下降，SOD表達上升，神經(jīng)元膜脂質(zhì)過氧化損傷標(biāo)志蛋白4-HNE和DNA氧化損傷標(biāo)志蛋白8-OHdG免疫染色強度降低，神經(jīng)元存活率增加，細(xì)胞凋亡率下降，神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷減緩（均P＜0.05）；NC OGD組各指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。以上結(jié)果說明星狀膠質(zhì)細(xì)胞miR-31過表達、PKD1沉默和JAK-STAT3通路抑制劑會增加神經(jīng)元存活率，降低凋亡率，減緩OGD導(dǎo)致的神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷（圖5A-E，見封二）。

采用TUNEL染色（圖5F，見封二）和WB（圖5G、H，見封二）檢測神經(jīng)元凋亡情況，結(jié)果顯示：相比于normal組，blank OGD組神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3、Bax表達顯著增加（均P＜0.05）；與blank OGD組相比，miR-31 inhibitor OGD組神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率及cleaved caspase-3、Bax表達明顯上升（均P＜0.05）；miR-31 mimic OGD組、si-PKD1 OGD組和si-PKD1＋CdCl2OGD組神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率及cleaved caspase-3、Bax表達明顯下調(diào)（均P＜0.05）；NC OGD組各cleaved caspase-3、Bax表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。說明OGD模型的建立會導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡加重，而與神經(jīng)元共培養(yǎng)的星狀膠質(zhì)細(xì)胞中miR-31過表達、PKD1沉默和JAK-STAT3通路抑制劑會減緩OGD導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡程度。

3 討論

炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激都被認(rèn)為是IS進展的重要致病因素，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷和細(xì)胞死亡。最近的研究表明，在IS的發(fā)病機制中miRNA可以作為關(guān)鍵介質(zhì)，通過沉默轉(zhuǎn)錄后基因來影響局灶性腦損傷[6]。此外，各種表達的miRNA可誘導(dǎo)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，例如，miR-31可調(diào)節(jié)STAT3的激活[7]。miR-31被認(rèn)為是一種有效的調(diào)節(jié)物，對淋巴血管譜系特異性分化和血管發(fā)育具有一定的治療作用，并與氧化應(yīng)激有關(guān)。據(jù)報道，氧化應(yīng)激是腦缺血的一個關(guān)鍵有害因素，通過各種途徑導(dǎo)致缺血組織壞死和凋亡。作為DNA氧化應(yīng)激損傷標(biāo)記物，4-HNE和8-OHdG在培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞中積累，并有可能導(dǎo)致缺血和OGD。抑制4-HNE和8-OHdG在降低大鼠腦缺血/再灌注損傷后氧化應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮了重要作用。Caspase-3和Bax的激活與腦缺血大鼠的神經(jīng)元凋亡有關(guān)。mi-31的上調(diào)參與炎癥反應(yīng)，并抑制內(nèi)皮細(xì)胞中促炎介質(zhì)（如IL-6和TNF-α）的下游產(chǎn)生[8]。miR-31的過度表達有能力影響星形膠質(zhì)細(xì)胞，同時也支持成年膠質(zhì)祖細(xì)胞中的膠質(zhì)細(xì)胞存活[9]?；谶@些事實，本研究旨在探討OGD模型乳小鼠的星狀膠質(zhì)細(xì)胞miR-31調(diào)控PKD1基因表達，抑制JAK-STAT3信號通路活化介導(dǎo)共培養(yǎng)神經(jīng)元炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激損傷。也有報道稱，通過下調(diào)多種靶基因和調(diào)節(jié)下游通路，miRNA有可能影響惡性腫瘤細(xì)胞生存[10]。PKD1調(diào)節(jié)許多生理功能，包括蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運、免疫系統(tǒng)、血管生成和癌癥；它對特定神經(jīng)疾病的預(yù)后和進展起著重要作用。以往的研究表明，降低大腦中的PKD1可減少缺血性神經(jīng)元損傷[11]。此外，PKD1在體外和體內(nèi)的直腸陰道念珠菌介導(dǎo)的促炎反應(yīng)中起著重要作用。我們的研究也表明，過表達miR-31或PKD1基因敲除通過激活JAK/STAT3通路抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。據(jù)報道，miR-31的過度表達抑制了STAT3通路的激活，并通過靶向Wnt影響腸干細(xì)胞（ISCS）的輻射損傷[12]。更重要的是，JAK/STAT通路的抑制可降低MMP3的水平，從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，改善急性IS患者的血腦屏障完整性[13]。

我們的研究結(jié)果表明，OGD模型乳小鼠星狀膠質(zhì)細(xì)胞miR-31調(diào)控炎癥反應(yīng)結(jié)果顯示：與blank和NC組相比，miR-31 mimic組炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達量顯著降低 （均P＜0.05），miR-31 inhibitor組炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達量顯著上升（均P＜0.05）；與blank和NC組相比，miR-31 mimic組神經(jīng)元存活率上升，LDH漏出率、ROS表達量顯著降低（均P＜0.05），miR-31 inhibitor組神經(jīng)元存活率顯著降低，LDH漏出率和ROS表達量顯著升高（均P＜0.05），說明OGD模型乳小鼠星狀膠質(zhì)細(xì)胞miR-31調(diào)控炎癥反應(yīng)。OGD模型乳小鼠星狀膠質(zhì)細(xì)胞miR-31調(diào)控對神經(jīng)元的活性的影響結(jié)果顯示：與單獨培養(yǎng)（Neuron組）相比，共培養(yǎng)條件下神經(jīng)元（Neuron＋astrocytes）的增殖及存活率、LDH表達及凋亡率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；與神經(jīng)元組（Neuron組）相比，神經(jīng)元OGD模型組（Neuron OGD組）細(xì)胞增殖及存活率減少，培養(yǎng)液中LDH表達增加，細(xì)胞凋亡率增加（均P＜0.05）；與神經(jīng)元OGD模型（Neuron OGD組）相比，神經(jīng)元＋星狀膠質(zhì)細(xì)胞OGD組（Neuron＋astrocytes OGD）細(xì)胞存活率減少，培養(yǎng)液中LDH表達增加，細(xì)胞凋亡率增加（均P＜0.05），以上說明共培養(yǎng)體系對神經(jīng)元和星狀膠質(zhì)細(xì)胞的生存活力無顯著影響，但OGD模型下，神經(jīng)元會發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，而星狀膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)會加重OGD對神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷程度。OGD模型乳小鼠星狀膠質(zhì)細(xì)胞miR-31調(diào)控PKD1對各組細(xì)胞中mRNA、蛋白表達水平及炎癥因子表達結(jié)果顯示：相比于normal組，blank OGD組的星狀膠質(zhì)細(xì)胞中miR-31的表達量下降（P＜0.05），而PKD1表達和p-STAT3/STAT3顯著上升（P＜0.05），炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達量上調(diào)（P＜0.05）；相比于blank OGD組，miR-31 mimic OGD組星狀膠質(zhì)細(xì)胞中miR-31的表達量上調(diào)（P＜0.05），而PKD1表達和p-STAT3/STAT3顯著降低（P＜0.05），炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達量下調(diào)（P＜0.05）；miR-31 inhibitor OGD組miR-31的表達量下降（P＜0.05），而PKD1表達和p-STAT3/STAT3顯著上升（均P＜0.05），炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達量上調(diào)（P＜0.05）；si-PKD1 OGD組和si-PKD1＋CdCl2OGD組miR-31的表達量無顯著變化（P＞0.05），而PKD1表達和p-STAT3/STAT3顯著降低（均P＜0.05），炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達量下調(diào)（P＜0.05）；NC OGD組各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；OGD模型乳小鼠星狀膠質(zhì)細(xì)胞miR-31調(diào)控PKD1基因抑制OGD導(dǎo)致的神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷結(jié)果顯示：相比于normal組，blank OGD組LDH和MDA表達量上升，SOD表達下降，神經(jīng)元膜脂質(zhì)過氧化損傷標(biāo)志蛋白4-HNE和DNA氧化損傷標(biāo)志蛋白8-OHdG免疫染色強度增強，神經(jīng)元存活率降低，神經(jīng)元出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷（均P＜0.05）；與blank OGD組相比，miR-31 inhibitor OGD組LDH漏出量和MDA表達量上升，SOD表達下降，神經(jīng)元膜脂質(zhì)過氧化損傷標(biāo)志蛋白4-HNE和DNA氧化損傷標(biāo)志蛋白8-OHdG免疫染色強度增強，神經(jīng)元存活率降低，細(xì)胞凋亡率上升，神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷加重（均P＜0.05）；miR-31 mimic OGD組、si-PKD1 OGD組和si-PKD1＋CdCl2OGD組LDH漏出量和MDA表達量下降，SOD表達上升，神經(jīng)元膜脂質(zhì)過氧化損傷標(biāo)志蛋白4-HNE和DNA氧化損傷標(biāo)志蛋白8-OHdG免疫染色強度降低，神經(jīng)元存活率增加，細(xì)胞凋亡率下降，神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷減緩（均P＜0.05）；NC OGD組各指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；采用TUNEL染色及Western blot檢測OGD共培養(yǎng)體系中神經(jīng)元凋亡結(jié)果顯示：相比于normal組，blank OGD組神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3、Bax表達顯著增加（均P＜0.05）；與blank OGD組相比，miR-31 inhibitor OGD組神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率及cleaved caspase-3、Bax表達明顯上升（均P＜0.05）；miR-31 mimic OGD組、si-PKD1 OGD組和si-PKD1＋CdCl2OGD組神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率及cleaved caspase-3、Bax表達明顯下調(diào)（均P＜0.05）；NC OGD組各cleaved caspase-3、Bax表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），以上結(jié)果說明，OGD模型乳小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中miR-31靶向抑制PKD1表達，阻礙JAK-STAT3通路的激活，降低炎癥反應(yīng)。

總之，以上結(jié)論表明miR-31的過度表達通過下調(diào)PKD1激活JAK/STAT3通路，從而抑制OGD神經(jīng)元炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)損傷。我們的發(fā)現(xiàn)可能闡明了通過干預(yù)miR-31的表達靶向調(diào)控PKD1激活JAK/STAT3通路，以對IS的神經(jīng)保護機制提供理論依據(jù)。