江 夢，王麒龍

（1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，江蘇 蘇州 215006；2.蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 蘇州 215004）

腦膠質(zhì)瘤起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，是發(fā)病率最高的腦腫瘤，因其呈浸潤性生長，與正常腦組織分界不清，手術(shù)常難徹底切除。腦膠質(zhì)瘤具有復(fù)發(fā)率高、生存期短的特點(diǎn)，單純手術(shù)后平均生存期僅8個月，通過術(shù)后輔助放療和化療，生存期可提高至11 個月，但中位生存期最長仍不超過2 年?，F(xiàn)有的治療措施難以達(dá)到根除該腫瘤的目的，嚴(yán)重影響著患者生存質(zhì)量和生存期。目前針對腦膠質(zhì)瘤的治療原則，還是強(qiáng)調(diào)以手術(shù)切除腫瘤為主，在此基礎(chǔ)上聯(lián)合放療和化療，但療效并不滿意。

石墨烯作為一種新型二維碳納米材料，以其優(yōu)良的電學(xué)、光學(xué)、熱學(xué)和機(jī)械性能，自2004年問世以來倍受研究人員的高度關(guān)注。目前有關(guān)石墨烯及其衍生物的研究，主要集中在物理學(xué)研究領(lǐng)域。近年來，石墨烯的化學(xué)和材料學(xué)研究也發(fā)展迅速，而石墨烯在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究也逐漸成為熱點(diǎn)[1]。之前的研究表明，通過利用納米氧化石墨烯（nano graphene oxide, nGO）可通過較高的物理吸附作用與芳香環(huán)類藥物非共價結(jié)合的特性[2]，能夠遞送一些難溶性藥物，尤其是抗腫瘤藥物，由此可構(gòu)建一種新型的、具有膠質(zhì)瘤靶向性的納米載藥系統(tǒng)，并通過體外、體內(nèi)試驗證實(shí)其治療腦膠質(zhì)瘤具有顯著的效果[3-6]。然而我們發(fā)現(xiàn)，相對于nGO在化學(xué)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)領(lǐng)域相對深入的研究，其在放療效應(yīng)的研究方面相對缺失。受啟發(fā)于一系列納米材料在放射治療領(lǐng)域的放射增敏效應(yīng)[7]，本研究采用nGO與國內(nèi)放療常用的兆伏級X線聯(lián)合的方法，來探討nGO對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87放射敏感性的影響，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 nGO的制備

1.1.1 天然石墨預(yù)氧：石墨中加入濃硫酸、P2O5、K2S2O8，80 ℃持續(xù)6 h，之后將所得的產(chǎn)物水洗并過濾，使得其pH值等于7，將產(chǎn)物減壓干燥，獲得預(yù)氧化的石墨。

1.1.2 氧化石墨的制備：將預(yù)氧化的石墨，加入適量的濃硫酸，冷卻至0 ℃，并在此過程之中緩慢地加入KMnO4，保持溫度（20 ℃），持續(xù)30 min。然后將溫度升至35 ℃，恒溫下攪拌2 h（轉(zhuǎn)速250 r/min）。接著加入三蒸水，攪拌15 min（轉(zhuǎn)速：250 r/min）。加入140 mL三蒸水終止反應(yīng)。往反應(yīng)液中再次加入雙氧水，使得反應(yīng)液的顏色變成綠色。將反應(yīng)液置入離心管中高速離心（轉(zhuǎn)速4 000 r/min），并將沉淀用10% HCl反復(fù)洗滌并離心3 次，以除去無機(jī)金屬氧化物。再將所得到的沉淀用三蒸水洗滌至中性，從而得到氧化石墨。

1.1.3 氧化石墨的剝離及純化：將制備的氧化石墨加入三蒸水，使用超聲振蕩30 min后常溫下12 000 r/min離心15 min，收集上清，即得到氧化石墨烯（graphene oxide, GO）分散液，將收集的GO分散液用三蒸水透析48 h（8 000～14 000 Da透析袋），除去殘余無機(jī)離子，獲得GO分散液。

1.1.4 nGO制備：將已經(jīng)制備的GO分散液超聲振蕩1 h，將GO分散液用220 nm孔徑的過濾器過濾，收集濾液，常溫下透析24 h（8 000～14 000 Da透析袋），得到nGO。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 使用含10%小牛血清的DEME培養(yǎng)液培養(yǎng)人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞，培養(yǎng)條件：37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱，細(xì)胞貼壁生長良好，每天傳代1 次。

1.3 阿拉瑪藍(lán)法檢測nGO對U87細(xì)胞存活的影響 取指數(shù)生長期U87細(xì)胞，以每孔3 000 個細(xì)胞接種于96孔板。以空白組調(diào)零，設(shè)對照組、藥物組（25、50、100、200、400 nmol/L nGO）、單純放射組（6 Gy-X線）、聯(lián)合放射組（nGO＋6 Gy-X線），每組設(shè)8個副孔，培養(yǎng)24 h后，加入無藥培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，單純放射組及聯(lián)合放射組給予射線6 Gy照射，各組處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入阿拉瑪藍(lán)，酶聯(lián)免疫檢測分析儀測定其吸光度值，以間接反映存活細(xì)胞的數(shù)量，計算不同濃度及放射條件下的細(xì)胞存活情況。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 U87細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h，設(shè)對照組、nGO組（25 nmol/L nGO）、單純放射組（6 Gy-X線）、聯(lián)合放射組（25 nmol/L nGO＋6 Gy-X線）。nGO組和聯(lián)合放射組加入25 nmol/L nGO培養(yǎng)24 h，單純放射組與聯(lián)合放射組給予6 Gy X線照射，4組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，依次加入Annexin Ⅴ結(jié)合液、Annexin Ⅴ-FITC和PI室溫避光染色，染色后立即上流式細(xì)胞儀檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 實(shí)驗數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計軟件分析處理。每組實(shí)驗均重復(fù)3 次，獨(dú)立完成。實(shí)驗數(shù)據(jù)以（±s）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 nGO的粒徑及形態(tài) 如圖1所示，通過AFM觀測GO的粒徑，以及GO的厚度。測定結(jié)果顯示制備的nGO厚度約1 nm。

圖1 nGO的粒徑及形態(tài)

2.2 nGO對U87細(xì)胞生長的影響 不同濃度nGO作用48 h后，U87細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），可見低濃度（≤400 nmol/L）nGO對U87細(xì)胞無明顯毒性。

不同濃度nGO作用24 h，聯(lián)合放射（6 Gy-X線）24 h后，在400 nmol/L范圍內(nèi)，U87細(xì)胞生長抑制率不隨nGO濃度增大而逐漸增加。見圖2。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 nGO組較對照組G2/M 期細(xì)胞比例增加，S期比例下降。見圖3。

圖3 兩個組別的細(xì)胞周期比較

2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 nGO和X線均能誘導(dǎo)U87細(xì)胞凋亡，凋亡率分別為(2.35±1.43)%、(8.14±1.67)%，聯(lián)合放射組凋亡率為(27.56±1.04)%，顯著高于前兩組（P＜0.01）。兩者聯(lián)合應(yīng)用，能明顯增加細(xì)胞凋亡率。見圖4。

圖4 nGO和X線誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率比較

3 討論

石墨烯及其衍生物由于具有獨(dú)特的二維結(jié)構(gòu)、優(yōu)良的理化特性、制備方法的多樣化、成本低廉，適于規(guī)?；苽涞忍攸c(diǎn)，因而在復(fù)合材料、傳感器、能源等眾多領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力，成為物理學(xué)、化學(xué)、材料科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[1,7]。目前在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，較多應(yīng)用的石墨烯衍生物主要是功能化的GO。由于GO上含有大量的含氧活性基團(tuán)，因此具有良好的生物相容性和水溶液穩(wěn)定性，并且利于化學(xué)功能化修飾，以達(dá)到在不同領(lǐng)域應(yīng)用的目的。

我們之前的研究結(jié)果證明，低濃度的nGO對U87細(xì)胞無毒性作用。本研究應(yīng)用阿拉瑪藍(lán)法證實(shí)，低濃度（≤400 nmol/L）nGO對U87細(xì)胞的生長無明顯影響，即低濃度nGO對U87細(xì)胞無毒性。nGO聯(lián)合放射有抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的作用，然而在400 nmol/L的濃度范圍內(nèi)，其抑制作用并未隨著濃度的增加而增強(qiáng)。放射組（6 Gy組）可見從第5天開始，加nGO的所有組均比未加nGO組的生長抑制明顯，而且第7天其抑制效應(yīng)最明顯，即：其放療增敏的效應(yīng)具有時間依賴性而非劑量依賴性。nGO的放療增敏效應(yīng)并不隨著其濃度的增大而增強(qiáng)；其放療抑制效應(yīng)在第7天達(dá)到最大。說明低劑量的納米材料即可達(dá)到放療增敏的作用。

流式細(xì)胞儀檢測凋亡結(jié)果表明，nGO和單純放射均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，凋亡率分別為(2.35±1.43)%、(8.14±1.67)%，而聯(lián)合放射組細(xì)胞凋亡率為(27.56±1.04)%，顯著高于前兩組（P＜0.01），提示nGO能夠產(chǎn)生放射增敏。細(xì)胞周期研究結(jié)果顯示，藥物組G2/M期細(xì)胞比例為(16.31±1.15)%，高于對照組(11.89±3.27)%（P＜0.05），提示nGO作用后膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期改變，細(xì)胞阻滯于G2/M期，從而增強(qiáng)放射敏感性。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，通過體外實(shí)驗，nGO聯(lián)合放射能夠增加U87細(xì)胞對放射的敏感性，其放射增敏機(jī)制可能是通過阻滯細(xì)胞于G2/M期、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。因此，石墨烯也可能存在放射增敏方面的潛能。然而除此之外，nGO的生物安全性及代謝方面研究相對較少，當(dāng)nGO進(jìn)入生物體內(nèi)，可能對DNA、蛋白質(zhì)等生物分子產(chǎn)生吸附作用，從而可能引起正常生理功能的改變，這一點(diǎn)也需要引起重視?？傊?，隨著研究的不斷深入，nGO有望成為一種極有前景的放射增敏劑。