任晉東，牛寶龍*，楊衛(wèi)明，樓寶*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水生生物研究所，浙江 杭州 310021； 2.海鹽縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，浙江 嘉興 314300)

我國是對蝦養(yǎng)殖大國。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界具有商業(yè)價(jià)值或潛在商業(yè)價(jià)值的蝦有300多種，我國近海對蝦種類達(dá)100多種[1]，主要養(yǎng)殖類別包括凡納濱對蝦、中國對蝦、長毛對蝦、斑節(jié)對蝦、日本對蝦、墨古對蝦等，以及由此培育的新品種。隨著蝦苗種質(zhì)資源退化和病害頻發(fā)等問題，我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)受到巨大影響[2]。由于對蝦雌雄之間的某些生物學(xué)或經(jīng)濟(jì)學(xué)性狀(生長速度、個(gè)體大小等)存在顯著差異，且性成熟后個(gè)體大小相差懸殊，如果實(shí)現(xiàn)單性化養(yǎng)殖，則可以縮短養(yǎng)殖周期，提高產(chǎn)量。

類胰島素性腺激素(insulin-like androgenic gland hormone，IAG)是甲殼類動物雄性個(gè)體性腺分化和維持性別特征的控制因子，其在雄性甲殼類動物性腺中的表達(dá)情況決定著雄性個(gè)體性腺的分化發(fā)育方向。IAG在對蝦性腺分化中調(diào)控分子機(jī)理的研究對于揭示對蝦性腺發(fā)育分化機(jī)理、提高對蝦生產(chǎn)效率和開發(fā)高產(chǎn)單性對蝦群體或配體套系具有重要的理論指導(dǎo)意義，并為開發(fā)更為便捷的對蝦性別逆轉(zhuǎn)方法提供理論基礎(chǔ)。

本文就對蝦性腺結(jié)構(gòu)與作用、IAG介導(dǎo)對蝦性別控制、IAG與對蝦性腺分化作用、IAG調(diào)控對蝦性別控制機(jī)制的難點(diǎn)，以及以IAG為關(guān)鍵因子進(jìn)行對蝦單性繁育群體構(gòu)建的可行性措施進(jìn)行綜述，旨在為對蝦單性繁育技術(shù)研究提供參考。

1 對蝦性腺結(jié)構(gòu)特征

對蝦屬于節(jié)肢動物門、甲殼綱、十足目、對蝦科，可分為淡水類和海水類。雌性對蝦生殖系統(tǒng)主要包括卵巢及輸卵管等，輸卵管位于卵巢兩側(cè)，呈透明狀[3]；雄性對蝦生殖系統(tǒng)主要包括精巢、輸精管和精囊莢，精莢囊末端附著有促雄性腺(圖1)。研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對蝦促雄性腺位于精莢囊的壺腹部，呈不規(guī)則塊狀結(jié)構(gòu)(圖2)[4]。1962年，Charniaux-Cotton研究發(fā)現(xiàn)促雄性腺與甲殼動物雄性分化和發(fā)育相關(guān)[5]；1999年，Khalaila等[6]發(fā)現(xiàn)促雄性腺素(insulin-like androgenic gland hormone，IAG)在沼蝦性腺分化中起決定性作用，至此揭開研究人員對IAG和甲殼類動物促雄性腺體主要功能的初步認(rèn)識和了解。

A—雌性對蝦；B—雄性對蝦。圖1 脊尾白蝦性腺的結(jié)構(gòu)解剖

A—促雄性腺的外部形態(tài)；B—放大20倍的促雄性腺。SV—精莢囊；AG—促雄性腺。圖2 對蝦促雄性腺體的解剖結(jié)構(gòu)

甲殼動物的促雄性腺常位于第五對步足基部，多數(shù)位于輸精管近末端[7]。厚紋蟹(Pachygrapsuscrassipes)促雄性腺呈索狀[8]，纏繞在輸精管上，切面直徑30～50 μm，某些部位促雄性腺細(xì)胞聚集成團(tuán)，腺體包被一層很薄的鞘膜，細(xì)胞質(zhì)比較均勻，細(xì)胞核呈卵圓形，最大細(xì)胞直徑達(dá)8～10 μm[9]。中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)與克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)細(xì)胞類型相似[10]，呈葡萄串狀，由長橢圓形和球形這2種細(xì)胞組成。凡納濱對蝦促雄性腺呈不規(guī)則的塊狀，通過結(jié)締組織與精莢囊相連，在不同的發(fā)育時(shí)期其結(jié)構(gòu)和細(xì)胞類型會發(fā)生一定變化。

促雄性腺是雄性甲殼動物特有的內(nèi)分泌器官，也是分泌IAG的唯一性腺體[11-12]。IAG分子由2條肽鏈組成，中間由2個(gè)二硫鍵連接，結(jié)構(gòu)與胰島素家族類似，因此，又被稱為類胰島素性腺激素[13]。研究發(fā)現(xiàn)，促雄性腺不僅在雄性性別發(fā)育分化中具有一定的作用，而且在鰲蝦生長發(fā)育中也具有一定的功能[14]。Tekitek等[15]發(fā)現(xiàn)，甲殼類動物促雄性腺在性腺發(fā)育成熟的過程中存在高水平的甲基化酶表達(dá)，而DNA甲基化對于細(xì)胞分化過程中多個(gè)基因座大規(guī)模改變產(chǎn)生作用[16]，表明雌雄個(gè)體IAG差異表達(dá)與上游的甲基化調(diào)控存在一定關(guān)聯(lián)。然而，IAG在促雄性腺體發(fā)育分化中是否受到DNA甲基化酶的調(diào)控尚不明確，尤其是在IAG不表達(dá)的情況下，其誘導(dǎo)的性腺逆轉(zhuǎn)分化調(diào)控分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

2 IAG結(jié)構(gòu)特征與特性

IAG是甲殼類動物雄性個(gè)體性腺分化和維持性別特征的控制因子，由雄性個(gè)體的性腺體分泌，并且決定了雄性個(gè)體的性特征[17-18]。在缺乏IAG的情況下，雄性個(gè)體會出現(xiàn)性逆轉(zhuǎn)，表現(xiàn)出雌性繼發(fā)性特征和卵黃發(fā)生；將能夠分泌IAG的AG細(xì)胞懸液植入未成熟雌性個(gè)體中，導(dǎo)致雌性個(gè)體性逆轉(zhuǎn)和卵黃發(fā)生停止[19]。由于IAG在雄性甲殼類動物性腺中的表達(dá)情況決定著雄性個(gè)體性腺的分化發(fā)育方向(圖3)，常用其作用于甲殼類動物，以構(gòu)建單性繁殖群體，培育高產(chǎn)的甲殼類動物優(yōu)勢種群或新品種。

圖3 IAG對甲殼類動物雄性個(gè)體性別的控制機(jī)理

已有甲殼類動物性別控制方法較多，Levy等[20]利用性腺細(xì)胞移植進(jìn)行羅氏沼蝦雄性個(gè)體性別翻轉(zhuǎn)，Sellars等[21]利用三倍體誘導(dǎo)進(jìn)行對蝦性別控制，Lezer等[19]利用RNA干擾表達(dá)技術(shù)進(jìn)行IAG基因表達(dá)控制，從而調(diào)控甲殼類動物性腺分化。水產(chǎn)動物性腺分化較復(fù)雜[22]，而IAG對于甲殼類動物性腺分化控制的高效性，決定了IAG在調(diào)控甲殼類動物性腺分化機(jī)制中的關(guān)鍵性作用。IAG主要通過性腺激素調(diào)控軸和神經(jīng)遞質(zhì)傳遞調(diào)控軸2種途徑進(jìn)行性別控制。性腺激素調(diào)控途徑中，性腺刺激激素、IAG和性腺抑制激素發(fā)揮關(guān)鍵作用；在神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)控途徑中，僅有性腺抑制基因存在關(guān)鍵調(diào)控作用。IAG的表達(dá)對性腺抑制激素基因的表達(dá)有影響，但I(xiàn)AG調(diào)控的下游轉(zhuǎn)錄因子有哪些，這些調(diào)控因子如何控制性腺分化，以及IAG基因自身表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制尚處于探索階段。

3 IAG介導(dǎo)的對蝦性別控制

IAG是維持甲殼動物雄性個(gè)體性腺分化發(fā)生的唯一確定的關(guān)鍵因子，其自身表達(dá)也具有顯著的時(shí)空特征[23-24]，IAG具有調(diào)控雄性分化、維持雄性第二性征的功能，可抑制甲殼動物的卵巢發(fā)育[25]。IAG不表達(dá)的情況下，雄性個(gè)體保持雌性個(gè)體特征，分化形成雌性生殖腺，產(chǎn)生成熟的卵子[19]。

Ventura等[26]通過RNAi對羅氏沼蝦雄性個(gè)體IAG基因進(jìn)行沉默表達(dá)研究，發(fā)現(xiàn)其在甲殼類動物性腺逆轉(zhuǎn)分化過程中產(chǎn)生作用。在羅氏沼蝦幼蟲階段后期注射雙鏈的IAG干擾表達(dá)序列，羅氏沼蝦逆轉(zhuǎn)成全雌性表征個(gè)體，并具有完整的雌性羅氏沼蝦繁殖生殖系統(tǒng)[27]。利用IAG干擾表達(dá)和兩階段式的生產(chǎn)繁育方式，可以大范圍培育全雄性個(gè)體的繁育生產(chǎn)群體，是甲殼類動物單性繁殖的研究熱點(diǎn)[20，28]。兩階段式生產(chǎn)方式指通過注射雙鏈的IAG干擾表達(dá)RNA序列獲得假雌性個(gè)體，然后利用假雌性個(gè)體與真雄性個(gè)體繁殖生產(chǎn)，孵化獲得全雄性個(gè)體的生產(chǎn)群體。同時(shí)基于IAG的RNAi干擾技術(shù)，研究獲得了甲殼類動物早期性別鑒定的高效生物標(biāo)記[29]。已有研究發(fā)現(xiàn)IAG在甲殼類動物性別控制中的關(guān)鍵作用，但對于IAG調(diào)控甲殼類水產(chǎn)動物性腺逆轉(zhuǎn)分化和生殖系統(tǒng)表觀遺傳特征的生物信號通路仍未知，其分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 IAG與對蝦性腺分化

甲殼類動物中雄性個(gè)體的性腺分化受到雄激素腺體控制[5]，雄激素腺體是甲殼動物雄性個(gè)體性器官發(fā)育成熟過程中最重要的參與者[30]。雄激素腺體不僅能夠在甲殼動物雄性遺傳基礎(chǔ)上發(fā)揮雄性化的調(diào)控作用，也可以令雌性個(gè)體在原有遺傳基礎(chǔ)上逆轉(zhuǎn)形成雄性生殖腺體，并產(chǎn)生相似的雄性生殖特性[31]。當(dāng)雄性甲殼類個(gè)體摘除雄激素腺體后，雄性個(gè)體能夠表現(xiàn)出雌性個(gè)體的繁殖特征[32]。Manor等[30]研究發(fā)現(xiàn)，IAG是由雄激素腺體分泌的性別控制關(guān)鍵因子，是雄激素腺體發(fā)揮功能的關(guān)鍵分子。在雙鏈核糖核酸注射沉默IAG編碼基因的情況下，會導(dǎo)致甲殼蝦類動物雄性個(gè)體的性腺逆轉(zhuǎn)分化[19]。

盡管IAG基因在雌雄個(gè)體基因組中都有發(fā)現(xiàn)，但最初研究人員一直認(rèn)為其僅在雄激素腺體中表達(dá)。IAG不僅具有誘導(dǎo)雄性個(gè)體性腺分化的作用，還具有刺激雌性個(gè)體生長和性器官發(fā)育的功能[25，33]。雖然IAG在孤雌生殖的十足目物種中也有表達(dá)[20]，但由于研究技術(shù)局限，還未探明其調(diào)控機(jī)制。隨著單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的成熟和凡納濱對蝦基因組的成功破譯，為深入探索對蝦性腺分化分子機(jī)理提供了必要的系統(tǒng)資源[34]。已有研究通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)完成首個(gè)哺乳動物的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜，為進(jìn)一步揭示其他物種不同細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控通路提供了很好的技術(shù)借鑒[35]，也為進(jìn)一步挖掘IAG的系統(tǒng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖譜提供了方法工具。

5 利用IAG構(gòu)建單性對蝦繁育群體的難點(diǎn)

雖然IAG作為一種有效的水產(chǎn)動物性別逆轉(zhuǎn)關(guān)鍵因子，但將其應(yīng)用于對蝦單性繁育存在以下難點(diǎn)。一是對蝦性腺分化關(guān)鍵期較難確定。對蝦的發(fā)育包括幼體、康蝦、籽蝦、成蝦等階段，在性別分化時(shí)間上存在很大的差異。楊炎等[36]研究發(fā)現(xiàn)，米蝦的雌雄個(gè)體性腺分化階段存在時(shí)間差異，雌性個(gè)體的卵巢從孵化后第10天開始分化，形成早期的卵原細(xì)胞，而雄性個(gè)體精巢分化要早于雌個(gè)體。與米蝦相比，羅氏沼蝦的性腺分化階段相對較晚，羅氏沼蝦體長達(dá)到3～5 cm時(shí)還處于分化中[37]。海水類對蝦的性腺分化更加復(fù)雜，其分化過程易受到溫度、鹽度等因素影響[38]。對蝦性腺分化時(shí)體長僅為1 cm左右，很難進(jìn)行生物技術(shù)干擾等操作，因此，對蝦實(shí)現(xiàn)性逆轉(zhuǎn)或單性養(yǎng)殖的難度較大。二是性染色體類型具有不確定性。對蝦染色體數(shù)量和類型具有多樣性[39]，已有研究通過人工染色體庫技術(shù)構(gòu)建了羅氏沼蝦“ZW”類型表達(dá)基因庫[40]，但I(xiàn)AG基因是否位于性染色體或是常染色體上仍未知。三是性別分化的分子機(jī)制尚未明確。雖然IAG基因的表達(dá)對性腺抑制激素基因的表達(dá)有影響，但是IAG調(diào)控的下游轉(zhuǎn)錄因子有哪些、這些調(diào)控因子如何控制性腺分化，以及IAG基因自身表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制尚處于未知階段，這也給進(jìn)一步利用IAG調(diào)控通路進(jìn)行單性繁育群體構(gòu)建提出了挑戰(zhàn)。

6 對蝦單性繁育技術(shù)研究策略

基于對蝦單性繁育技術(shù)的難點(diǎn)，可以針對性的利用成熟的生物基因組重測序技術(shù)，探明IAG表達(dá)的上游調(diào)控機(jī)制，以及Microwell-Seq技術(shù)和生物信息學(xué)方法找到對蝦性腺分化的起始關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)，利用IAG干擾后的假雌性和真雄性個(gè)體性腺分化前后的差異表達(dá)基因，預(yù)測特異性的IAG靶向調(diào)控基因，并進(jìn)行體外驗(yàn)證，最終闡明IAG在對蝦性腺分化控制中的分子機(jī)理，實(shí)現(xiàn)對蝦高產(chǎn)單性群體的培育。具體做法包括以下幾個(gè)方面。

對蝦性別分化關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)的研究。利用Microwell-seq測序分析和生物信息學(xué)手段分析孵化30～60 d對蝦性腺的差異基因表達(dá)譜，以IAG的表達(dá)時(shí)序?yàn)閰⒖紝ο螅业綄ξr性腺分化的關(guān)鍵起始點(diǎn)，構(gòu)建以IAG沉默為基礎(chǔ)的性別逆轉(zhuǎn)假雌個(gè)體，并與野生型雄性個(gè)體的雜交，研究后代IAG的隨性別變化情況，分析沉默IAG的伴性遺傳特點(diǎn)，確定對蝦性染色體類型及IAG位置，為后期進(jìn)行對蝦單性繁育群組建奠定基礎(chǔ)。

雌雄個(gè)體基因組差異比較。利用對蝦早期性別鑒定，收集鑒定后的雌雄腺體生殖細(xì)胞，構(gòu)建雌雄個(gè)體IAG全基因組結(jié)構(gòu)圖譜，分析雌雄個(gè)體IAG基因調(diào)控關(guān)鍵區(qū)域的甲基化差異，分析甲基化與IAG基因表達(dá)的對應(yīng)關(guān)系，并對IAG基因的全長、5′和3′側(cè)翼序列的差異進(jìn)行比較，獲得雌雄個(gè)體性腺分化的遺傳基礎(chǔ)差異及IAG基因結(jié)構(gòu)差異，形成IAG基因表達(dá)上游調(diào)控通路結(jié)構(gòu)圖。

IAG調(diào)控基因下游網(wǎng)絡(luò)分析。利用干擾技術(shù)收集假雌和真雄個(gè)體雄激素腺體細(xì)胞，開展Microwell-seq測序分析，利用生物信息學(xué)手段篩選干擾雄激素腺體細(xì)胞和野生型雄激素腺體細(xì)胞之間的差異基因表達(dá)譜，預(yù)測差異基因間的靶向調(diào)控關(guān)系，并對其中的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子與差異的甲基化位點(diǎn)進(jìn)行表達(dá)譜分析，繪制IAG與差異轉(zhuǎn)錄因子和差異甲基化位點(diǎn)之間的網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系，并進(jìn)行關(guān)系驗(yàn)證。

利用以上研究，找出最佳的對蝦性腺分化逆轉(zhuǎn)通路，形成凡納濱對蝦的全雌或全雄繁育體系，培育高產(chǎn)的單性繁殖群體或品種，也為其他甲殼類動物全雌或全雄群體構(gòu)建提供理論依據(jù)。