孫耀輝 宋繼權(quán) 柯錦

惡性黑色素瘤是一種由黑色素細胞惡化形成的腫瘤，在所有惡性腫瘤中其發(fā)病率相對較低，但增長速度最快[1]。傳統(tǒng)治療方法包括早期手術(shù)切除、放療及化療，目前靶向治療在抗腫瘤領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用，靶向治療對晚期患者的治療更準確、更有效[2]。研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(microRNA，miRNA)可通過靶向相關(guān)信號通路調(diào)控黑色素瘤的發(fā)生和發(fā)展，為臨床防治惡性黑色素瘤提供新的視角和靶點[3]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-130a-3p在黑色素瘤細胞中下調(diào)表達，其可能參與調(diào)控黑色素瘤細胞上皮-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程[4,5]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducers and activators of transcription，STAT3)在皮膚惡性黑色素瘤中高表達，與腫瘤的細胞生長、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6]。但miR-130a-3p是如何參與調(diào)控黑色素瘤細胞增殖、遷移等生物行為的具體機制目前還不清楚，本文旨在研究miR-130a-3p對惡性黑素瘤細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響及其作用機制是否和STAT3相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料 黑色素瘤細胞A2058、WM239和正常人黑色素細胞HEMn均購自中國科學院上海細胞庫；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Gibico公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；二甲基亞砜(DMSO)、BCA試劑盒、PBS緩沖液購自Sigma公司；Trizol試劑、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；Transwell小室、Matrigel膠購于美國BD公司；CCK-8試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒、RIPA蛋白裂解液、SDS-PAGE試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗體均購自上海煊翎生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):黑色素瘤細胞A2058、WM239和正常人黑色素細胞HEMn使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，每天換液1次，待細胞融和至60%～70%時，加入胰蛋白酶進行消化傳代，選取處于對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染與分組:取常規(guī)培養(yǎng)的黑色素瘤細胞A2058用0.25%胰蛋白酶消化后接種于96孔板中，待細胞生長至80%融合，更換為無血清培養(yǎng)基同步化12 h，隨后進行轉(zhuǎn)染。將miR-NC、miR-130a-3p、anti-miR-NC、anti-miR-130a-3p分別轉(zhuǎn)染至黑色素瘤細胞A2058中，記為miR-NC組、miR-130a-3p組、anti-miR-NC組、anti-miR-130a-3p組；將miR-130a-3p分別與pcDNA3.1和pcDNA3.1-STAT3共同轉(zhuǎn)染至黑色素瘤細胞A2058中，記為miR-130a-3p+pcDNA3.1組和miR-130a-3p+pcDNA3.1-STAT3組，轉(zhuǎn)染均按照LipofectamineTM 2000試劑盒進行操作。

1.2.3 MTT檢測細胞活性:在miR-NC組、miR-130a-3p組、miR-130a-3p+pcDNA3.1組和miR-130a-3p+pcDNA3.1 -STAT3組細胞培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h時加入20 μl(5 g/L)的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h；棄去多余培養(yǎng)基并加入150 μl DMSO振蕩反應(yīng)10 min，酶標儀檢測490 nm處吸光度(OD)值。細胞增殖活力(%)=ODth值/空白對照組OD值×100%。

1.2.4 Transwell檢測細胞遷移和侵襲:收集miR-NC組、miR-130a-3p組、miR-130a-3p+pcDNA3.1組和miR-130a-3p+pcDNA3.1 -STAT3組細胞，用胰酶消化后使用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整濃度為2×104個/ml。細胞遷移實驗：取200 μl 細胞懸液接種于Transwell小室上室中，并置于含完全培養(yǎng)基的下室中，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，取出小室，去除培養(yǎng)基后用棉簽輕輕擦去上層細胞，PBS洗滌，加入4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡觀察并隨機選取6個視野拍照，計算結(jié)晶紫染色細胞數(shù)即為遷移細胞數(shù)。細胞侵襲實驗：以1∶5比例加入RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋Matrigel后，鋪于Transwell小室的上室，室溫下干燥后，按照細胞遷移實驗步驟操作。最后顯微鏡下觀察結(jié)晶紫染色細胞數(shù)即為侵襲細胞數(shù)。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡:用不含EDTA的胰酶消化各組細胞，離心收集各組細胞，PBS漂洗2次，加結(jié)合緩沖液重懸細胞。依據(jù)試劑盒說明書，先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育。流式細胞儀檢測激發(fā)波長488 nm和發(fā)射波長530 nm處的熒光強度。實驗重復(fù)3次。

1.2.6 qRT-PCR檢測miR-130a-3p和STAT3 mRNA表達水平:收集miR-NC組、miR-130a-3p組、miR-130a-3p+pcDNA3.1組和miR-130a-3p+pcDNA3.1 -STAT3組細胞，研磨充分后加入Trizol試劑提取總RNA，微量核酸測定儀檢測RNA純度和濃度。使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照TaKaRa 熒光定量試劑盒使用說明配制反應(yīng)體系，以β-actin為內(nèi)參進行PCR擴增，每個樣品重復(fù)3次，循環(huán)條件為95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環(huán)；60℃延長5 min。相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。

1.2.7 Western blot檢測蛋白表達:收集miR-NC組、miR-130a-3p組、anti-miR-NC組、anti-miR-130a-3p組、miR-130a-3p+ pcDNA3.1組和miR-130a-3p+pcDNA3.1-STAT3組細胞，加入RIPA裂解液進行裂解，4℃，12 000 g離心15 min，收集蛋白上清液，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5 %脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗(1∶2 000)室溫下孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，之后在暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液后晾干，將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達水平。每個蛋白樣品重復(fù)3次。

1.2.8 熒光素酶報告基因檢測實驗檢測miR-130a-3p對STAT3的靶向調(diào)控:TargetScan數(shù)據(jù)庫顯示STAT3 3′UTR區(qū)域有miR-130a-3p結(jié)合位點。構(gòu)建野生型和突變型基因靶點STAT3的3′UTR-熒光素酶表達載體(WT-STAT3和MUT-STAT3)，取對數(shù)生長期黑色素瘤細胞A2058接種于24孔板(5×104個/孔)，待細胞生長至80%融合時，用LipofectamineTM2000將WT-STAT3和MUT-STAT3組細胞分別轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-130a-3p。依據(jù)說明書要求，使用熒光素酶報告基因檢測儀進行雙熒光素酶報告實驗測定。實驗結(jié)果以熒光素酶活性和Renilla活性的比值進行統(tǒng)計分析。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 miR-130a-3p在黑色素瘤細胞A2058、WM239和正常人黑色素細胞HEMn中的表達 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與正常人黑色素細胞HEMn相比，黑色素瘤細胞A2058、WM239中miR-130a-3p的表達水平顯著降低，且A2058細胞中降低更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)。提示miR-130a-3p在黑色素瘤細胞A2058、WM239低表達。見表1。

組別miR-130a-3pHEMn組2.13±0.18A2058組0.86±0.06?WM239組1.37±0.11?F值152.844P值0.000

注：與HEMn組比較，*P< 0.05

2.2 過表達miR-130a-3p對A2058細胞增殖、凋亡的影響 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-130a-3p組A2058細胞中miR-130a-3p的表達水平顯著升高(P< 0.05)。CCK-8法檢測結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-130a-3p后，分別于24 h、48 h、72 h時檢測細胞增殖，與miR-NC組相比，miR-130a-3p組A2058細胞活性顯著降低(P< 0.05)。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，相較于miR-NC組，miR-130a-3p組A2058細胞的凋亡率顯著升高(P< 0.05)。Western Blot檢測結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-130a-3p組A2058細胞中Bcl-2蛋白的表達水平顯著降低，Bax蛋白的表達水平顯著升高(P< 0.05)。提示過表達miR-130a-3p抑制A2058細胞增殖、促進其細胞凋亡。見表2，圖1。

組別miR-130a-3pBax蛋白Bcl-2蛋白細胞活性(OD490 nm)24 h48 h72 h凋亡率(%)miR-NC組 0.82±0.070.31±0.030.62±0.050.43±0.040.77±0.071.36±0.127.89±0.38miR-130a-3p組1.66±0.130.84±0.070.23±0.020.29±0.020.38±0.030.56±0.0421.02±1.46t值13.93617.04717.7407.66812.54415.49221.318P值0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.000

圖1 過表達miR-130a-3p對A2058 細胞凋亡的影響

2.3 過表達miR-130a-3p對A2058細胞遷移、侵襲的影響 Western Blot檢測結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-130a-3p組A2058細胞中MMP-2蛋白的表達水平顯著降低，E-cadherin蛋白的表達水平顯著升高(P< 0.05)。Transwell 法檢測結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-130a-3p組A2058細胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低(P< 0.05)。提示過表達miR-130a-3p抑制A2058細胞的遷移和侵襲。見表3，圖2。

組別E-cadherin蛋白MMP-2蛋白遷移細胞數(shù)侵襲細胞數(shù)miR-NC組 0.23±0.020.83±0.07118.34±6.0893.41±4.31miR-130a-3p組0.57±0.030.34±0.0342.25±3.9633.19±2.66t值23.09915.76025.65729.018P值0.0000.0000.0000.000

圖2 過表達miR-130a-3p對A2058細胞遷移、侵襲的影響(結(jié)晶紫染色×200)

2.4 miR-130a-3p靶向調(diào)控STAT3 通過TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測到STAT3與miR-130a-3p存在結(jié)合位點。熒光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染野生型STAT3基因表達載體WT-STAT3后，相較于miR-NC組，miR-130a-3p組WT-STAT3黑色素瘤細胞的熒光素酶活性顯著降低(P< 0.05)；而轉(zhuǎn)染突變型STAT3基因表達載體MUT-STAT3后，相較于miR-NC組，miR-130a-3p組MUT-STAT3黑色素瘤細胞的熒光素酶活性差異不顯著。qRT-PCR和Western Blot檢測結(jié)果顯示，相較相較于miR-NC組，miR-130a-3p組A2058細胞中STAT3 mRNA和蛋白的表達水平顯著降低；相較于anti-miR-NC組，anti-miR-130a-3p組A2058細胞中STAT3 mRNA和蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05)。提示miR-130a-3p可靶向調(diào)控STAT3的表達。見表4、5，圖3。

組別WT- STAT3MUT- STAT3miR-NC組 1.02±0.081.06±0.09miR-130a-3p組0.28±0.021.11±0.10t值21.9810.910P值0.0000.384

2.5 過表達STAT3能逆轉(zhuǎn)miR-130a-3p對A2058細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響 Western Blot檢測結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-130a-3p組A2058細胞中STAT3、Bcl-2、MMP-2蛋白的表達水平顯著降低，

組別STAT3 mRNASTAT3蛋白miR-NC組 0.66±0.050.68±0.05miR-130a-3p組 0.14±0.01?0.15±0.02?anti-miR-NC組 0.64±0.050.66±0.05anti- miR-130a-3p組1.61±0.12#1.63±0.13#F值464.113410.332P值0.0000.000

注：與miR-NC組比較，*P< 0.05；與anti-miR-NC組比較，#P< 0.05

圖3 miR-130a-3p靶向調(diào)控STAT3

Bax、E-cadherin蛋白的表達水平顯著升高；與miR-130a-3p+pcDNA3.1組相比，miR-130a-3p+pcDNA3.1-STAT3組A2058細胞中STAT3、Bcl-2、MMP-2蛋白的表達水平顯著升高，Bax、E-cadherin蛋白的表達水平顯著降低(P< 0.05)。CCK-8法檢測結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-130a-3p組A2058細胞活性顯著降低；與miR-130a-3p+pcDNA3.1組相比，miR-130a-3p+pcDNA3.1-STAT3組A2058細胞活性顯著升高(P< 0.05)。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-130a-3p組A2058細胞的凋亡率顯著升高；與miR-130a-3p+pcDNA3.1組相比，miR-130a-3p+pcDNA3.1-STAT3組A2058細胞的凋亡率顯著降低(P< 0.05)。Transwell 法檢測結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-130a-3p組A2058細胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低；與miR-130a-3p+pcDNA3.1組相比，miR-130a-3p+pcDNA3.1-STAT3組A2058細胞遷移和侵襲數(shù)量顯著升高(P< 0.05)?？梢姡^表達STAT3能逆轉(zhuǎn)miR-130a-3p對A2058細胞增殖、遷移、侵襲的抑制和凋亡的促進作用。見表6、7，圖4。

組別STAT3蛋白Bax蛋白Bcl-2蛋白細胞活性(OD490 nm)24 h48 h72 h凋亡率(%)miR-NC組 0.68±0.050.31±0.030.62±0.050.43±0.040.77±0.071.36±0.127.89±0.38miR-130a-3p組 0.14±0.02?0.84±0.07?0.23±0.02?0.29±0.02?0.38±0.03?0.56±0.04?21.02±1.46?miR-130a-3p+pcDNA3.1組 0.15±0.020.86±0.080.22±0.020.25±0.020.36±0.020.53±0.0421.59±1.51miR-130a-3p+pcDNA3.1-STAT3組0.44±0.04#0.63±0.06#0.38±0.03#0.35±0.03#0.56±0.05#1.04±0.08#13.62±1.14#F值328.28699.139199.00044.606100.483160.225174.710P值0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.000

注：與miR-NC組比較，*P< 0.05；與miR-130a-3p+pcDNA3.1組比較，#P<0.05

組別E-cadherin蛋白MMP-2蛋白遷移細胞數(shù)侵襲細胞數(shù)miR-NC組0.23±0.020.83±0.07118.34±6.0893.41±4.31miR-130a-3p組0.57±0.03?0.34±0.03?42.25±3.96?33.19±2.66?miR-130a-3p+pcDNA3.1組0.55±0.050.35±0.0340.38±3.1531.23±2.24miR-130a-3p+pcDNA3.1-STAT3組0.41±0.04#0.60±0.05#83.07±5.09#62.46±3.73#F值109.630142.087375.662450.404P值0.0000.0000.0000.000

注：與miR-NC組比較，*P<0.05；與miR-130a-3p+pcDNA3.1組比較，#P<0.05

圖4 過表達STAT3對A2058細胞凋亡、遷移的影響

3 討論

黑色素瘤是較常見的致死率高的惡性腫瘤，其轉(zhuǎn)移早、病情隱匿，早診斷、早治療是其治愈的關(guān)鍵[7]。許多特異性miRNA與惡性黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[8]。研究表明，miR-130a-3p通過抑制BACH2的表達，抑制鼻咽癌細胞的活力、增殖、侵襲和細胞周期，促進鼻咽癌細胞凋亡[9]。miR-130a-3p在肝癌組織中下調(diào)表達，通過調(diào)控靶基因smad 4的表達參與肝癌的發(fā)生發(fā)展[10]。過表達miR-130a-3p/301a-3p通過抑制TNF-α信號傳導(dǎo)可減弱高葡萄糖誘導(dǎo)的MPC5足細胞功能障礙和細胞凋亡[11]。過表達miRNA-130a-3p通過下調(diào)RAB5B抑制乳腺癌干細胞增殖，遷移和侵襲[12]。miR-130a-3p可能通過TGF-β/SMAD信號通路直接靶向TGFBR1和TGFBR2，減弱非酒精性纖維化脂肪性肝炎中肝星狀細胞的活化并誘導(dǎo)其凋亡[13]。而miR-130a-3p在惡性黑素瘤細胞中的作用機制尚不清楚，本研究結(jié)果顯示，miR-130a-3p在黑色素瘤細胞A2058、WM239中下調(diào)表達，過表達miR-130a-3p可抑制A2058細胞增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡，且miR-130a-3p能靶向調(diào)控STAT3的表達。

STAT3既是一種胞質(zhì)信號分子又是胞核轉(zhuǎn)錄因子，參與細胞的增殖、轉(zhuǎn)化及遷移等過程[14]。STAT3是多條致癌信號通路交匯點，在惡性腫瘤組織與細胞中普遍處于異常高活化狀態(tài)，其過表達及磷酸化水平與腫瘤細胞的多種惡性生物學特征、患者不良預(yù)后密切相關(guān)[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，STAT3信號通路的組成性激活可促進細胞增殖、促進組織細胞的癌變，從而參與皮膚惡性黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展[16]。STAT3在惡性黑色素瘤中高表達，其活化水平升高可促進惡性黑色素瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[17]。沉默STAT3能夠明顯抑制黑色素瘤細胞增殖、促進細胞凋亡[18]。沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)可通過抑制TGF-β1/STAT3信號通路來抑制TGF-β1誘導(dǎo)的黑色素細胞B16的EMT過程[19]。下調(diào)IGF-1R基因表達可通過抑制STAT3信號

通路降低黑色素瘤細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡[20]。本研究結(jié)果顯示，過表達STAT3能逆轉(zhuǎn)miR-130a-3p對A2058細胞增殖、遷移、侵襲的抑制和凋亡的促進作用。

綜上所述，miR-130a-3p可抑制惡性黑色素瘤細胞增殖、遷移和侵襲，促進其凋亡，其機制可能與靶向下調(diào)STAT3的表達有關(guān)，將可為惡性黑素瘤的預(yù)防和治療提供新靶點和理論基礎(chǔ)。