陳巖巖 張娜 陳燁 孫文鑫

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年3月至2013年11月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院北院和廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院兒科確診為RSV 毛細(xì)支氣管炎的患兒94例為病例組，經(jīng)臨床癥狀(出現(xiàn)持續(xù)性干咳和發(fā)熱，體溫以中、低度發(fā)熱為常見，發(fā)作喘憋為其特點(diǎn)，病情以喘憋發(fā)生后2～3 d較嚴(yán)重，喘憋發(fā)作時(shí)呼吸明顯增快，可達(dá)60～80次/min，并伴有呼氣延長(zhǎng)和呼氣性喘鳴；重癥患兒明顯表現(xiàn)出鼻煸和“三凹征”(即吸氣時(shí)出現(xiàn)鎖骨上窩，胸骨上窩及上腹部凹陷)，臉色蒼白，口周發(fā)青(或出現(xiàn)紫紺)，實(shí)驗(yàn)室檢查(患兒血清特異性RSV抗體IgM陽(yáng)性)確診，符合《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)(第7版)》毛細(xì)支氣管炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]。同期選擇門診健康體檢患兒88例作為對(duì)照組，患兒無(wú)變應(yīng)性疾病及其他慢性疾病史，家族內(nèi)無(wú)過(guò)敏史及哮喘史，且2周內(nèi)無(wú)呼吸道感染病史及服藥史，無(wú)惡性腫瘤、6周內(nèi)手術(shù)史、下肢外傷史、心功能不全、腦血管意外、長(zhǎng)期臥床史。病例組收縮壓、舒張壓、性別比、年齡的水平與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。該研究的計(jì)劃符合赫爾辛基文件，獲醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，簽署的知情同意書來(lái)自所有自愿參加的患兒家屬。見表1。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①患兒血清RSV-IgM陽(yáng)性；②未感染腺病毒、巨細(xì)胞病毒及肺炎支原體感染。

表1 2組基礎(chǔ)資料比較

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①患兒有先天性心臟病、先天性肺發(fā)育不全、免疫缺陷、過(guò)敏性疾病等疾病史及長(zhǎng)期用藥史；②中樞或周圍神經(jīng)病變；③膽汁淤積、自身免疫性疾?。虎芨蚊干哒呒锤闻K疾病。

1.3 方法

1.3.1 CD44、Th17細(xì)胞水平檢測(cè)：采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。200 μl的抗凝血分別加入10 μl的抗CD44、Th17抗體(規(guī)格1 ml,批號(hào)：5632484、8546241，上海玉博生物科技有限公司)，輕微混勻后，37℃避光靜置30 min，加入PBS洗滌，離心棄上清，加入200 μl紅細(xì)胞裂解液(規(guī)格 50 ml,貨號(hào)：R1010，Solarbio)，PBS洗滌2次，棄上清。流式細(xì)胞儀(型號(hào)：Attune NxT，美國(guó)熱電)檢測(cè)。

1.3.2 外周血單核細(xì)胞miR-21、FOXP3 mRNA水平檢測(cè)：將5 ml靜脈血吸入涂有EDTA的真空管中。 用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，pH值7.4)將血液稀釋2倍。將4 ml稀釋的血液分層到4 ml Ficoll-Hypaque Plus溶液(Amersham Pharmacia Biotech AB，Sweden)上，并在室溫下以2 000 r/min離心20 min。從血漿-Ficoll界面移除外周血單核細(xì)胞并在PBS中洗滌3次以除去血小板，F(xiàn)icoll-Hypaque和血漿。收集的外周血單核細(xì)胞在-80℃下冷凍保存，隨后用于mRNA表達(dá)的定量。使用TRIzol試劑(Takara Bio，Shiga，Japan)根據(jù)制造商的說(shuō)明從外周血單核細(xì)胞分離總RNA，并通過(guò)電泳評(píng)估RNA質(zhì)量。使用Prime Scrip RT試劑盒(Takara Bio，Shiga，Japan)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(RT)。每個(gè)cDNA擴(kuò)增的RT條件是37℃15 min，85℃ 5 s和4℃ 15 s。使用SYBR green作為檢測(cè)染料，通過(guò)定量PCR(qPCR)在StepOnePlusTM實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，Inc，F(xiàn)oster City，CA，USA)上進(jìn)行基因表達(dá)分析。用于檢測(cè)基因的引物序列被設(shè)計(jì)為：miR-21正向引物：5’-ATGACAGACCTCAGACAGA-3’;反向引物：5’-AATGTTGGCAGTGGCTCACG-3’；FOXP3正向引物：5’-ACCACAAGCATCCACCAA-3’；反向引物：5’-GCATTTATCCTTCCTCCCTA-3’;GAPDH用作對(duì)照管家基因,其正向?yàn)橐铮?’-AGCCACCAGATCCGCGTGT-3’;反向引物：5’-TTGAAGTTCTGGATCAGGA-3’。循環(huán)條件為95℃ 30 s和95℃ 5 s，然后在64℃下進(jìn)行40個(gè)循環(huán)34 s。通過(guò)用溴化乙錠染色的2%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)PCR產(chǎn)物的預(yù)測(cè)大小。對(duì)與PCR直接相關(guān)的每個(gè)樣品進(jìn)行熔解曲線分析，以驗(yàn)證擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的純度。結(jié)果表示為每個(gè)靶基因的倍數(shù)表達(dá)與GAPDH作為內(nèi)部對(duì)照的相比樣品，使用2-ΔΔCt方法。所有樣品一式兩份進(jìn)行。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清白介素-4(IL-4)、白介素-8(IL-8)、白介素-10(IL-10)、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)水平：分離血清，與酶標(biāo)儀(Tecan Infinite Pro，瑞士帝肯)上檢測(cè)血清IL-4、IL-8、IL-10、IFN-γ、TNF-α、hs-CRP(規(guī)格96孔，批號(hào)kit635487、kit149654、kit143256、kit654198、kit456298、kit659352，上海邦奕生物)水平。

2 結(jié)果

2.1 2組MIR-21、FOXP3水平比較 病例組MIR-21、FOXP3水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

組別MIR-21FOXP3對(duì)照組(n=88)0.67±0.320.87±017病例組(n=94)3.98±0.43?3.42±0.54?

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.2 2組CD44、IL-4、IL-8、IL-10水平比較 病例組CD44、IL-4、IL-8、IL-10水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

組別CD44(%)IL-4(pg/ml)IL-8(pg/ml)IL-10(pg/ml)對(duì)照組(n=88)82.57±3.868.54±4.325.43±2.345.49±0.92病例組(n=94)92.30±5.33?17.56±3.54?9.65±3.65?10.23±2.23?

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.3 2組IFN-γ、TNF-α、hs-CRP、TH17水平比較 病例組TNF-α、hs-CRP、TH17均高于對(duì)照組，IFN-γ低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

組別IFN-γ(pg/ml)TNF-α(pg/ml)hs-CRP(μmol/L)Th17(%)對(duì)照組(n=88)78.45±2.344.35±2.46328.16±10.152.65±0.54病例組(n=94)46.36±5.40?39.32±5.90?367.12±12.19?3.93±0.78?

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.4 MIR-21、FOXP3與各變量的相關(guān)性分析 MIR-21、FOXP3與CD44、IL-4、IL-8、IL-10、TNF-α、hs-CRP、TH17正相關(guān)關(guān)系明顯，與IFN-γ負(fù)相關(guān)關(guān)系明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 MIR-21、FOXP3與各變量的相關(guān)性分析

2.5 RSV感染毛細(xì)支氣管炎患兒發(fā)生小兒哮喘的多元Logistic回歸分析 對(duì)RSV感染毛細(xì)支氣管炎患兒進(jìn)行5年隨訪，發(fā)生小兒哮喘17例。以RSV感染毛細(xì)支氣管炎患兒是否發(fā)生小兒哮喘為應(yīng)變量(是=1，否=0)，單因素分析有意義的因素為自變量進(jìn)行多因素logistic逐步回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高水平的MIR-21、FOXP3、TH17均為RSV感染毛細(xì)支氣管炎患兒發(fā)生小兒哮喘的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表6。

2.6 ROC曲線及靈敏度、特異度分析 受試者工作特征曲線提示，MIR-21+ FOXP3+ TH17、MIR-21、FOXP3 ROC曲線下面積(AUC)為0.832(95%CI 0.799～0.893)、0.801(95%CI 0.758～0.868)、0.793(95%CI 0.735～0.852)；FOXP3、TH17兩者的AUC相近，均小于MIR-21+ FOXP3+ TH17；TH17、MIR-21診斷RSV感染毛細(xì)支氣管炎的靈敏度、特異度相近(χ2=1.219、1.695，P>0.05)，均小于MIR-21+ FOXP3+ TH17(χ2=16.249、17.023，P<0.05)。見表7。

3 討論

RSV是一種普遍存在的負(fù)義ssRNA病毒，可在感染后引起嚴(yán)重的肺病。 RSV是肺病毒屬的副成員，副

表6 RSV感染毛細(xì)支氣管炎患兒發(fā)生小兒哮喘的多元Logistic回歸分析

表7 ROC曲線及靈敏度、特異度分析

粘病毒科具有非節(jié)段基因組，編碼10個(gè)基因和11種蛋白質(zhì)(NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2-1、M2-2和L)。RSV感染率很高，到2歲時(shí)，大多數(shù)幼兒至少經(jīng)歷過(guò)一次感染。高風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體(如嬰兒、幼兒、免疫功能低下的成人和老年人)的RSV感染可表現(xiàn)為嚴(yán)重的肺部炎癥性疾病，包括細(xì)支氣管炎和肺炎。還有大量證據(jù)表明，早期RSV感染可以介導(dǎo)氣道重構(gòu)，這是一種使個(gè)體易患哮喘發(fā)展和惡化的特征[12,13]。

RSV具有呼吸道上皮細(xì)胞的趨向性，因此人類Ⅱ型肺上皮細(xì)胞(A549)通常用于模擬宿主對(duì)RSV感染的反應(yīng)。 RSV通過(guò)其兩種主要表面蛋白附著于細(xì)胞，附著(G)和融合(F)蛋白，其與細(xì)胞糖胺聚糖結(jié)合。RSVF和G蛋白也與幾種其他細(xì)胞成分結(jié)合，如CX3CR1分子，Toll樣受體4(TLR4)，細(xì)胞間粘附分子1和核仁蛋白[14]。miR-21在響應(yīng)RSV感染的宿主基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)中的作用尚不完全清楚。已知miR-21表達(dá)受多種過(guò)程調(diào)節(jié)，包括TLR4信號(hào)傳導(dǎo)，IRF3活化，IFN刺激的基因轉(zhuǎn)錄物和病毒蛋白質(zhì)如RSV G。 A549細(xì)胞的RSV感染促進(jìn)miR-21的表達(dá)，主要由RSV G誘導(dǎo)。用純化的A549細(xì)胞處理RSV G增強(qiáng)miR-21表達(dá)，這是RSV F治療后未觀察到的特征[15]。重要的是，用抑制劑調(diào)節(jié)miR-21影響RSV復(fù)制，表明RSV調(diào)節(jié)宿主miRNA表達(dá)以影響抗病毒宿主反應(yīng)的結(jié)果，這在很大程度上由RSV G蛋白表達(dá)介導(dǎo)。近期研究表明，miR-21可調(diào)控轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-b以及Kruppel樣因子6(KLF6)的表達(dá)。(TGF)-b在肺上皮細(xì)胞的RSV感染期間高表達(dá)，且它在RSV引起哮喘中起重要作用，TGF-b還調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子對(duì)RSV感染的反應(yīng)和細(xì)胞周期停滯。 Kruppel樣因子6(KLF6)是一種進(jìn)化上保守且普遍表達(dá)的鋅指蛋白，屬于哺乳動(dòng)物Sp1/KLF轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族，是TGF-b所需的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，RSV感染人肺上皮細(xì)胞時(shí)其基因高表達(dá)。FOXP3是RSV誘導(dǎo)表達(dá)的基因之一。研究表明，F(xiàn)OXP3可能是miR-21的靶基因，F(xiàn)OXP3可在RSV感染后通過(guò)miR-21增加的其激活[16]。Toll樣受體(TLR)4是FOXP3調(diào)控的下游炎性因子，其受到RSV F蛋白的刺激。感染RSV的FOXP3沉默小鼠表現(xiàn)出TLR4水平降低，其整體免疫水平也被抑制。研究同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，RSV感染的急性期誘導(dǎo)FOXP3高表達(dá)，而FOXP3可進(jìn)一步促進(jìn)IL-13、TGF-β和IL-6的表達(dá)，增加的IL-13產(chǎn)生刺激其受體IL-13RA1的表達(dá)，其進(jìn)一步放大Th2應(yīng)答，靶基因分析顯示IL-13RA1是FOXP3的靶基因[17-19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病例組MIR-21、FOXP3水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；病例組CD44、IL-4、IL-8、IL-10水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MIR-21、FOXP3與CD44、IL-4、IL-8、IL-10、TNF-α、hs-CRP、TH17正相關(guān)關(guān)系明顯，與IFN-γ負(fù)相關(guān)關(guān)系明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這與上述討論符合，同時(shí)也提示，RSV感染毛細(xì)支氣管炎患兒外周血單核細(xì)胞miR-21、FOXP3水平高表達(dá)，其引發(fā)一系列炎性因子失衡可能是RSV感染毛細(xì)支氣管炎的發(fā)病機(jī)制。

本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，高水平的MIR-21、FOXP3、TH17均為RSV感染毛細(xì)支氣管炎患兒發(fā)生小兒哮喘的危險(xiǎn)因素；結(jié)合ROC曲線分析，MIR-21+ FOXP3+ TH17、MIR-21、FOXP3 ROC曲線下面積(AUC)為0.832 95%CI(0.799～0.893)、0.801(95%CI 0.758～0.868)、0.793(95%CI 0.735～0.852)；FOXP3、TH17兩者的AUC相近，均小于MIR-21+ FOXP3+ TH17；TH17、MIR-21診斷RSV感染毛細(xì)支氣管炎的靈敏度、特異度相近，均小于MIR-21+ FOXP3+ TH17。這說(shuō)明MIR-21+ FOXP3+ TH17診斷RSV感染毛細(xì)支氣管炎具有較高的靈敏度、特異度。

綜上所述，RSV感染毛細(xì)支氣管炎患兒外周血單核細(xì)胞miR-21、FOXP3水平高表達(dá)，引發(fā)一系列炎性因子失衡可能是RSV感染毛細(xì)支氣管炎的發(fā)病機(jī)制；MIR-21+ FOXP3+ TH17診斷RSV感染毛細(xì)支氣管炎具有較高的靈敏度、特異度，值得推廣應(yīng)用。